恩贝酸在制备抗圣路易斯脑炎病毒感染药物中的应用

技术领域

本发明属于抗圣路易斯脑炎药学技术领域，尤其是涉及恩贝酸在制备抗圣路易斯脑炎病毒感染药物中的应用。

背景技术

圣路易斯脑炎病毒(Saint Louis encephalitis virus，SLEV)是引起圣路易斯脑炎的致病性病毒，主要通过蚊虫和禽类传播，能够引起发烧、头痛、咽喉痛、肌肉痛感等症状。多数患者表现为发烧、头痛、咽喉痛，一些患者出现严重的脑炎症状，严重者可出现昏迷，一些患者会有后遗症，其中，高龄是致死的重要因素之一，致死率随着年龄的增大而递增。

圣路易斯脑炎病毒(Saint Louis encephalitis virus，SLEV)是一种正链的RNA病毒，1933年在美国被首次发现。圣路易斯脑炎病毒粒直径大小为45nm左右，病毒粒表面有凸起的囊膜和凝集的核心，可在pH 6.0-7.9的条件下凝集家禽的红细胞。该病毒主流行于北美洲和南美洲，在美国中西部和东南部的大部分地区，这种病毒在夏末秋初主要由蚊虫传播，每年都会引起公众的健康关注。圣路易斯脑炎病毒的流行与温度及降水量有关。圣路易斯脑炎病毒能够侵袭人中枢神经系统，引发急性脑炎发热。1975年-1979年，圣路易斯脑炎病毒感染者超过2500人，后来每10年左右有一次爆发，每一次爆发使得很多人容易被感染患病。高龄的老人最容易被感染患病，脑炎是圣路易斯脑炎比较严重的一种状况，致死率已达20％。近年来，随着气候变暖、人口快速增长与流动，该病毒对全人类的生命和健康构成巨大的威胁，所以，我们需要寻找圣路易斯脑炎病毒中的药物靶点，进而针对这些靶点开发抗圣路易斯脑炎病毒的药物。

圣路易斯脑炎病毒是一种基因组长11kb左右的单链的RNA病毒，共编码三个结构蛋白分别为核心壳蛋白、膜蛋白和包膜蛋白，七个非结构蛋白分别为NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。NS3在圣路易斯脑炎病毒的复制以及圣路易斯脑炎病毒与宿主的相互作用中发挥着十分重要的角色，而且具有RNA解旋酶活性、核苷三磷酸酶活性和丝氨酸蛋白酶活性，主要负责RNA的自我复制以及对病毒的多聚蛋白进行切割和修饰。NS3的N端前180个氨基酸具有丝氨酸蛋白酶的保守结构域，但作为辅因子的NS2B的中央亲水结构域是NS3发挥催化活性不可缺少的部分。因此，NS2B-NS3蛋白酶是一个非常重要的抗圣路易斯脑炎病毒的药物靶点，所以针对NS2B-NS3蛋白酶进行抑制剂筛选对圣路易斯脑炎病毒感染的相关的药物研发具有很大的意义。

恩贝酸，英文名是Embelin，从日本紫金牛草中分离得到，是一种X-连锁凋亡抑制因子的抑制剂。但迄今为止，恩贝酸在抗圣路易斯脑炎病毒感染中的应用未见有报道。

发明内容

本发明的第一目的是：提供恩贝酸在制备抗圣路易斯脑炎病毒感染药物中的应用，可以作为圣路易斯脑炎病毒中NS2B-NS3蛋白酶的小分子抑制剂在分子水平上，通过设立对照实验，发现恩贝酸对圣路易斯脑炎病毒中的NS2B-NS3蛋白酶有较强的抑制效果，因此恩贝酸可以作为抑制圣路易斯脑炎病毒感染的潜在药物。

本发明的另一目的是：提供一种治疗圣路易斯脑炎病毒感染的药物。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：所述恩贝酸为圣路易斯脑炎病毒中NS2B-NS3蛋白酶的小分子抑制剂。

优选地，所述恩贝酸的结构式为：

一种治疗圣路易斯脑炎病毒感染的药物，其包含恩贝酸以及一种或多种药学上可接受的载体。

优选地，所述载体包括表面活性剂、粘合剂、崩解剂、稀释剂、赋形剂、吸收促进剂、湿润剂、吸附载体、润滑剂、填充剂以及增效剂中的一种或几种。

优选地，药物的制剂为颗粒剂、散剂、糖浆剂、片剂、丸剂或栓剂。

根据上述技术方案，恩贝酸对圣路易斯脑炎病毒中的NS2B-NS3蛋白酶具有较好的抑制活性，得出恩贝酸可以作为圣路易斯脑炎病毒中的NS2B-NS3蛋白酶的小分子抑制剂，进而能够研发潜在药物，通过新的途径治疗圣路易斯脑炎病毒感染。

附图说明

图1是本发明实施例恩贝酸对圣路易斯脑炎病毒中的NS2B-NS3蛋白酶的抑制作用示意图

图2是本发明实施例恩贝酸对圣路易斯脑炎病毒中的NS2B-NS3蛋白酶的IC

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明：

除非另有定义，下文中所使用的的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的的专业术语只是为了描述具体实施例和对比例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。应当特殊说明的是对于同一种有机物结构可能有多种名称，只要其结构在本专利范围内都属于本专利的保护对象。

除非另有定义，以下实施例中和对比例中的原料、试剂等都可以从市场上够买所得或根据已报导的方法制备所得。

首先进行圣路易斯脑炎病毒中NS2B-NS3蛋白酶的表达与纯化：

S1：将含有编码圣路易斯脑炎病毒NS2B-NS3蛋白基因的pET22b(+)载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌体，并用LB固体培养基(含50mg/L氨苄霉素)筛选阳性的克隆；

S2：在固体培养基上挑取阳性克隆，在37℃小摇床培养6h后转入800mL的LB培养基(含50mg/L氨苄霉素)，当其在600nm波长处的吸光值达到0.6时，加入0.2mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)在16℃培养18h；

S3：用3500rpm离心20min收集大肠杆菌后，进行高压破菌；破菌液用18000rpm离心1h后，收集上层澄清的液体；

S4：将上清液加入破菌缓冲液(50mM Tris-HCl，0.3M NaCl，pH 9.0)预平衡的Ni-NTA亲和层析柱中，使目的蛋白与Ni充分结合，使目的蛋白富集；

S5：用含有20mM咪唑的破菌缓冲液洗掉未结合的杂蛋白，考马斯亮蓝G250检测流出液颜色不发生不变化时，说明大部分杂蛋白被冲洗干净。用含100mM咪唑的破菌缓冲液洗脱圣路易斯脑炎病毒NS2B-NS3蛋白，然后用10kD的浓缩管进行浓缩至1mL并换液进一步浓缩，用阴离子交换层析和排阻层析进一步纯化，可获得具有电荷均一性的目的蛋白。

得到纯化后的圣路易斯脑炎病毒NS2B-NS3蛋白，对圣路易斯脑炎病毒NS2B-NS3蛋白酶的活性测定：

荧光底物采用纯度大于95％的底物Bz-Nle-KRR-AMC(购自上海吉尔生化有限公司)；随后用Infinite M1000 Pro检测仪来检测反应不同时间的荧光强度，设置激发光的波长为360nm，设置发射光的波长为460nm。

蛋白缓冲液组分包括：50mM Tris-HCl，25％甘油，pH为9.0，用于稀释上述纯化后的圣路易斯脑炎病毒NS2B-NS3蛋白。

活性测定的步骤为：

S1：用上述蛋白缓冲液配置圣路易斯脑炎病毒NS2B-NS3蛋白酶(终浓度400nM)，加入溶解于95％的DMSO(二甲基亚砜)的化合物(终浓度为20μM)，37℃孵育10min，迅速加入荧光底物Bz-Nle-KRR-AMC，底物浓度为30μM；先对上述液体震动10s，同时转速为300rpm，使其均匀结合，之后每30s记录一次读数，共测定1500s；

同时设计阴性对照试验，阴性对照不加抑制剂，其它实验条件均相同。

S2：以时间作为X轴，荧光数值作为Y轴制备圣路易斯脑炎病毒NS2B-NS3蛋白的酶活动力学曲线；根据仪器显示的荧光强度数值以及反应的时间，运用GraphPad Prism5.0软件分析前300s的酶促反应的速率。

S3：设定V

综合考虑化合物的剩余活性百分率和荧光淬灭率就可以判断化合物对圣路易斯脑炎病毒NS2B-NS3蛋白酶的抑制效果，但由于该体系主要通过荧光强度筛选，所以，当本身有荧光的化合物或者是与AMC类似的化合物都会对体系产生干扰，另外，本身含有淬灭基团化合物可能也会淬灭体系的荧光而造成假阳性，所以需要对其进行复筛；

对于抑制率大于70％的化合物，为排除操作失误造成假阳性的可能，设计荧光淬灭实验对其进行复筛，采用先将圣路易斯脑炎病毒NS2B-NS3蛋白与Bz-Nle-KRR-AMC反应相应的时间，让其荧光数值达到一个最大值设为P

(P

计算得出荧光淬灭率P

如图1恩贝酸对圣路易斯脑炎病毒中的NS2B-NS3蛋白酶的抑制作用示意图所示，将恩贝酸进行代入，恩贝酸对圣路易斯脑炎病毒NS2B-NS3蛋白的抑制率Ir>80％，并且荧光淬灭实验中荧光淬灭率小于20％，可以判定，恩贝酸可以作为抑制剂对圣路易斯脑炎病毒NS2B-NS3蛋白起到抑制作用，并且抑制率较高，能够起到较好的作用。

化合物恩贝酸IC

在测定IC

之后根据初筛结果粗略的设定11个抑制剂浓度，恩贝酸的浓度分别是300μM、100μM、40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.63μM、0.31μM、0μM；

先将蛋白加入酶标板中在酶标仪中与抑制剂在37℃孵育30min后，迅速加入10μL底物，记录时间与荧光变化曲线；通过Graphpad prism 5.0软件得到蛋白酶荧光反应初速率，并拟合化合物浓度与剩余活性的量效关系曲线，最终得出IC

如图2恩贝酸对圣路易斯脑炎病毒中的NS2B-NS3蛋白酶的IC

根据上述实验可知，恩贝酸可以作为圣路易斯脑炎病毒中NS2B-NS3蛋白酶的抑制剂，同时代表能够作为一种治疗圣路易斯脑炎病毒感染的药物，其活性成分为恩贝酸，该药物包括上述恩贝酸以及一种或多种药学上可接受的载体。

载体包括药学领域常规的表面活性剂、粘合剂、崩解剂、稀释剂、赋形剂、吸收促进剂、湿润剂、吸附载体、润滑剂、填充剂以及增效剂中的一种或几种。该药物的制剂为颗粒剂、散剂、糖浆剂、片剂、丸剂或栓剂。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。而且本发明中涉及的专业术语和其他材料仅是为了明确阐述本发明的优势和效果，不应作为本发明创新性的限制。以上实施例是针对本发明实际应用效果的一部分说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡是本领域人员在本发明的基础上所做出的的改进和替换均属于本发明的保护范围。