一种利用丛枝菌根真菌促进金粱糯1号高粱提高支链淀粉含量的方法

技术领域

本发明涉及微生物制剂技术领域、种子丸粒技术领域以及菌种制剂技术领域，具体地说是涉及一种利用丛枝菌根真菌促进金粱糯1号高粱提高支链淀粉含量的方法。

背景技术

酿酒高粱作为酱香型和浓香型白酒的主要原料。高粱支链淀粉含量与白酒的风味物质密切相关，名优白酒常采用支链淀粉含量较高的酿酒高粱。“金粱糯1号”是由金沙县农技站于2004年利用地方品种青壳洋，经系统选育而成，属中早熟常规糯性品种。生育期129天左右，比对照早熟3天。株型半紧凑，株高255厘米。芽鞘浅紫色，叶色绿色，总叶片数16片左右。穗侧散、伞形，成熟整齐一致，熟相好，穗长39厘米，一级分枝46个左右，穗重平均47克，千粒重16.5克，红壳，红粒，籽粒扁圆形，均匀饱满，种皮厚，易脱粒，籽粒糯质，其支链淀粉含量占总淀粉比例为78.14％，因此，提升其支链淀粉含量将有利于名优的酱香型白酒酿造要求。

丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza,AM)真菌是自然界广泛存在可以与植物互利共生的真菌，大量研究发现，丛枝菌根真菌能够促进植物生长，增强植物的抗逆性，提高植物的水分和养分的吸收能力以及改良土壤养分等能力。丛枝菌根真菌作为土壤微生物中普遍存在的群体之一，可以与陆地80％以上的植物建立互惠共生关系，通过吸收植物产生的碳水化合物和脂质加速真菌碳骨架的构建，在根皮层细胞内分化出高度分枝的丛枝结构，也被认为是营养交换的重要功能部位。另外，庞大的根外菌丝系统由根表皮细胞中的菌丝延伸形成，能穿透土壤中的微小颗粒，与植物根系结合形成的菌丝网络，不仅能扩大根系吸收面积，还可以加速土壤有机质的分解，从而为植物提供了一条养分获取的菌根途径。养分获取途径的增加，能够显著提高植物养分和产品籽粒的品质，在玉米和高粱籽粒研究中已见相关报道。然而以前大量的方法是将丛枝菌根的菌剂与种子一起播撒进培养基质，菌剂的用量较大。而直接湿筛挑选出孢子接种到种子和土壤中，其工作量巨大且无法应用于大量生产。因此，迫切需要一种既方便又节省用量的方法来使该技术得以应用。尤其在日益复杂、严峻的土壤环境中，通过丛枝菌根真菌来提高作物产量以及抗性对于农业的可持续发展有着重要的研究价值和应用前景。目前，国内丛枝菌根技术的应用为绿色可持续发展理念开辟了一条重要途径，然而菌剂使用量较大难以推广。

种子丸粒化是通过包裹丸粒化材料，使重量较轻的种子外层附有强度的壳衣，使种子外形规则匀整。丸粒化包裹的介质中往往含有不同活性物质，活性物质的差异将带给种子不同的特色功能。在播种前进行种子加工(分级、引发、包衣和丸化处理等)，有助于提高种子活力和改善田间出苗率。包衣丸化已经被运用于高粱种子播前处理，其不仅可预防种传病害发生，而且可提高出苗率，增强抗逆性和提高产量等。丸粒化种子的粉料是由惰性材料和活性物质组成的。惰性材料是种子丸粒化主要载体，选择的惰性材料不可影响种子的正常发芽发育和生长，且不可使植株在生长过程中积累有害物质，对其他生物造成影响。同时惰性材料也决定了丸粒化种子的理化性质，例如种子的硬度，透气性，耐储存性和缓释活性物质等性质。活性物质是以惰性材料为载体，与惰性材料一起丸到种子表面，可以促进丸粒化种子裂解，在植株生长发育期间起防除病虫害、提高植物抗逆性和促进植株生长等作用的物质，活性物质可以根据生产需要添加进丸粒化种子，根据不同的实际情况添加不同的活性物质，同时也达到相应的目的。已有学者将丸粒化技术应用于高粱中，例如添加7.8mg/L水杨酸和100mg/L脯氨酸混合包衣可促进高粱萌发和幼苗生长。此外，利用活性炭、滑石粉、杀菌剂代森锰锌、羧甲基纤维素和赤霉素对高粱种子进行丸化处理，可在低温胁迫下缩短出苗时间，提高出苗率，减轻黑穗病发病率。

本发明将丸粒化和丛枝菌根真菌技术相结合，对酒用高粱的改良，为贵州喀斯特农田生态系统可持续种植提供技术支撑。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术的缺陷提供一种利用丛枝菌根真菌促进金粱糯1号高粱提高支链淀粉含量的方法，该方法为可持续发展的改良方法，不仅提高了金粱糯1号高粱的发芽率，还解决了丛枝菌根菌剂用量大的问题，可显著提升了高粱的生长发育指标和直链淀粉含量。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种利用丛枝菌根真菌促进金粱糯1号高粱提高支链淀粉含量的方法，该方法包括如下步骤：

(1)菌剂扩繁：

①装填灭菌的沸沙培养基质至培养容器的2/3处，将1020g丛枝菌根真菌菌剂均匀平铺在灭菌的沸沙培养基质上，然后种上漂洗后的金粱糯1号高粱种子，再覆盖2cm厚度的灭菌的沸沙培养基质，浇透水，移至光照室或温室培养3—5个月；

②将在上述步骤①中培养3—5个月后的金粱糯1号高粱根系剪成小于1cm的小段，利用显微镜选用湿筛法检查菌剂中的孢子，然后与步骤①中所使用的灭菌的沸沙培养基混合均匀得到扩繁后的丛枝菌根真菌菌剂，将扩繁后的丛枝菌根真菌菌剂置于超低温环境下冷藏待用；

(2)种子处理：

①金粱糯1号高粱种子应符合GB/T8231-2007高粱的规定，对待丸粒化的种子进行净化选择，除去种子中砂粒、石块或异作物种子，去杂质，使种子的净度大于或等于98％，纯度大于或等于98％；

②对种子进行表面消毒，尤其对即将播种的种子进行常规催芽浸泡；

(3)接种真菌及丸粒化处理：

①将消毒后的金粱糯1号高粱种子放入旋转的丸粒化机器中，按照重量组分1:1比例加入步骤(2)中扩繁后的丛枝菌根真菌菌剂，喷入少许桃胶，形成均匀平滑的种子表面结构，以使添加剂能吸附在种子表面，然后加入添加剂，形成以每粒种子为中心的小颗粒；

②增加丸粒强度：主要用于改变种子外形，增加种子尺寸、重量及光泽度，要求其可溶性低、PH值在5.5-8之间、导电率在1.0s/m以下，增大滚圆器，多次加入添加剂，反复进行敷层，体积或重量快速增加，丸粒逐渐圆滑且均匀一致，用具有特定筛孔的振动筛分器进行筛选，把大小丸粒区分开来，不合格的可继续丸粒化，合格的则进入下一程序；

③再次喷入桃胶，加入扩繁后的菌剂，当加入的菌剂使种子达到要求的粒径后，喷入桃胶空转以增加强度和圆度，最后包裹包衣层，在运动的丸粒表面喷上不同染料或彩色薄膜的染色剂，着色后的丸粒化种子放在通风的地方，自然晾干。

优选地，所述步骤(1)的灭菌的沸沙培养基质是通过将粗河沙经过120℃水蒸气消毒20分钟后得到的。

优选地，所述金粱糯1号高粱种子漂洗方式是经过蒸馏水漂洗3—5次。

优选地，所述丛枝菌根真菌菌剂为幼套球囊霉Glomus etunicatum、摩西球囊霉Glomus mosseae和层状球囊霉Glomus versiforme)的混合菌剂。

优选地，所述步骤(1)中的培养容器为圆形PVC盆，其规格为高55—65cm、直径95—105cm。

优选地，所述步骤(1)的超低温的温度为-80℃。

优选地，所述步骤(3)的丛枝菌根真菌菌剂采用丛枝菌根菌种幼套球囊霉Glomusetunicatum、摩西球囊霉Glomus mosseae和层状球囊霉Glomus versiforme经酿酒高粱扩繁4个月后形成的菌剂进行接种处理，菌剂孢子密度≥100个/10g

优选地，所述步骤(3)的包衣层由以下原料的重量份组成，聚丙烯酸纳70份、二胺缓释肥20份、萘乙酸生根2.5份、多菌灵2.5份、魔芋粉2.5份、硫酸锌粉2.5份。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明将丛枝菌根(幼套球囊霉Glomus etunicatum、摩西球囊霉Glomusmosseae和层状球囊霉Glomus versiforme)混合菌剂与消毒后的金粱糯1号种子进行丸粒化处理，处理后的高粱根系与丛枝菌根真菌形成共生体，随着共生体的形成，显著提升了高粱的生长发育指标和直链淀粉含量。本技术作为可持续发展的改良方法，不仅提高了金粱糯1号高粱的发芽率，还解决了丛枝菌根菌剂用量大的问题；

2、本发明简单方便，具有较好的经济效益、社会效益和生态效益，对实现碳达峰、碳中和目标和贵州酒用高粱的改良具有积极意义，也为贵州喀斯特农田生态系统可持续种植提供技术支撑；

3、另外，经过实际测试，本发明制备得到的丸粒化金粱糯1号高粱种子，在种植130—135天后成熟检测籽粒中总淀粉、支链淀粉、蛋白质均增加，较对照增幅分别达到0.4％、2.2％，0.036％；脂肪和单宁含量降低，降低幅度达到0.49％、0.03％，综上，可知利用丛枝菌根真菌的金粱糯1号高粱种子丸粒化配方及方法处理的丸粒化金粱糯1号高粱种子在正常播种后可提高其发芽率，幼苗生长性状以及成熟后籽粒总淀粉、支链淀粉、蛋白质含量，脂肪、单宁含量略有降低。

附图说明

图1为30天后处理后和未处理的金粱糯1号幼苗表现；

图2为30天后处理后与无处理的金粱糯1号高粱幼苗株高对比；

图3为30天后处理后与无处理的金粱糯1号高粱幼苗叶宽对比；

图4为30天后处理后与无处理的金粱糯1号高粱幼苗叶长对比。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明一种利用丛枝菌根真菌促进金粱糯1号高粱提高支链淀粉含量的方法，该方法包括菌剂扩繁、种子处理和接种真菌及丸粒化处理三个环节。

(1)菌剂扩繁：

①装填灭菌的沸沙培养基质至培养容器的2/3处，将1020g丛枝菌根真菌菌剂均匀平铺在灭菌的沸沙培养基质上，然后种上漂洗后的金粱糯1号高粱种子，再覆盖2cm厚度的灭菌的沸沙培养基质，浇透水，移至光照室或温室培养3—5个月；本步骤的培养容器为圆形PVC盆，其规格为高55—65cm、直径95—105cm；灭菌的沸沙培养基质是通过将粗河沙经过120℃水蒸气消毒20分钟后得到的；金粱糯1号高粱种子漂洗方式是经过蒸馏水漂洗3—5次；本步骤的丛枝菌根真菌菌剂为幼套球囊霉Glomus etunicatum、摩西球囊霉Glomusmosseae和层状球囊霉Glomus versiforme)的混合菌剂，这几个菌种是贵州省优势菌种，属广谱性菌种，亲和性高，效果良好，公众可从中国丛枝菌根种质资源库购买。

②将在上述步骤①中培养3—5个月后的金粱糯1号高粱根系剪成小于1cm的小段，利用显微镜选用湿筛法检查菌剂中的孢子，然后与步骤①中所使用的灭菌的沸沙培养基混合均匀得到扩繁后的丛枝菌根真菌菌剂，将扩繁后的丛枝菌根真菌菌剂置于超低温环境下冷藏待用；本步骤的超低温环境是温度为-80℃的冰箱；

(2)种子处理：

①金粱糯1号高粱种子应符合GB/T8231-2007高粱的规定，对待丸粒化的种子进行净化选择，除去种子中砂粒、石块或异作物种子，去杂质，使种子的净度大于或等于98％，纯度大于或等于98％；

②对种子进行表面消毒，尤其对即将播种的种子进行常规催芽浸泡；

(3)接种真菌及丸粒化处理：

①将消毒后的金粱糯1号高粱种子放入旋转的丸粒化机器中，按照重量组分1:1比例加入步骤(2)中扩繁后的丛枝菌根真菌菌剂，喷入少许桃胶，形成均匀平滑的种子表面结构，以使添加剂能吸附在种子表面，然后加入添加剂，形成以每粒种子为中心的小颗粒；

②增加丸粒强度：主要用于改变种子外形，增加种子尺寸、重量及光泽度，要求其可溶性低、PH值在5.5-8之间、导电率在1.0s/m以下，增大滚圆器，多次加入添加剂，反复进行敷层，体积或重量快速增加，丸粒逐渐圆滑且均匀一致，用具有特定筛孔的振动筛分器进行筛选，把大小丸粒区分开来，不合格的可继续丸粒化，合格的则进入下一程序；

③再次喷入桃胶，加入扩繁后的菌剂，当加入的菌剂使种子达到要求的粒径后，喷入桃胶空转以增加强度和圆度，最后包裹包衣层，在运动的丸粒表面喷上不同染料或彩色薄膜的染色剂，着色后的丸粒化种子放在通风的地方，自然晾干，本发明的包衣层由以下原料的重量份组成，聚丙烯酸纳70份、二胺缓释肥20份、萘乙酸生根2.5份、多菌灵2.5份、魔芋粉2.5份、硫酸锌粉2.5份，本步骤的丛枝菌根真菌菌剂采用丛枝菌根菌种幼套球囊霉Glomus etunicatum、摩西球囊霉Glomus mosseae和层状球囊霉Glomus versiforme经酿酒高粱扩繁4个月后形成的菌剂进行接种处理，菌剂孢子密度≥100个/10g

培养试验：

将土壤、沙子和蛭石(3:1:1，v/v/v)混合物为培养基质，在121℃和0.11MPa条件下蒸压2h进行灭菌，灭菌后的培养基质转入每个PVC盆中，处理组在每盆播入3粒本发明制备的金粱糯1号高粱种子；对照组播入未经过任何处理的金粱糯1号高粱种子，每个对照组4个重复。及时浇水保持土壤的持水量在80％。培养期间，每周转动盆体1次，每2周随机挪动位置，以消除光照、通风等因素造成的试验误差，培养7天后统计其出芽率，培养30天统计其幼苗生长指标，培养135天获得收获高粱籽粒，分别测定各个实例以及空白对照的指标参数数据。

实例1：

本发明制备得到的丸粒化金粱糯1号种子与未经处理的金粱糯1号种子在温度为12-19摄氏度，光照和黑暗时间14/10个小时的温差交替，7天后统计发芽率。

发芽率指标测定：

发芽率＝发芽种子数/供试种子数×100％；

丸粒化种子主要技术指标测定：

裂解度＝24h内裂解丸粒化种子数/200×100％，200即每个样品供试的种子总数，丸粒化倍数＝丸粒化种子千粒重/裸种种子千粒重；

表1丸粒化处理金粱糯1号种子发芽及生长的影响

实验结果表明，本发明制备得到的丸粒化金粱糯1号高粱种子，在低温萌发7天后，发芽率明显提高，发芽整齐，长势更好，有效地提高种子的重量。

实例2：

本发明制备得到的丸粒化金粱糯1号种子与未经处理的金粱糯1号种子，30天后统计幼苗生长指标，表现如图1至图4所示，其株高、叶宽和叶长均得到显著提高。

实例3：

种植135天后成熟检测高粱籽粒理化指标，包括总淀粉，支链淀粉，蛋白质，脂肪和单宁含量。

表2为处理后和未处理的金粱糯1号高粱的种子籽粒含量情况

实验结果表明，本发明制备得到的丸粒化金粱糯1号高粱种子，在种植130—135天后成熟检测籽粒中总淀粉、支链淀粉、蛋白质均增加，较对照增幅分别达到0.4％、2.2％，0.036％；脂肪和单宁含量降低，降低幅度达到0.49％、0.03％。

综上，该应用丛枝菌根真菌的金粱糯1号高粱种子丸粒化配方及方法处理的丸粒化金粱糯1号高粱种子在正常播种后可提高其发芽率，幼苗生长性状；成熟后高粱籽粒的总淀粉、支链淀粉、蛋白质含量有提高；脂肪和单宁含量降低。

以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。最后需要说明的是，说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术，本领域技术人员无需付出创造性劳动即可实现，故在此不再赘述。