用于检测多种呼吸道病毒的组合物的应用方法及试剂盒

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种用于检测多种呼吸道病毒的组合物及其试剂盒和应用。

背景技术

呼吸道病毒习惯上是指侵害呼吸道的病毒，至少涉及到8个科、200多种亚型，其中主要包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、人副流感病毒Ⅰ型、人副流感病毒Ⅱ型、人副流感病毒Ⅲ型、人腺病毒、人呼吸道合胞病毒、人冠状病毒229E组等。此外，肺炎支原体及肺炎衣原体也是常见的呼吸道感染病原体。不同的病原体导致的呼吸道感染预后差异较大，有的治疗措施完全不同。因此，早期精准诊断是降低死亡率、减少并发症的关键，快速的精准诊断是及时控制感染扩散的基础。

多重荧光定量PCR是在实时荧光定量PCR技术基础上发展出的多重联检技术，在同一个反应管中实现多个靶基因序列的特异性扩增和检测。在临床病原体检测应用方面，可以同时检测同一标本内几十种甚至上百种相关病原体，利于精确判断病情，实现疾病的早期、快速和精准治疗。但是，目前尚无引起呼吸道感染的8种病原体(病毒+支原体/衣原体)联检技术，本发明将是市面上最全面的呼吸道感染病原体联检产品。

现有的病原体检测技术在检测呼吸道疾病检测方面存在一些缺陷和问题。

首先，传统的病原体检测方法如细菌培养、免疫学检测等耗时较长，而且可能存在假阴性或假阳性情况，影响诊断的准确性。

其次，单一荧光定量PCR技术只能检测单一病原体，对于混合感染或不同病原体引起的相似症候群的鉴别诊断存在局限性。而多重荧光定量PCR虽然能够同时检测多个病原体，但是需要设计和优化多个引物和探针，而且在实验操作上也存在一定的技术难度。

此外，目前的病原体检测技术主要是针对已知的病原体进行检测，对于新发病原体的诊断可能存在一定的滞后性。

因此，针对以上问题，需要进一步发展出更加准确、快速、灵敏的病原体检测技术，同时要加强对新发病原体的研究和监测。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于检测多种呼吸道病毒的组合物及其试剂盒和应用。

本发明是这样实现的，一种用于检测多种呼吸道病毒的组合物的应用方法，包括：

选择荧光报告基团：为了在同一反应体系中检测多种病毒，为每种病毒的探针选择不同的荧光报告基团；所选荧光报告基团互不相同且彼此互不干扰，以确保检测准确性；

内标监控：设计用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针；内标的引入有助于实时监测PCR反应的过程，确保数据的准确性和可靠性；

制备试剂盒：根据所设计的引物、探针和荧光报告基团，制备用于检测多种呼吸道病毒的试剂盒；试剂盒应包含所有必要的试剂，以便用户进行检测；

实验操作：收集患者的呼吸道样本，提取其中的病毒核酸，然后使用所提供的试剂盒进行实时荧光RT-PCR检测；在反应过程中，实时监测荧光信号，以便于分析样本中病毒的存在和载量；

数据分析与诊断：根据实时荧光RT-PCR检测得到的荧光信号强度，分析样本中病毒的含量；根据检测结果，为临床诊断提供依据。

进一步，设计特异性引物和探针：

通过查阅相关文献和数据库，确定各种呼吸道病毒的保守基因序列；

使用生物信息学工具设计针对这些保守基因的特异性引物和探针序列；引物和探针的设计应尽量避免二聚体、自身互补不良结构，以提高扩增效率。

进一步，选择荧光报告基团实现方法为：为每种病毒的探针选择具有不同发射波长的荧光报告基团；确保所选荧光报告基团互不相同且彼此互不干扰，以便在同一反应体系中进行检测；

内标监控实现方法为：设计一个参照基因作为内标，以监控PCR反应的过程；

为内标参照基因设计一组引物和探针，并引入一个与其他病毒探针荧光报告基团不同的荧光报告基团。

进一步，制备试剂盒实现方法为：

根据所设计的引物、探针和荧光报告基团，制备用于检测多种呼吸道病毒的试剂盒；试剂盒中应包含实时荧光RT-PCR所需的所有必要试剂，如核酸提取试剂、逆转录酶、PCR酶、dNTPs、缓冲液；

实验操作实现方法为：从患者收集的呼吸道样本中提取病毒核酸；

使用试剂盒进行实时荧光RT-PCR检测；将提取的核酸模板、引物、探针和其他必要试剂按照比例混合，然后进行逆转录和PCR扩增；在反应过程中，荧光信号将实时监测，以便于分析样本中病毒的存在和载量。

进一步，数据分析与诊断实现方法为：根据实时荧光RT-PCR检测得到的荧光信号强度，计算各种病毒的相对含量。结合患者的临床症状和实验结果，进行综合诊断。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测多种呼吸道病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的用于检测多种呼吸道病毒的组合物。

进一步，所述试剂盒的反应体系包括：50～500nM的PCR引物、50～250nM的探针；

所述试剂盒的反应程序包括：37℃消化2min，95℃预变性5min；95℃变性10s，55-65℃退火及延伸30s，收集荧光，35-55个循环；

所述试剂盒可特异性检测鉴定甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、新型冠状病毒2019-nCoV。

本发明另一目的在于提供一种用于检测多种呼吸道病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1-5中任一项所述的用于检测多种呼吸道病毒的组合物。

进一步，所述试剂盒的反应体系包括：50～500nM的PCR引物、50～250nM的探针。

进一步，所述试剂盒的反应程序包括：37℃消化2min，95℃预变性5min；95℃变性10s，55-65℃退火及延伸30s，收集荧光，35-55个循环。

进一步，所述试剂盒可特异性检测鉴定，甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、新型冠状病毒2019-nCoV。

本发明另一目的在于提供一种所述的用于检测多种呼吸道病毒的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1：样品的采集；

S2：样品RNA/DNA的提取；

S3：对样品RNA/DNA进行RT-PCR扩增，RT-PCR扩增程序为：50℃30min，94℃3min；94℃40s，55℃45s，72℃30s，共35个循环；72℃3min；

S4：RT-PCR扩增产物的检测，将RT-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察结果。

进一步，所述将RT-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，具体包括制胶、电泳、检测步骤。

进一步，所述制胶过程如下，准备好胶模，凝胶托盘的规格25×20cm，等距离平行插四排梳子，称取7.5g琼脂糖粉末至500ml的三角锥瓶中，加入250ml0.5×TBE电泳缓冲溶液中，摇匀，在微波炉中加热至琼脂糖完全熔化成为溶胶，冷却至60℃以下，再在瓶中加入50μl终浓度为0.5μg/ml的EB，充分混匀，将溶胶倒入胶模，凝固后即成为凝胶；

所述电泳过程如下，小心拔出插在凝胶中的梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲溶液至液面覆盖凝胶1-2mm，用移液排枪吸取4.5μl的含上样缓冲液的RT-PCR扩增产物小心加入梳子孔，待所有样品上完样后，接通电源，调节电压至4-5V/cm，核酸分子从负极移到正极，待上样缓冲液跑到合适位置时，停止电泳，约需45-60min；

所述检测过程如下，将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于凝胶自动成像系统的平台中间，打开紫外光，可见到发出荧光的DNA条带，在电脑中观察并保存图像。

结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

第一，本发明可快速检测鉴定呼吸道感染的病毒，检测鉴定6种人呼吸道感染病毒的同时检测鉴定2种可能导致“人畜共患”的猪呼吸道感染病毒，有效区分呼吸道感染的病毒类型，同时也对可能导致“人畜共患”的呼吸道感染做出防范。本发明具有多重基因检测：建立多重基因甲基化检测位点联检，减少试剂消耗，降低耗材成本，同时减少实验人员的操作步骤，减少劳动成本。

本发明克服了国内实验室现行的琼脂糖凝胶电泳方法中存在着试剂药品的过度浪费、染色剂对人体的危害、以及凝胶和电泳缓冲液的废弃物对环境产生极大污染的缺点，大大提高了琼脂糖凝胶和电泳缓冲液的利用效率，节约了人力和成本。分析不同标记时不需重新制备凝胶，一块胶至少可重复利用10次，进行10个以上标记的检测，仅需4元左右的琼脂糖粉，而常规检测需花费40元以上，节省了10倍以上的成本；通过对凝胶的洗涤和染胶，避免了在多次重复利用凝胶时样品间的交叉污染及EB浓度的降低导致成像模糊不清。经过洗涤和染色过的凝胶，电泳条带清晰，分辨率高，重复性好。

第二，本发明的用于检测多种呼吸道病毒的组合物及其应用方法还具有以下优点和积极效果：

1)高灵敏度和高特异性：通过针对各病毒保守基因序列设计特异性引物和探针，可以使检测具有很高的灵敏度和特异性，有效避免假阳性和假阴性结果。

2)同时检测多种病毒：本方案可以在同一反应体系中同时检测多种呼吸道病毒，节省实验时间和成本，提高检测效率。

3)减少荧光信号干扰：通过选择不同的荧光报告基团，避免了荧光信号之间的相互干扰，确保各病毒检测结果的准确性。

4)内标监控确保准确性：引入内标，实时监测PCR反应过程，确保数据的准确性和可靠性，提高检测结果的信度。

5)方便操作和现场应用：试剂盒包含所有必要的试剂，便于用户进行检测，方便现场应用和推广。

6)助力临床诊断：根据检测结果，可以为临床诊断提供依据，有助于及时发现病毒感染，降低传播风险。

7)适应性强：本方案可以针对不同呼吸道病毒进行调整和优化，具有很强的适应性和拓展性。

综上所述，上述方案提供了一种快速、准确、高效的多种呼吸道病毒检测方法，具有很高的实用价值和广泛的应用前景。

第三，对于上述的权利要求，解释每个要求带来的显著的技术进步：

1.综合方法用于检测多种呼吸道病毒：这种方法利用多种荧光报告基团在同一反应体系中检测多种病毒，能够在短时间内、同时检测多种病毒，提高检测效率。

技术进步：与传统的单一检测相比，实时监测多种病毒，缩短了检测时间，提高了效率。

2.设计特异性引物和探针：针对不同的病毒采用特异性的引物和探针，增加检测的准确性。

技术进步：减少了假阳性和假阴性的风险，提高了检测的特异性和准确性。

3.选择荧光报告基团和内标监控方法：确保每个病毒的探针有其特定的荧光标记，并使用内标实时监控PCR反应的进程。

技术进步：保证了多种病毒在同一体系中的准确分辨，同时提供了PCR反应质量的实时反馈。

4.试剂盒制备方法：为用户提供了一个一站式解决方案，包括所有必要的试剂。

技术进步：简化了用户的实验流程，降低了用户在实验过程中犯错误的可能性。

5.数据分析与诊断方法：利用荧光强度进行定量分析，并结合临床症状进行综合诊断。

技术进步：实现了对病毒载量的量化。

6.用于检测的试剂盒：提供了一个完整的、基于前述技术要求的检测系统。

技术进步：进一步方便了用户，降低了因多个组分来源不一致导致的潜在问题。

7.具体的试剂盒配置和反应程序：提供了详细的试剂浓度和反应条件，确保实验的一致性。

技术进步：提供了标准化的操作流程，确保每次实验的可重复性。

8.试剂盒的使用方法：从样本采集到数据分析提供了一个详细的流程。

技术进步：指导用户从头到尾进行操作，减少了操作失误的可能性。

9.琼脂糖凝胶电泳检测方法：为用户提供了一个简单而又传统的方式来验证RT-PCR的结果。

技术进步：增加了检测的可靠性，允许用户直观地验证实验结果。

10.凝胶制备和电泳的详细流程：为用户提供了详细的实验步骤，确保每一步都按照既定的标准进行。

技术进步：确保了每一次实验的质量和可重复性，降低了因操作不当导致的潜在错误。

总之，上述权利要求提供了一个全面、系统的多种呼吸道病毒检测方法和相关试剂盒，每一个要求都带来了显著的技术进步，确保了检测的高效、准确和可靠。

附图说明

图1是本发明实施例提供的用于检测多种呼吸道病毒的试剂盒的使用方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术的缺陷和问题，本发明实施例通过以下途径来优化多重荧光定量PCR技术，以实现呼吸道感染的8种病原体(病毒+支原体/衣原体)的检测：

1)优化引物和探针设计：针对8种病原体的关键基因，设计一组高度特异性的引物和探针。可以使用生物信息学工具来筛选保守区域，并确保所选区域在不同病原体之间具有显著差异。这将有助于提高检测的准确性和特异性。

2)扩展荧光报告基团选择：由于需检测的病原体数量较多，需要选择更多种荧光报告基团以区分不同病原体。可以尝试使用多重荧光定量PCR技术，如同一探针上使用多个荧光标记，以提高检测通道的数量。

3)优化反应条件：在同一反应体系中检测多种病原体可能导致反应条件不适合某些病原体。可以通过对比实验来优化反应条件，确保各病原体的扩增效率都能达到理想水平。

4)增加内标：引入多个内标，如参照基因或外加质控模板，以监控PCR反应的过程，确保数据的准确性和可靠性。

5)优化数据分析方法：针对多重荧光定量PCR数据，开发适用的数据分析方法，如自动阈值设置、相对定量分析等，以提高检测结果的准确性和可靠性。

6)验证和优化试剂盒：对新开发的试剂盒进行大量验证实验，评估其灵敏度、特异性、重复性等性能指标。根据实验结果，对试剂盒进行进一步优化，以满足市场需求。

通过上述优化措施，可以提高多重荧光定量PCR技术在呼吸道感染8种病原体检测方面的性能，使其成为市场上最全面的病毒性呼吸道感染病原体检测产品。这将有助于实现疾病的早期、快速、精准治疗，降低死亡率，减少并发症。

本发明实施例提供的同时检测多种呼吸道病毒的组合物及其试剂盒和应用，具体实现可以遵循以下步骤：

1)设计特异性引物和探针：针对不同呼吸道病毒的特定基因区域，设计一组特异性的引物和探针序列。这些序列应具有高度的特异性，以确保仅针对目标病毒进行扩增和检测。

2)选择荧光报告基团：为了在同一反应体系中检测多种病毒，为每种病毒的探针选择不同的荧光报告基团。所选荧光报告基团应互不相同且彼此互不干扰，以确保检测准确性。

3)内标监控：设计用于监控的内标引物和探针。内标的引入有助于实时监测PCR反应的过程，确保数据的准确性和可靠性。

4)制备试剂盒：根据所设计的引物、探针和荧光报告基团，制备用于检测多种呼吸道病毒的试剂盒。试剂盒应包含所有必要的试剂，如缓冲液、酶、核酸模板等，以便用户进行检测。

5)实验操作：收集患者的呼吸道样本(如咽拭子、鼻拭子等)，提取其中的病毒核酸，然后使用所提供的试剂盒进行实时荧光RT-PCR检测。在反应过程中，荧光信号将实时监测，以便于分析样本中病毒的存在和数量。

6)数据分析与诊断：根据实时荧光RT-PCR检测得到的荧光信号强度，分析样本中病毒的含量。根据检测结果，为临床诊断提供依据。

通过以上步骤，可以实现这种能同时检测多种呼吸道病毒的组合物及其试剂盒和应用。这将有助于提高呼吸道病毒检测的效率和准确性，为临床诊断提供有力支持。

为了进一步细化和优化上述技术方案，将其拆分为以下具体步骤：

1)设计特异性引物和探针：通过查阅相关文献和数据库，确定各种呼吸道病毒的保守基因序列。

使用生物信息学工具(如Primer3、BLAST等)设计针对这些保守基因的特异性引物和探针序列。引物和探针的设计应尽量避免二聚体、自身互补等不良结构，以提高扩增效率。

2)选择荧光报告基团：为每种病毒的探针选择具有不同发射波长的荧光报告基团(如FAM、HEX、ROX等)。确保所选荧光报告基团彼此互不相同且互不干扰，以便在同一反应体系中进行检测。

3)内标监控：

设计一个参照基因(如GAPDH、β-actin等)作为内标，以监控PCR反应的过程。

为内标参照基因设计一组引物和探针，并引入一个与其他病毒探针荧光报告基团不同的荧光报告基团。

4)制备试剂盒：

根据所设计的引物、探针和荧光报告基团，制备用于检测多种呼吸道病毒的试剂盒。

试剂盒中应包含实时荧光RT-PCR所需的所有必要试剂，如核酸提取试剂、逆转录酶、PCR酶、dNTPs、缓冲液等。

5)实验操作：

从患者收集的呼吸道样本(如咽拭子、鼻拭子等)中提取病毒核酸。使用试剂盒进行实时荧光RT-PCR检测。将提取的核酸模板、引物、探针和其他必要试剂按照比例混合，然后进行逆转录和PCR扩增。

在反应过程中，荧光信号将实时监测，以便于分析样本中病毒的存在和数量。

6)数据分析与诊断：根据实时荧光RT-PCR检测得到的荧光信号强度，计算各种病毒的相对含量。结合患者的临床症状和实验结果，进行综合诊断。将检测数据上报给相关部门。通过遵循以上细化的技术方案，可以实现这种能同时检测多种呼吸道病毒的组合物及其试剂盒和应用。这将有助于提高呼吸道病毒检测的效率和准确性，为临床诊断提供有力支持。

如图1所示，本发明实施例提供的所述的用于检测多种呼吸道病毒的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1：样品的采集；

S2：样品RNA/DNA的提取；

S3：对样品RNA/DNA进行RT-PCR扩增，RT-PCR扩增程序为：50℃30min，94℃3min；94℃40s，55℃45s，72℃30s，共35个循环；72℃3min；

S4：RT-PCR扩增产物的检测，将RT-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察结果。

进一步，所述将RT-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，具体包括制胶、电泳、检测步骤。

进一步，所述制胶过程如下，准备好胶模，凝胶托盘的规格25×20cm，等距离平行插四排梳子，称取7.5g琼脂糖粉末至500ml的三角锥瓶中，加入250ml0.5×TBE电泳缓冲溶液中，摇匀，在微波炉中加热至琼脂糖完全熔化成为溶胶，冷却至60℃以下，再在瓶中加入50μl终浓度为0.5μg/ml的EB，充分混匀，将溶胶倒入胶模，凝固后即成为凝胶；

所述电泳过程如下，小心拔出插在凝胶中的梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲溶液至液面覆盖凝胶1-2mm，用移液排枪吸取4.5μl的含上样缓冲液的RT-PCR扩增产物小心加入梳子孔，待所有样品上完样后，接通电源，调节电压至4-5V/cm，核酸分子从负极移到正极，待上样缓冲液跑到合适位置时，停止电泳，约需45-60min；

所述检测过程如下，将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于凝胶自动成像系统的平台中间，打开紫外光，可见到发出荧光的DNA条带，在电脑中观察并保存图像。

实施例1：

本实施例用于检测流感病毒A型(H1N1)、流感病毒B型和新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。

1)选择荧光报告基团：选择FAM、HEX和Cy5作为三种病毒的荧光报告基团。

2)设计引物和探针：根据各病毒的保守基因序列，分别设计特异性引物和探针序列：

流感病毒A型(H1N1)：针对M1基因设计引物和探针；

流感病毒B型：针对NS1基因设计引物和探针；

SARS-CoV-2：针对N基因设计引物和探针。

3)制备试剂盒：将所设计的引物、探针和荧光报告基团制备成用于检测这三种呼吸道病毒的试剂盒。

4)实验操作：收集患者呼吸道样本，提取病毒核酸，使用试剂盒进行实时荧光RT-PCR检测。

5)数据分析与诊断：根据实时荧光RT-PCR检测结果，分析样本中是否存在这三种病毒及其含量。

实施例2：

本实施例用于检测呼吸道合胞病毒(RSV)、人腺病毒(AdV)和人冠状病毒OC43。

1)选择荧光报告基团：选择FAM、HEX和Cy5作为三种病毒的荧光报告基团。

2)设计引物和探针：根据各病毒的保守基因序列，分别设计特异性引物和探针序列：

呼吸道合胞病毒(RSV)：针对N基因设计引物和探针；

人腺病毒(AdV)：针对Hexon基因设计引物和探针；

人冠状病毒OC43：针对N基因设计引物和探针。

3)制备试剂盒：将所设计的引物、探针和荧光报告基团制备成用于检测这三种呼吸道病毒的试剂盒。

4)实验操作：收集患者呼吸道样本，提取病毒核酸，使用试剂盒进行实时荧光RT-PCR检测。

5)数据分析与诊断：根据实时荧光RT-PCR检测结果，分析样本中是否存在这三种病毒及其含量。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。