空心莲子草在制备预防或治疗非洲猪瘟的药物中的用途

技术领域

本发明属于中草药的应用领域，具体涉及一种空心莲子草在制备预防或治疗非洲猪瘟的药物中的用途。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever ASF)是由ASFV引起猪的一种高度致死性的烈性传染病。ASFV是一种有囊膜的单分子双链DNA病毒，病毒呈二十面体对称，病毒结构由外向内依次为外囊膜、衣壳、内囊膜、核壳以及类核。ASFV主要从消化道和呼吸道进入机体，触发黏膜免疫。现有的研究表明，ASFV能够逃逸IFN免疫的机制，主要为天然免疫抗病毒因子的IFN-I，从而入侵机体。ASFV可在不消除病毒和宿主情况下持续存在，即长期适应性，导致其自然宿主能够持续性感染病毒却几乎没有产生临床症状，类似于无症状感染者，以直接接触传播为主，也能通过气溶胶传播给新生仔猪。通过多种机制抑制先天免疫，患猪临床症状取决于病毒和宿主之间复杂的作用，主要表现为出血、高热、淋巴结肿大等，致死率高达100％。

ASF作为猪疾病里的一种烈性传染病，给世界养猪业造成毁灭性的打击。虽然很多学者一直致力于该疫苗的研发，但由于其免疫逃逸等复杂性，目前仍无有效的商品化兽药可用于该病的预防及治疗。非洲猪瘟疫情发生后，一般是采取扑杀和净化等措施，且防控多集中在加强基础饲养管理、构建生物安全体系、及时检疫等。因此，本行业亟需开发出一种有效药物用于ASF预防与治疗。

空心莲子草Alternanthera philoxeroides(Mart.)Griseb.别名水花生、喜旱莲子草和空心苋等。空心莲子草性味甘寒，无毒，具有消热利水、凉血解毒等功能，其被收录于《中国药典》(1977年Ⅰ部)。现有研究发现：空心莲子草制成的各种制剂(合剂、糖浆、滴眼剂等)，可用于治疗多种病毒引起的疾患，取得较好的疗效，提示其可能具有一定的抗病毒作用。但目前，并未发现空心莲子草对非洲猪瘟是否有预防或治疗作用，亟待研究。

发明内容

针对现在缺乏预防或治疗非洲猪瘟的药物的情况，亟需开发一种能够预防或治疗非洲猪瘟的药物。

本发明提供了一种空心莲子草在制备预防或治疗非洲猪瘟的药物中的用途。

具体的，本发明的空心莲子草为空心莲子草提取液。

更具体的，本发明的空心莲子草提取液为空心莲子草乙酸乙酯提取液。

更具体的，本发明的空心莲子草乙酸乙酯提取液的制备方法包括以下步骤：空心莲子草中加入乙醇，加热回流提取，得到滤液；滤液中加水，加热回流后得滤液，减压浓缩至无乙醇味，再加纯水，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，减压浓缩，蒸干溶剂，得到空心莲子草乙酸乙酯提取液。

进一步的，上述空心莲子草乙酸乙酯提取液的制备方法中，每次加热回流或萃取都重复操作2-3遍。

其中，上述空心莲子草乙酸乙酯提取液的制备方法中，加热回流的时间为2-3h。

其中，上述空心莲子草乙酸乙酯提取液的制备方法中，每100g空心莲子草干燥粉末加入70％乙醇800ml。

进一步的，本发明的空心莲子草乙酸乙酯提取液的制备方法为：准确称取100g空心莲子草干燥粉末，加入70％乙醇800ml，加热回流提取2h，重复上述操作3次，将得到的滤液合并过滤后，抽滤，得到滤液；将滤液与残渣再加800ml水加热回流2h，重复2次后过滤，抽滤后的滤液合并；减压浓缩至无醇味，再加纯水至500ml，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，减压浓缩，蒸干溶剂，得乙酸乙酯提取物浸膏，密封，避光，4℃下保存备用。

具体的，本发明所述的药物通过降解ASFV病毒的核酸起作用。

本发明还提供了一种预防或治疗非洲猪瘟的药物。

具体的，所述的药物由空心莲子草制备而成。

本发明的有益效果为：

本发明首次发现空心莲子草的提取物对降解ASFV病毒的核酸有作用，因而推测空心莲子草可能对于预防或治疗非洲猪瘟有一定作用。基于此，本发明又筛选了空心莲子草的多种提取物，发现空心莲子草的乙酸乙酯提取液能够降解ASFV病毒的核酸，能够用于制备预防或治疗非洲猪瘟的药物。本发明为开发预防或治疗非洲猪瘟的药物提供了基础理论研究，为以后开发出预防或治疗非洲猪瘟的药物提供了依据。

附图说明

图1所示为Cytoscape软件做出的药物-化合物-靶点图；其中，最外圈代表靶点，中间代表化合物，最内圈代表药物。

图2所示为空心莲子草与非洲猪瘟病毒的相关性。

具体实施方式

本发明利用网络药理学预测空心莲子草能够治疗ASFV感染的物质基础，联系大肠杆菌、沙门氏菌预测空心莲子草的抑菌基础；再通过筛选空心莲子草有效部位并进行的活性物质的提取，应用PCR荧光测定确定空心莲子草提取物对ASFV的核酸降解效果；再通过体外抑菌实验测试空心莲子草的抑菌效果，为下一步空心莲子草的开发利用和筛选ASF药物研究提供依据。

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

实施例1基于网络药理学寻找空心莲子草可能的抗病毒成分的筛选

(1)实验对接数据库

化学结构数据库：Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)；

化合物分析数据库：SwissADME(http://www.swissadme.ch/)；

基因互作预测数据库：Draw Venn Diagram

(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)；

分子对接数据库：SwissTargetPrediction

(http://www.swisstargetprediction.ch/)；

疾病数据库：Genecards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://omim.org/)、Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)。

(2)经检索发现，空心莲子草化学成分有56个，利用Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)网站画出化学结构，获得以上药物的sdf格式文件，并将其导入SwissADME(http://www.swissadme.ch/)进行预测，采用两条规则，即一是设定肠胃吸收(gatrointestinal absortion；GIabsortion)为"High"的结果，将其用作筛选具有更好的口服生物利用度的活性化合物的条件；二是类药5原则，设定5种类药性预测(Ghose、MueggeVeber、Egan、Lipinski)，结果中有两个及两个以上为“Yes”的化合物，即可作为活性化合物，共7个化合物。确定可以成为的活性成分后，将其sdf格式导入SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)，得到活性化合物相关的靶点，合并去重后，得到目标组Ⅰ，如表1所示。

表1 空心莲子草关键靶点(134个)

利用Cytoscape软件，作出药物-化合物-靶点图，如图1所示。

非洲猪瘟为寻找其靶点，以使用“ASFV”，作为关键词查询Genecards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://omim.org/)和Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)，下载相关靶点，合并、去重，得到目标组Ⅱ。

利用Draw Venn Diagram(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)将目标组Ⅰ分别与目标组Ⅱ做交集，判断相关度，结果如图2。

综合分析材料的相关性，最后发现ASFV与空心莲子草的靶点具有很高的重合度，表明空心莲子草能够对ASFV起到抑制作用，因此，选择空心莲子草作为实验材料继续进行实验。

实施例2空心莲子草不同部位的提取分离与实验药物的准备

空心莲子草晒干，打粉，备用。

(1)制备空心莲子草水提液

利用分析天平称取100g空心莲子草粉末，加入纯水800ml，将粉末与水完全混溶后，放置电热套里，进行加热回流，2h后，将药液倒出，再加入纯水800ml，重复操作，合并滤液，抽滤。将得到的滤液先减压蒸馏，浓缩至20ml，再进行冷冻干燥，得到水提空心莲子草粉末，避光，4℃下保存备用。

(2)制备空心莲子草有机溶剂提取液

精密称取100g空心莲子草干燥粉末，加入70％乙醇800ml，加热回流提取2h，充分上述操作3次，将得到的滤液合并过滤后，抽滤，得到滤液。将滤液分等分，一份减压干燥，浓缩至20ml，再冷冻干燥得到乙醇提取物浸膏；另一份，与残渣再加800ml水加热回流2h，重复2次后过滤，抽滤后的滤液合并。减压浓缩至无醇味，再加纯水至500ml，然后，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别合并萃取液，减压浓缩，蒸干溶剂，得石油醚提取物浸膏、乙酸乙酯提取物浸膏、正丁醇提取物浸膏，密封，避光，4℃下保存备用。

(3)空心莲子草不同部位提取物降解ASFV核酸

配制DMSO(<0.5％)的稀释液进行溶解，将各提取物进行最大溶解，即加入提取物后有药物析出，记为1倍稀释，对最大溶解度进行2倍、4倍、10倍、20倍稀释。配制芹菜素(非洲猪瘟对照品)进行最大溶解度20mg/ml，以及最高抑制非洲猪瘟病毒浓度20ul/ml。配制好的药液均避光，4℃下保存备用。

被检样品Fam通道Ct值≤38，且有典型的S型扩增曲线，为非洲猪瘟病毒核酸阳性；被检样品38

将配制好的液体与非洲猪瘟核酸阳性样品1：1(500ul:500ul)混匀，25℃室温静置12hour，同时设置DMSO(<0.5％)为空白对照，病毒核酸为阳性对照，药品作用终止后，提取核酸，利用实时荧光定量PCR方法测定Ct值。

实验结果如表2、3、4所示。

表2ASFV核酸降解CT值

表3ASFV核酸降解CT值

表4ASFV核酸降解CT值

结果表明，稀释剂DMSO对降解ASFV几乎没有影响，空白对照里不含核酸，均为阴性，说明结果可信。对比阳性对照，提取物对ASFV均具有一定的降解作用，但效果不明显。阳性对照CT值为21.63的组别中，水提1倍、4倍稀释浓度；乙醇提4倍稀释浓度；正丁醇提1倍浓度；石油醚提1倍、2倍稀释浓度；乙酸乙酯提20倍稀释；降解效果略为好点，但并没有完全降解ASFV的核酸，使之变成阴性。阳性对照CT值为26.99中，水提2倍；乙醇提2倍稀释浓度；正丁醇提4倍、10倍稀释浓度；石油醚提2倍稀释浓度；降解效果略为好点，乙酸乙酯提1倍、2倍稀释浓度，降解效果最佳。阳性对照CT值为28.09中，乙酸乙酯提降解效果最佳。综上，空心莲子草的乙酸乙酯提部位对降解ASFV效果最佳。

本发明研究发现，空心莲子草能够降解ASFV病毒的核酸，能够用于制备预防或治疗ASFV的药物，为后续治疗药物的筛选提供了理论基础，具有重要的意义。