miR-181抑制剂及其用途

技术领域

本发明涉及能抑制miR-181的药物，其用于治疗和/或预防线粒体疾病，包括累及眼和/或脑(eye and/or brain involvement)的线粒体病以及与线粒体功能障碍有关的影响眼和/或脑的神经退变性病况。

背景技术

线粒体是不同细胞过程中的关键角色，其功能障碍直接或间接导致各种人类疾病的发病，例如直接导致线粒体疾病(MD)发病或间接导致常见神经退行性疾病(包括帕金森氏病(PD)或阿尔茨海默氏病(AD))发病，其中线粒体功能障碍被描述为发病机理中的主要因果要素(参考：PMID：23567191)。

原发性线粒体疾病(PMD)是一组异质性疾病，由涉及氧化磷酸化(OXPHOS)的线粒体或核编码基因突变引起。PMD的临床表现范围从单个组织/器官病变到多器官综合征，显著累及中枢神经系统(CNS)，其对线粒体功能障碍特别敏感。PMD包括：Leigh综合征，Leber遗传性视神经病变(LHON)，线粒体肌病，脑病，乳酸性酸中毒和中风综合征(MELAS)，Kjer视神经病变，共济失调性神经病变和色素性视网膜炎(NARP)，常染色体显性视神经萎缩，Kearns-Sayre综合征，肌阵挛性癫痫发作伴破碎红纤维(MERRF)综合征。继发性线粒体疾病(SMD)是由直接影响线粒体功能的核基因突变引起的一组疾病，包括Friedreich共济失调，遗传性痉挛性截瘫，腓骨肌萎缩症。

尽管每种疾病都很罕见，但总体上，成年MD的总患病率估计为4300分之一左右，代表了遗传性神经疾病中最普遍的群体之一(Gorman等，2015)。

影响中枢神经系统和/或眼部的神经退行性疾病通常与线粒体功能障碍有关；所述疾病可能是散发性或家族性的：例如，与年龄相关的散发性神经退行性疾病包括帕金森氏病(PD)，阿尔茨海默氏病(AD)，年龄相关性黄斑变性(AMD)，糖尿病性视网膜病变，青光眼。

家族性神经退行性疾病包括家族性PD，AD，亨廷顿氏病，色素性视网膜炎(RP)，斯塔加特氏病。

线粒体疾病(PMD和SMD)在生化和遗传上都是异质的，到目前为止，其复杂性阻止了有效治疗方法的开发。对于大多数患者，治疗仅限于预防或治疗并发症，例如糖尿病，心脏损害和癫痫。可用的治疗是支持性的(不能解决主要缺陷)或针对线粒体功能障碍的特定方面。因此，迄今为止尚无有效的疗法，治疗已确立的线粒体疾病患者仍然存在极大挑战(Lightowlers等，2015；Viscomi等，2015)。最近，已测试了线粒体生物发生/动力学或线粒体清除/质量控制的特异性调节作为体外和体内MD模型的可能治疗策略(Cerutti等,2014；Civiletto等,2018；Civiletto等,2015；Johnson等,2013；Viscomi等,2011)。尽管有一些令人鼓舞的数据，但随后的方法产生了不一致的结果，并且在不同的MD模型中均无效[(Lightowlers等,2015；Viscomi等,2015)综述]。因此，需要更有效地调节线粒体途径作为MD的治疗策略。

对于神经退行性疾病，例如PD或AD，尚未有有效疗法。AD是痴呆的最常见原因，占病例的60-80％，而工业化国家PD的患病率据估计在60岁以上人群中为1％，这是迄今为止卫生系统的重要负担，因为迄今的治疗选择大部分是针对疾病症状的(Barnes&Yaffe，2011；de Lau&Breteler，2006)。

微小RNA(miRNA)是基因表达的基础精细调节剂，由于具有同时调节参与疾病发病机理和进展的多种分子途径的能力，代表了具有前景的治疗工具。miRNA的调节已出于治疗目的应用于不同疾病，并已在特定情况下达到临床前和临床阶段(Broderick&Zamore，2011；Christopher等，2016；Janssen等，2013；Ling等，2013)。miRNA在神经元存活中起着关键作用，而且越来越多的证据表明miRNA调控的基因网络的改变会增加神经退行性疾病的风险(Hebert&De Strooper，2009)。miR-181家族成员由位于三条独立染色体上的三个独立的初级转录本产生。每个转录本产生两条前体序列，总共六条前体序列。每个前体产生两条miRNA链：引导链或5p，以及信使链或3p，共十种成熟miRNA形式：miR-181a-5p,miR-181a-1-3p,miR-181a-2-3p,miR-181b-5p,miR-181b-1-3p,miR-181b-2-3p miR-181c-5p,miR-181c-3p,miR-181d-5p和miR-181d-3p。5p成熟序列在哺乳动物组织中显示最大丰度表达水平(Karali等,2016)；且包含相同的5’“种子”序列，提示了显著程度的功能性冗余(Henao-Mejia等,2013；Ji等,2009)。如本文所用，六种成熟5p miRNA定义为：miR-181a-1,miR-181a-2,miR-181b-1,miR-181b-2,miR-181c,和miR-181d。miR-181a-1和miR-181a-2的成熟形式，以及miR-181b-1和miR-181b-2在序列上是相同的；miR-181c成熟形式与miR-181a相比有一个核苷酸的不同，而miR-181d成熟形式与miR-181b有一个核苷酸的不同。miR-181a和miR-181b(miR-181a/b)在脊椎动物中是高度保守的，且在大脑和视网膜的不同区域中高度表达(Boudreau等,2014；Karali等,2016)，且近来被报道靶向涉及线粒体依赖性细胞死亡(Hutchison等,2013；Ouyang等,2012；Rodriguez-Blazquez等,2015)和自噬(Cheng等,2016；He等,2013；Tekirdag等,2013)的基因。

发明内容

本发明涉及miR-181抑制剂，其用于治疗和/或预防线粒体疾病，包括累及眼和/或大脑的线粒体病以及与线粒体功能障碍有关的影响眼和/或大脑的神经退变。

本发明人出乎意料地发现miR-181，特别是miR181a和b参与线粒体功能的整体调控，这种调控是通过控制与CNS中抗氧化反应、线粒体生物发生和功能化相关的基因；此外，本发明人还发现miR-181a/b调控线粒体依赖性程序化细胞死亡和自噬/线粒体自噬相关基因的表达，同时精细调节CNS中的线粒体途径。

发明人出乎意料地证明，miR-181的抑制在MD和与线粒体功能障碍相关的神经退变中发挥神经保护作用，对于遗传异质性的疾病如MD，PD和RP尤其高度相关，对此非基因依赖性的治疗策略非常可取。

本发明人发现，miR-181a/b通过生物发生和清除的精细协调来调节线粒体转换。发明人还发现，抑制miR-181可对以线粒体功能障碍为特征的几种病理学产生有益的影响，特别是通过保护其免受疾病中的线粒体介导的细胞死亡和神经退变等的侵害，所述疾病例如PMD，包括Leigh综合征，Leber遗传性视神经病变(LHON)，线粒体肌病，脑病，乳酸性酸中毒和中风综合征(MELAS)，肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(MERRF)，进行性眼外肌麻痹(PEO)，皮尔逊氏综合征，母体遗传性肌病和心肌病(MIMyCA)，凯氏视神经病变，共济失调性神经病变和色素性视网膜炎(NARP)，常染色体显性视神经萎缩，Kearns-Sayre综合征，肌阵挛性癫痫发作伴破碎红纤维(MERRF)综合征；SMD，包括Friedreich氏共济失调，遗传性痉挛性截瘫，腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease)；与线粒体功能障碍有关的影响中枢神经系统和/或眼的神经退行性疾病：包括散发的与年龄相关的神经退行性疾病，例如帕金森氏病(PD)，阿尔茨海默氏病(AD)，年龄相关性黄斑变性(AMD)，糖尿病性视网膜病变，青光眼；家族性神经退行性疾病，包括家族性PD，AD，亨廷顿氏病，色素性视网膜炎(RP)，斯塔加特氏病。

然后，本发明提供了用于治疗和/或预防线粒体疾病的miR-181抑制剂。

在本发明中，线粒体失调和线粒体疾病被同等地使用。

根据本发明的该方面，线粒体疾病的治疗和/或预防可以有效减轻所述疾病的至少一种症状。

据认为，当治疗疾病的潜在原因时，同样可以实现症状的管理。通过症状的管理，意在可以保持症状的严重程度(即，控制症状的恶化或发展)，或更优选地，可以全部或部分地减轻症状的严重性。

本文中所用的“治疗”(及其语法变化形式)或“预防”(及其语法变化形式例如“预防”或“预防”)指试图改变受治疗的个体的自然病程，并且可供预防或在临床病理学的病程中采用的临床介入。所需的治疗效果包括但不限于，预防疾病或病症的发生或复发、缓减症状、减少疾病或病症的任何直接或间接病理学结果、防止复发、降低疾病或病症进展速度、缓解或缓和疾病或病症状态和减轻或改善预后。在一些实施方式中，本发明的抑制剂用于延缓疾病或病症发展或减缓疾病或病症进展。

优选所述抑制剂是抑制性核酸药剂，小分子或基因组编辑剂。编辑剂是可以介导目标基因破坏或修复的试剂，其中所述试剂是工程化核酸酶，例如锌指核酸酶，转录活化物样效应核酸酶或成簇规则间隔短回文重复系统。

优选地，抑制性核酸剂选自：本文定义的siRNA，反义寡核苷酸(例如，安塔够妙(antagomir)，LNA)，miRNA海绵和/或核酶。

还优选miR-181的抑制剂包含与miR-181互补的至少一种序列。优选地，miR-181的抑制剂包含至少一条与ACAUUCA互补的序列(SEQ ID NO.5)或包含ACAUUCA(SEQ ID NO.5)。优选地，所述抑制剂降低miR-181的功能和/或活性。

miR-181的功能和活性可以通过本领域中任何已知的方法来测量，特别是如本文所述的方法。

更优选地，所述抑制剂具有选自以下的至少一种性质：抑制miRNA活性，优选抑制mRNA靶标结合，增加至少一种特定miR-181靶标的mRNA水平，改善线粒体功能，增加线粒体数量，减少氧化应激和/或细胞死亡，改善细胞存活率。

上述性质可以通过本领域中任何已知的方法来测量，特别是如本文所述的方法。

优选地，所述miR-181是miR-181前体或成熟的miR-181，优选所述miR-181选自miR-181a-1，miR-181a-2，miR-181b-1，miR-181b-2，miR-181c和miR-181d或其组合。

优选地，miR-的抑制剂包含序列ACAUUCA(SEQ ID NO：5)或包含序列ACAUUCA(SEQID NO.5)并且与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID NO.4具有至少80％的序列同一性。优选地，它与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4具有至少85％，90％，95％，99％的同一性。

仍优选地，所述抑制剂长18至21个核苷酸。

在一个优选的实施方案中，所述miR抑制剂是具有下式的miRNA海绵：

(X1sX2sX3)n

其中，

X1,X2和X3独立选自：

-与miR-181a和/或miR-181c互补的MPS SEQ，优选从核苷酸9到核苷酸12经修饰以产生凸起(bulge)；

-与miR-181b和/或miR-181d互补的MPS SEQ，优选从核苷酸9到核苷酸12经修饰以产生凸起(bulge)；

X3可以存在或不存在；

S是4-6个核苷酸的间隔子序列，优选为4个核苷酸；

S2是4至6个核苷酸的中央间隔子序列，优选为6个核苷酸，优选对应于限制性内切酶位点，优选为XbaI限制性内切酶的位点。

n1和n2是独立选自3、6和24的数字，优选地在3、6和12之间，最优选地n是3，n1和n2可以相同或不同。

在一个优选的实施方案中，所述miRNA海绵具有下式：

(AsB)n

其中：

A是与miR-181a和/或miR-181c互补的MPS SEQ，优选从核苷酸9到核苷酸12经修饰以产生凸起；

B是与miR-181b和/或miR-181d互补的MPS SEQ，优选从核苷酸9到核苷酸12经修饰以产生凸起(bulge)；

S是4-6个核苷酸的间隔子序列，优选为4个核苷酸；

S2是4至6个核苷酸的中央间隔子序列，优选为6个核苷酸，优选对应于限制性内切酶位点，优选为XbaI限制性内切酶的位点。

n

优选X1,X2,X3,A是3’TTGTAAGTn1n2n3n2ACAGCCACTCA 5’(SEQ ID NO.113)其中根据IUPAC命名学

n1＝A或C或G

n2＝A或C或T

n3＝A或GC或T

或其中X1,X2,X3,B是3’TTGTAAGT

其中根据IUPAC命名学

n’1＝C或G或T

n’2＝A或G或T

n’3＝A或C或T

或其中n

或其中S由4个核苷酸组成，优选S＝tagc；

或其中S2由6个核苷酸组成，优选S2＝Tctaga。

优选地，抑制剂的序列还包含一个或多个锁核酸(LNA)核苷酸和一个或多个非锁核苷酸，其中至少一个非锁核苷酸包含化学修饰，优选锁核酸(LNA)核苷酸具有2'至4'亚甲基桥，优选化学修饰为2'O-烷基或2'卤素修饰。

仍然优选的是所述miR-181抑制剂与至少一种其他试剂一起使用。

更优选地，所述至少一种另外的试剂是如上以及在本发明中定义的miR-181的抑制剂。

然后，该用途是指一种或多种miR-181抑制剂，即一种或多种siRNA，反义寡核苷酸(例如，安塔够妙(antagomir)，LNA)，miRNA海绵和/或核酶的组合，它们可以相同或不同。

在一个优选的实施方案中，所述至少一种其他试剂选自改善线粒体功能的试剂，选自：增强线粒体生物发生的试剂(即激活控制线粒体生物发生的通路，从而导致氧化磷酸化增强和/或改善呼吸链复合物的缺陷活性的药物，例如NAD+前体(例如，烟酰胺核糖苷等))，AMPK激动剂(例如AICAR)，聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制剂(例如奥拉帕尼(Olaparib，AZD-2281)等)，白藜芦醇，二甲双胍，视黄酸，调节自噬的药物，例如自噬激活剂，例如mTOR抑制剂(如雷帕霉素)，一种抑制细胞凋亡的药物，ROS清除剂，例如抗氧化化合物，包括硫辛酸，维生素C和E，以及CoQ，一种改变异质性的药物，一种有毒化合物的清除剂，N-乙酰半胱氨酸(NAC)，甲硝唑，核苷酸补剂，通透性转换孔抑制剂(例如环孢菌素A或其衍生物)，替代丢失的因子的药物，例如酶替代疗法，其中体内缺陷或缺失的酶被替代，或者基因疗法，例如将核酸作为治疗疾病的药物治疗性地输送到患者的细胞中。

本发明优选的其它药剂是用于治疗本发明的疾病的药剂，例如用于治疗LHON疾病的药剂：艾地苯醌是泛醌的合成类似物，其作用是改善大脑中的线粒体氧化代谢并减少氧化应激(Lyseng-Williamson，2016；Sanchez等，2016)。羟钴胺素(维生素B12的合成的可注射形式)，包含人类野生型线粒体ND4基因的重组AAV血清型2，包含人类野生型线粒体ND1基因的重组AAV载体，阿来普肽(线粒体膜通透性转换孔开放阻断剂)。

优选地，所述miR-181的抑制剂和所述至少一种其他试剂是依次或同时施用的。

本发明还提供了药物组合物，其包含用于治疗和/或预防线粒体疾病的如前述实施方案中任一项所定义的miR-181抑制剂，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。

优选地，所述组合物还包含至少一种另外的试剂，优选所述至少一种另外的试剂是如上定义的miR-181的抑制剂，优选所述至少一种另外的试剂选自：增加线粒体生物发生的试剂，调节自噬的试剂，抑制细胞凋亡的试剂，ROS清除剂，改变异质性的试剂，有毒化合物的清除剂，核苷酸补剂，替代缺失基因的试剂。

本发明进一步提供一种在有需要的对象中治疗线粒体疾病的方法，其包括向该对象施用至少如上定义的miR-181抑制剂或如上定义的药物组合物。

本发明还提供了包含至少一种如上定义的miR-181抑制剂和启动子序列的载体，优选该载体是病毒载体，并且优选地是腺相关病毒载体，其用于治疗和/或预防线粒体疾病。

优选地，线粒体疾病是原发性或继发性线粒体疾病。

优选地，线粒体疾病选自：累及眼和/或脑的线粒体疾病，影响眼和/或脑的神经退变，所述神经退变与线粒体功能障碍有关。

还优选地，线粒体疾病选自：Leigh综合征，Leber遗传性视神经病变(LHON)，线粒体肌病，脑病，乳酸性酸中毒和中风综合征(MELAS)，肌阵挛性癫痫发作伴破碎红纤维(MERRF)，进行性眼外肌麻痹(PEO)，皮尔逊氏综合征，母体遗传性肌病和心肌病(MIMyCA)，凯氏视神经病变，共济失调性神经病变和色素性视网膜炎(NARP)，常染色体显性视神经萎缩，Kearns-Sayre综合征，肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(MERRF)综合征，Friedreich氏共济失调，遗传性痉挛性截瘫，腓骨肌萎缩症，散发的与年龄相关的神经退行性疾病，帕金森氏病(PD)，阿尔茨海默氏病(AD)，年龄相关性黄斑变性(AMD)，糖尿病性视网膜病变，青光眼，家族性神经退行性疾病，家族性PD，AD，亨廷顿氏病，色素性视网膜炎(RP)，斯塔加特氏病。

通过参考下图非限制性实施例阐述本发明。

图1.miR-181a/b调节线粒体的生物发生和线粒体自噬。

A)qRT-PCR证实miR-181a/b沉默导致SH-SY5Y细胞中miR-181a/b预测靶标的上调。N＝3次独立实验。

B)miR-181-模拟转染特异性抑制含有WT 3'-UTR预测靶序列的构建体的萤光素酶活性。miR-181a/b结合位点的点突变(mut)消除了萤光素酶抑制作用。数据对阴性模拟转染标准化(虚线)。N＝6次独立实验。

C)qRT-PCR显示miR-181a/b-1

D)miR-181a/b-1

E)WB分析(左图)显示miR-181a/b-1

F)线粒体和胞质部分的WB分析(左图)显示-/-与+/+小鼠眼的线粒体部分中p62和Parkin水平升高(右图量化)。分别将线粒体和胞质组分的数据对Ndufb8或Gapdh标准化。N＝3动物/基因型。

*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001单尾(在A-C和E中)和双尾斯氏t检验(在D中)。

图2.miR-181a/b抑制作用抵消具有线性皮肤缺损(MLS)的小眼畸形青鳉鱼(medakafish)模型中的细胞死亡。

A)在st30青鳉鱼对照和MO注射的胚胎的视网膜和脑切片上进行的TUNEL分析显示注射hccs-MO/miR-181a/b-MO-和cox7b-MO/miR-181a/-MO的胚胎中凋亡细胞的数量与分别注射hccs-MO-和cox7b-MO-的胚胎相比有所减少。比例尺为20μm。

B)TUNEL阳性细胞/眼。每个模型n≥5个视网膜。

C)胱冬酶实验显示注射hccs-MO/miR-181a/b-MO-和cox7b-MO/miR-181a/-MO的胚胎中与分别注射hccs-MO-和cox7b-MO-的胚胎相比胱冬酶-3和胱冬酶-9活性水平有所恢复。

图3.miR-181a/b下调改善了MLS青鳉鱼模型的表型。

(A-I)单独注射hccs-MO(B)和cox7b-MO(H)或与miR-181a/b-MO共同注射(C，I)的st30青鳉鱼胚胎的代表性图像。共注射miR-181a/b-MO可在hccs-MO和cox7b-MO胚胎中拯救小眼畸形和小头畸形。

(D-F，J-L)用Baf-A1，PD98059或HA14-1处理注射了hccs-MO/miR-181a/b-MO-和cox7b-MO/miR-181a/b-MO的胚胎。Baf-A1处理抵消了hccs-MO/miR-181a/b-MO和cox7b-MO/miR-181a/b-MO胚胎中miR-181a/b下调的保护作用(D，J)。PD98059处理不会干扰miR-181a/b下调介导的MLS表型的调节(E，K)。HA14-1处理抵消了hccs-MO/miR-181a/b-MO模型中miR-181a/b下调的作用，但不影响cox7b-MO/miR-181a/b-MO胚胎(F，L)。比例尺为100μm。

(M-N)hccs-MO(M)和cox7b-MO(N)胚胎中在(A-L)中所示的不同条件下有或没有MLS表型的胚胎的百分比。n≥300个胚胎/条件，**p<0.01；***p<0.001，广义线性模型的偏差分析；误差线是SEM。

图4.在鱼藤酮诱导的LHON综合征小鼠模型中，miR-181a/b-1的失活可保护RGC免受细胞死亡。

A)玻璃体内注射鱼藤酮或DMSO的miR-181a/b-1

B)注射后一和两周的RGC数量/mm(以％表示)N＝10。

C)视动跟踪实验结果的图形表示，报道为周/度的倍数变化。与对照组相比，在注射鱼藤酮的miR-181a/b-1

***p<0.001，具有事后Tukey分析的单向方差分析(B，C中)；误差线是SEM。

D)玻璃体内注射鱼藤酮或DMSO的miR-181a/b-1

E)在注射了鱼藤酮或DMSO的miR-181a/b-1

图5.miR-181a/b耗竭保护Ndufs4

A-D)在WT，Ndufs4

p值在E-F中通过事后Tukey分析进行单向ANOVA计算，并在G中通过事后分析进行两次ANOVA重复测量。G中的p值表示20log cd.s/m

图6.miR-181a/b耗竭增加了Nrf1和Park2转录本水平，并增强了Ndufs4

A)q-RT-PCR揭示在Ndufs4

图7.miR-181a/b耗竭可增强Ndufs4

A-C)电子显微镜分析显示Ndufs4

图8.miR-181a/b抑制作用保护DA神经元对抗6-OHDA诱导的青鳉鱼中的细胞死亡。

A)青鳉鱼脑中的RNA ISH显示，在蓝斑核(locus coeruleus)中的DA神经元中显示miR-181a和miR-181b的强表达(箭头)。比例尺为100μm。

(B-D)在st38对照(DMSO处理)(B)，6-OHDA处理的对照(C)和6-OHDA处理的miR-181a/b-MO注射的(D)青鳉鱼脑上进行抗TH免疫组织化学染色以显示DA神经元。6-OHDA处理可导致对照组的TH阳性细胞(箭头)减少，但注射miR-181a/b的鱼却没有。比例尺为100μm。

(B’-D’)B-D的较高放大倍数。比例尺为40μm。

E)TH阳性细胞/蓝斑核数(以％表示)。N＝6，**p<0.01，具有事后Tukey分析的单向方差分析；误差线是SEM。

图9.miR-181a/b-1的失活改善了6-OHDA诱导的PD小鼠模型的表型。

(A-C)在黑质(SN)中单侧注射6-OHDA的miR-181a/b-1

(A，B)在miR-181a/b-1

(C，D)相对于对照盐水注射侧(C)，在6-OHDA注射侧的miR-181a/b-1

E)SN中TH阳性细胞/切片的数量报告为倍数变化，对照半球对于每种小鼠基因型对应于1。N＝6。

F)L-DOPA诱导的旋转测试测量了注射6-OHDA的miR-181a/b-1

图10.miR-181a/b-1簇占据了小鼠脑和眼睛中大部分miR-181a和miR-181b表达。

A，B)miR-181a/b-1

C，D)通过Taqman实验对miR-181a/b-1

E)miR-181a/b-1

图11.miR-181a/b-1缺失导致自噬通量增加。

A)qRT-PCR显示miR-181a/b-1

B)在饱食和饥饿的条件下获自动物眼的蛋白提取物上的Lc3-I/Lc3-II和p62的WB分析(左图)，结果显示miR-181a/b-1-/-(-/-)相对于miR-181a/b-1

C)qRT-PCR分析显示在喂食和饥饿条件下miR-181a/b-1

图12.miR-181a/b沉默保护SH-SY5Y细胞免受FCCP诱导的细胞死亡。

细胞死亡分析显示，miR-181a/b沉默(100nM)保护SH-SY5Y细胞免受FCCP处理的影响。n＝3个独立实验。**p<0.01,双尾斯氏t-检验。误差线为SEM。

图13.青鳉鱼中的miR-181a/b敲低(knockdown)导致与线粒体功能和线粒体自噬有关的基因上调。

对从整个miR-181a/b-MOs青鳉鱼胚胎中提取的总RNA进行qRT-PCR，以分析涉及线粒体依赖性细胞死亡中(bcl2，mcl1)，线粒体自噬(atg5，erk2)，和线粒体的生物发生和功能(cox11，coq10b，prdx3)的miR-181a/b靶标和间接靶标ppargc1a的转录水平。n＝3**<0.05；***<0.005单尾斯氏t检验；误差线是SEM。

图14.MO介导的miR-181a/b沉默和给药后无异常表型

(A，B)仅注射miR-181a/b-MOs的青鳉鱼胚胎(B)与对照胚胎(A)相比没有表型差异。

(C-E)在该研究中使用的浓度下，巴佛洛霉素(Bafilomycin)A(Baf-A1)(C)，PD98059(D)和HA14-1(E)不会在对照胚胎中诱导任何形态变化。比例尺为100μm。(F)如lc3-I/II Wb分析所示，用于该研究的巴佛洛霉素A的浓度可阻止自噬。

图15.miR-181a/b-1缺失不会引起小鼠视网膜形态和功能显著改变。

(A-J)不同视网膜标志物的免疫荧光染色[(A，B)视杆细胞的视紫红质(Rhod)；(C，D)视锥细胞的视锥-抑制蛋白(C-Arr)；(E，F)RGC和无长突细胞的Pax6；(G，H)Muller细胞的GS6；(I，J)内丛状层中突触结构的突触融合蛋白(Synt)]揭示，相对于对照小鼠而言miR-181a/b-1

K，L)视网膜电图分析显示miR-181a/b-1

M)RGC/mm数量的图形表示(表示为％)显示miR-181a/b-1

图16.miR-181a/b抑制作用降低AMD体外模型中脂褐素(A2E)的累积。

A)用对照LNA和LNA-miR-181a/b转染然后用A2E处理的ARPE-19细胞的共聚焦图像。自体荧光分析显示A2E累积量，且表明与对照细胞相比，miR-181a/b抑制减少A2E累积。B)与对照细胞相比的，LNA-miR-181a/b转染的细胞中每个细胞的A2E自发荧光强度，A2ESPOT强度和A2E SPOT面积的定量图示，报告为倍数变化。斯氏t检验p值***<0.001,**<0.005

图17.miR-181a/b耗竭减少了Abca4

A)Abca4

图18.miR-181a/b减少改善色素性视网膜炎小鼠模型的视觉功能。

P347S和P347S/miR-181a/b

图19.miR-181a/b减少改善色素性视网膜炎小鼠模型的感光细胞标志物表达。

A)用两种不同的视网膜标记物(绿色)，视紫红质和视锥抑制蛋白以及DAPI(蓝色)染色的P347S和P347S/miR-181a/b

图20.miR-181a/b减少改善了感光细胞的外部片段长度。P347S/miR-181a/b

图21.miR-181a/b减少改善较晚时间点色素性视网膜炎小鼠模型的视觉功能。

P347S和P347S/miR-181a/b

图22.miR-181a/b减少改善色素性视网膜炎小鼠模型的感光细胞标志物表达和存活。

A)用两种不同的视网膜标记物(绿色)，视紫红质和视锥抑制蛋白以及DAPI(蓝色)染色的P347S和P347S/miR-181a/b

图23.A)P347S相对于野生型眼的转录组学分析中下调的项目。

B)P347S/181a/b

图24.miR-181a/b的减少降低P347S视网膜中活化的胱冬酶3。

A)p30时P347S和P347S/miR-181a/b+/-的冷冻视网膜切片上的免疫荧光图像，用抗活化胱冬酶-3抗体(绿色)和DAPI(蓝色)染色。该分析揭示了P347S/miR-181a/b

图25.miR-181a/b的减少降低P347S视网膜中TUNEL染色。A)冷冻视网膜的P347S和P347S/miR-181a/b+/-在p30时的TUNEL-POD染色。褐色斑点表示DNA双链损伤或单链损伤。该分析揭示了P347S/miR-181a/b

图26.miR-181a/b的减少改善P347S感光细胞中的线粒体形态。A)野生型(WT)，P347S和P347S/mir-181a/b+/-动物的视网膜在p30时的电子显微镜(EM)图像；n＝2只动物/基因型。WT，P347S和P347S/miR-181a/b+/-的PRs线粒体的EM图像在p30时显示miR-181a/b下调的动物PR线粒体表型有所改善。B)线粒体主直径长度的量化。N＝2；*p＝0.01,斯氏t-检验。误差线为SEM。

图27.miR-181a/b的减少改善P347S眼中线粒体标记物的表达。A)在p30时，野生型，P347S和P347S/miR-181a/b+/-动物眼的蛋白质提取物中通过WB分析检测的Mfn2蛋白水平；在D)中定量，数据对p115标准化。n＝2只动物/基因型。误差线为SEM。B)通过WB分析来自p30时的野生型，P347S和P347S/miR-181a/b+/-动物眼的蛋白质提取物中CI亚基NDUFB8，CII SDHB，CIII UQCRC2，CIV MTC01，CV ATP5A的蛋白水平。D)中蛋白质水平的定量数据对p115标准化。n＝2只动物/基因型。误差线为SEM。C)在p30时，野生型、P347S和P347S/miR-181a/b+/-动物眼的蛋白质提取物中通过WB分析检测的柠檬酸合成酶蛋白水平；在D)中显示蛋白质水平定量，数据对p115标准化。n＝4只动物/基因型。D)A、B和C中所示的WB蛋白质定量的图形表示。数据对p115标准化。*p<0.05；**p<0.01,***p<0.001双尾斯氏t检验。误差线为SEM。

图28.miR-181a/b海绵效力的体外实验验证。

A)AAV2.1-CMV-eGFP-miR-181海绵图。B)用AAV2.1-CMV-eGFP-miR-181a/b海绵(海绵181)转染48h后，SH-SY5Y中miR-181a/b直接靶向转录本(XIAP，NRF1，PRDX3，MCL1，ATG5，SIRT1，BCL2，BCL2，ERK2，PARK2，COX11)的qRT-PCR分析。在海绵181样品中，相对于对照样品(对照＝AAV2.1-CMV-eGFP转染的细胞)，miR-181a/b靶标的转录水平增加。N＝3。该数据表明，miR-181海绵隔离了内源性miR-181a/b，从而阻止了其直接靶标的结合并抑制了其活性。

miR-181家族成员的序列比较。

AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU

AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU

AACAUUCAAC-CUGUCGGUGAGU

AACAUUCAUUGUUGUCGGUGGGU

miR-181种子序列(SEQ ID NO.5)

ACAUUCA

CGACAGCGTTGAATGT

CGACAGCAATGAATGT

miR-181海绵的说明:

miR-181海绵“MBS SEQ A”用粗体标示；

>[AAV2.1_CMV_eGFP_miR-181海绵]-5838bp

agcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccagatttaattaaggctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcgcccttaagctagctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatcctgcagaagttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccaggcggccgccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaataagcttggatccaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtgctgcgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgAGATCTTCTAGAACCCACCGACAATGCTGAATGTTTAGCACTCACCGACAATAGTGAATGTTTAGCACCCACCGACAATGCTGAATGTTTAGCACTCACCGACAATAGTGAATGTTTAGCACCCACCGACAATGCTGAATGTTTAGCACTCACCGACAATAGTGAATGTTTCTAGAACCCACCGACAATGCTGAATGTTTAGCACTCACCGACAATAGTGAATGTTTAGCACCCACCGACAATGCTGAATGTTTAGCACTCACCGACAATAGTGAATGTTTAGCACCCACCGACAATGCTGAATGTTTAGCACTCACCGACAATAGTGAATGTTAGATCTgcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggactcgagttaagggcgaattcccgattaggatcttcctagagcatggctacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagccttaattaacctaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccccgatagacggtttttcgccctttgacgctggagttcacgttcctcaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggatttttccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttataatttcaggtggcatctttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaatagtggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagtaatggtaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctgcggttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaag

本文使用的术语“多核苷酸”，“寡核苷酸”，“核酸”和“核酸分子”包括任何长度的核苷酸的聚合形式，不论是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括三链、双链和单链DNA，以及三链、双链和单链RNA。其还包括修饰，例如通过甲基化和/或通过加帽，以及未修饰形式的多核苷酸。更具体地，术语“多核苷酸”，“寡核苷酸”，“核酸”和“核酸分子”包括多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)，多核糖核苷酸(含有D-核糖)，任何其他类型的多核苷酸，其是嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷，以及含有非核苷酸骨架的其他聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸(PNA))和多吗啉代(可从Anti-Virals，Inc.Corvallis,Oreg商购获得，称为Neugene)聚合物，和其他合成的序列特异性核酸聚合物，条件是该聚合物包含核碱基的构型允许碱基配对和碱基堆叠，例如DNA和RNA中发现的那样。术语“多核苷酸”，“寡核苷酸”，“核酸”和“核酸分子”之间在长度上没有刻意区分，并且这些术语可以互换使用。因此，这些术语包括例如3'-脱氧-2'，5'-DNA，寡脱氧核糖核苷酸N3'P5'氨基磷酸酯，2'-O-烷基取代的RNA，双链和单链DNA，以及双链和单链RNA，微小RNA，DNA：RNA杂合物以及PNA与DNA或RNA之间的杂合物，还包括已知类型的修饰，例如，本领域已知的标记，甲基化，“帽”，用类似物取代一种或多种天然核苷酸(例如用2-氨基腺苷，2-硫代胸苷，肌苷，吡咯并嘧啶，3-甲基腺苷，C5-丙炔基胞苷，C5-丙炔基尿苷，C5-溴尿苷，C5-氟尿苷，C5-碘尿苷，C5-甲基胞嘧啶，7-脱氮腺苷，7-脱氮鸟苷，8-氧代腺苷，8-氧代鸟苷，O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)，核苷酸间修饰，例如那些不带电荷的键(例如磷酸甲酯，磷酸三酯，磷酰胺，氨基甲酸酯等)，带负电的键(例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)，带正电荷的键(例如氨基烷基氨基磷酸酯，氨基烷基磷酸三酯)，含有侧基部分的修饰，例如蛋白质(包括核酸酶，毒素，抗体，信号肽，聚L-赖氨酸等)，具有嵌入剂的修饰(例如吖啶，补骨脂素等)，包含螯合剂的修饰(例如金属，放射性金属，硼，氧化性金属等)，含有烷基化剂的修饰，具有修饰的键的修饰(例如α异头核酸等)，以及多核苷酸或寡核苷酸的未修饰形式。该术语还包括锁核酸(例如，包含在2'-氧原子和4'-碳原子之间具有亚甲基桥的核糖核苷酸)。参见例如(Elayadi&Corey,2001；Koshkin等,1998；Kurreck等,2002；Obika等,1998；Orum&Wengel,2001)。

术语“标记”和“可检测标记”是指能够检测的分子，包括但不限于放射性同位素，荧光剂，化学发光剂，酶，酶底物，辅酶因子，酶抑制剂，发色团，染料，金属离子，金属溶胶，配体(例如生物素或半抗原)等。术语“荧光剂”是指能够在可检测范围内显示荧光的物质或其部分。可与本发明一起使用的标记物的具体实例包括但不限于藻红蛋白，Alexa染料，荧光素，YPet，CyPet，级联蓝，别藻蓝蛋白，Cy3，Cy5，Cy7，若丹明，丹磺酰基，伞形酮，德克萨斯红，鲁米诺，吖啶酯，生物素，绿色荧光蛋白(GFP)，增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，黄色荧光蛋白(YFP)，增强型黄色荧光蛋白(EYFP)，蓝色荧光蛋白(BFP)，红色荧光蛋白(RFP)，Dronpa，mCherry，mOrange，mPlum，Venus，萤火虫荧光素酶，海肾荧光素酶，NADPH，β-半乳糖苷酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，碱性磷酸酶，氯霉素乙酰转移酶，脲酶，MRI造影剂(例如，钆双胺，钆贝酸，钆喷酸，钆特醇，钆磷维塞，钆弗塞胺和钆赛酸)，和计算机断层扫描(CT)造影剂(例如，重氮酸，泛影酸，碘酰胺，碘他拉酸，碘羟拉酸，碘格利酸，醋碘苯酸，碘卡酸，碘甲磺，碘奥酮，甲泛影酰胺，碘海醇，碘克沙酸，碘帕多尔，碘普罗胺，碘曲兰，碘弗索尔，碘喷托，碘克沙醇，碘美普尔，碘比醇，碘希兰，碘沙酸，碘曲西酸，碘泛酸，碘西他酸，胺碘苯丙酸钠，替巴酸和胺碘苯丙酸钙)。

如本文所用，用于描述核酸分子的“重组”是指基因组，RNA，miRNA，cDNA，病毒，半合成或合成来源的多核苷酸，由于其来源或操作而与全部或部分与之天然缔合的多核苷酸不相关。

与蛋白或多肽联用时，术语“重组体”指由重组多核苷酸表达产生的多肽。通常，克隆感兴趣的基因并在转化的生物中表达，如下文进一步所述。

微小RNA

如本文所用，术语“微小RNA”，“miRNA”，“成熟微小RNA”和“成熟miRNA”是指长度为约19至约25个核苷酸的非编码单链RNA分子(包括约19，约20，约21，约22，约23，约24和约25个核苷酸)，其可通过RNA干扰途径(即通过与RISC结合并随后降解目标mRNA或翻译抑制)有效降低靶多核苷酸和多肽的表达水平。术语“微小RNA”是指在任何生物(例如植物，动物)中发现的内源性miRNA，也包括人工miRNA，其包括长度为约19-25个核苷酸的单链RNA分子，这些分子不是在内源性miRNA中发现的通过RNA干扰有效减少目标多核苷酸表达的miRNA。

根据其靶向特性，将微小RNA分为多个家族，这些特性主要取决于其延伸的种子区域(miRNA核苷酸2-8)的身份。同一种子家族的成员通常是进化相关的，而进化相关的miRNA通常是同一种子家族的成员。但是如(Bartel，2018)中所述，“家族”一词的使用并不严格表示共同祖先。

本发明的miRNA属于miRNA的miRNA 181家族。

如本文所定义，miRNA 181是一组具有相同种子序列的miRNA，即

ACAUUCA(SEQ ID NO.5)。优选所述miRNA组在本文中被定义为一族miRNA

miR-181家族成员由位于三条独立染色体上的三个独立的初级转录本产生。每个转录本产生两条前体序列，总共六条前体序列。每个前体产生两条miRNA链：引导链或5p，以及信使链或3p，共十种成熟miRNA形式：miR-181a-5p,miR-181a-1-3p,miR-181a-2-3p,miR-181b-5p,miR-181b-1-3p,miR-181b-2-3p miR-181c-5p,miR-181c-3p,miR-181d-5p和miR-181d-3p。5p成熟序列在哺乳动物组织中显示最大丰度表达水平(Karali等,2016)且包含相同的5’“种子”序列，提示了显著程度的功能性冗余(Henao-Mejia等,2013；Ji等,2009)。如本文所用的六种成熟5p miRNA定义为：miR-181a-1,miR-181a-2,miR-181b-1,miR-181b-2,miR-181c,和miR-181d。成熟形式的miR-181a-1和miR-181a-2，以及miR-181b-1和miR-181b-2的序列相同；与miR-181a相比，miR-181c成熟形式具有一个核苷酸差异，而与miR-181b相比，miR-181d成熟形式具有一个核苷酸差异。

“靶位点”是微小RNA识别的核酸序列。单个靶位点通常具有约六至约十个核苷酸。通常，靶位点位于mRNA的3'UTR内，但是靶位点也可以位于mRNA的5'UTR或编码区中。

“抑制剂靶位点”是与所述抑制剂核酸互补的miRNA 181的成熟序列内的序列。miRNA 181序列可以是前体序列或成熟序列。优选地，miRNA 181序列是成熟序列。

抑制性核酸

抑制性核酸包含抑制性RNA和抑制性DNA，例如可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。术语“抑制性核酸”是指一种核酸分子，其包含与靶核酸(例如，靶微小RNA，例如SEQ IDNO.1、2、3或4所定义的任一miRNA)互补并与其结合，通过空间位阻或靶标降解介导靶核酸的水平或活性下降(例如，mRNA靶结合的活性)的序列。抑制性核酸的非限制性实例包括干扰RNA，shRNA，siRNA，核酶，安塔够妙(antagomir)，LNA，miR海绵和反义寡核苷酸。本文描述了制备抑制性RNA的方法。制备抑制性核酸的其他方法是本领域已知的。

本文所用的“干扰RNA”是指任何双链或单链RNA序列，能够通过介导RNA干扰直接或间接(即，在转化时)抑制或下调基因表达。干扰RNA包括但不限于小干扰RNA(“siRNA”)和小发夹RNA(“shRNA”)。“RNA干扰”是指序列相容的信使RNA转录本的选择性降解。

如本文所用，“shRNA”(小发夹RNA)是指包含反义区域，环部分和正义区域的RNA分子，其中正义区域具有与反义区域碱基配对以形成双链体茎的互补核苷酸。

转录加工后，小发夹RNA通过Dicer酶介导的切割事件被转化为小干扰RNA，该酶是核酸酶III家族的成员。

如本文所用，“小干扰RNA”或“siRNA”是指能够通过以序列特异性方式介导RNA干扰来抑制或下调基因表达的任何小RNA分子。小RNA可以是例如约18至21个核苷酸长。

如本文所用，“安塔够妙(antagomir)”是指与特定的微小RNA靶标具有互补性的小合成RNA，其任选地在切割位点错配或具有一种或多种碱基修饰以抑制切割。

如本文所用，短语“转录后加工”是指在转录后发生并且例如由Dicer和/或Drosha酶介导的mRNA加工。

在本文所述的治疗方法中有用的抑制剂包括抑制性核酸分子，其降低SEQ IDNo.1、2、3或4或其组合的任何微小RNA(例如，成熟的微小RNA或前体微小RNA)的表达或活性。

可用于本发明方法和组合物中的抑制性核酸包括反义寡核苷酸，核酶，外部引导序列(EGS)寡核苷酸，siRNA化合物，单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物，例如siRNA化合物，修饰的碱基/锁核酸(LNA)，安塔够妙(antagomir)，肽核酸(PNA)和其他寡聚化合物或寡核苷酸模拟物，它们与目标核酸的至少一部分杂交并调节其功能。在一些实施方案中，抑制性核酸包括反义RNA，反义DNA，嵌合反义寡核苷酸，包含修饰键的反义寡核苷酸，干扰RNA(RNAi)，短干扰RNA(siRNA)；微小干扰RNA(miRN A)；时序调节微小RNA(stRNA)；或短发夹RNA(shRNA)；小RNA诱导的基因激活(RNAa)；小活化RNA(saRNA)或其组合。参见例如,WO2010/040112。

在一些实施方案中，抑制性核酸的长度为10至50、13至50或13至30个核苷酸。本领域普通技术人员将意识到，这体现了具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸长度或其中的任何范围的反义部分的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为15个核苷酸。在一些实施方案中，本发明的反义或寡核苷酸化合物的长度为12或13至30个核苷酸。本领域普通技术人员将理解，这体现了具有反义部分长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，或其中的任何范围的抑制性核酸。

在一些实施方案中，抑制性核酸是包含两个或更多个化学上不同的区域的嵌合寡核苷酸，每个区域由至少一个核苷酸组成。这些寡核苷酸通常包含至少一个赋予一个或多个有益特性的修饰核苷酸区域(例如，增加的核酸酶抗性，增加的细胞摄取，增强的对靶标的结合亲和力)和一个作为能够切割RNA：DNA或RNA：RNA杂合物的酶的底物的区域。如上所述，本发明的嵌合抑制核酸可以形成为两个或更多个寡核苷酸，修饰的寡核苷酸，寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。这样的化合物在本领域中也被称为杂合体或间隔体(gapmer)。教导制备这种杂合物结构的代表性美国专利包括但不限于美国专利第5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，其各自通过引用并入本文。

在一些实施方案中，抑制性核酸包含在糖的2'位置被修饰的至少一个核苷酸，最优选为2'-0-烷基，2'-0-烷基-0-烷基或2'-氟修饰的核苷酸。在其他优选的实施方案中，RNA修饰包括在RNA的3'末端反向碱基或嘧啶、碱性残基的核糖上的2'-氟，2'-氨基和2'O-甲基修饰。此类修饰常规掺入寡核苷酸，并且已显示出这些寡核苷酸相对于针对给定靶标的2'-脱氧寡核苷酸具有更高的Tm(即，更高的靶标结合亲和力)。

已经显示出许多核苷酸和核苷修饰使得掺入它们的寡核苷酸比天然寡脱氧核苷酸对核酸酶消化的抵抗力更高—修饰的寡核苷酸比未修饰的寡核苷酸完整地存活更长的时间。修饰寡核苷酸的具体实例包括那些包含修饰骨架的寡核苷酸，例如硫代磷酸酯，磷酸三酯，甲基膦酸酯，短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖间键。最优选的是具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和具有杂原子骨架的寡核苷酸，特别是CH2-NH-0-CH2，CH，～N(CH3)～0～CH2(称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链)，CH2-O-N(CH3)-CH2，CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2和O-N(CH3)-CH2-CH2主链，其中天然磷酸二酯主链表示为O-P-O-CH，)；酰胺骨架(参见(De Mesmaeker等，1995)；吗啉代骨架结构(参见美国专利号5,034,506)；肽核酸(PNA)骨架(其中寡核苷酸的磷酸二酯骨架被聚酰胺骨架取代，核苷酸直接或间接结合到聚酰胺主链的氮杂氮原子上，参见(Nielsen等，1991)。含磷的键包括但不限于硫代磷酸酯，手性硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，包含3'亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯的甲基和其他烷基膦酸酯，次膦酸酯，包含3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基膦酸酯的氨基膦酸酯，具有正常3’-5’连接键的硫代氨基磷酸酯，硫代烷基氨基磷酸酯，硫代烷基磷酸三酯和硼酸磷酸酯，其2'-5'连接类似物，以及具有极性反转的那些，其中相邻的核苷单元对以3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'连接；参见美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050(各自在此引入以供参考)。基于吗啉代的寡聚化合物描述于(Braasch&Corey，2002；Heasman，2002；Lacerra等，2000；Nasevicius&Ekker，2000)和美国专利号5,034,506。(Wang等，2000a)中描述了环己烯基核酸寡核苷酸模拟物。

不包含磷原子的修饰寡核苷酸骨架具有由短链烷基或环烷基核苷间键，混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间混合键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括具有吗啉代键的那些(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物，亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；含烯烃的主链；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其他具有混合的N，O，S和CH2成分的部分；参见美国专利号：5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439(各自在本文引入以供参考)。

也可以包括一个或多个取代的糖部分，例如2'位的以下之一：OH，SH，SCH3，F，OCN，OCH3 OCH3，OCH3O(CH2)n CH3、O(CH2)n NH2或O(CH2)n CH3，其中n为1至约10；C1–C10低级烷基，烷氧基烷氧基，取代的低级烷基，烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-，S-或N-烷基；O-，S-或N-烯基；SOCH3；SO2CH 3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报道基团；嵌入剂；用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团；或用于改善寡核苷酸和具有类似性质的其他取代基的药效性质的基团。优选的修饰包括2'-甲氧基乙氧基[2'-O-CH2CH2OCH3，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)](Martin，1995)。其它优选修饰包括2'-甲氧基(2'-0-CH3),2'-丙氧基(2'-OCH2 CH2CH3)和2'-氟(2'-F)。也可以在寡核苷酸的其他位置，特别是在3'末端核苷酸的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置进行类似的修饰。寡核苷酸还可以具有糖模拟物，例如取代戊呋喃糖基的环丁基。

抑制性核酸还可以额外或替代地包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用的“未修饰的”或“天然”核碱基包括腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括仅在天然核酸中很少或瞬间出现的核碱基，例如次黄嘌呤，6-甲基腺嘌呤，5-Me嘧啶，特别是5-甲基胞嘧啶(也称为5-甲基-2'脱氧胞嘧啶，通常在本领域称作5-Me-C)，5-羟甲基胞嘧啶(HMC)，糖基HMC和龙胆二糖基HMC，以及合成的核碱基，例如2-氨基腺嘌呤，2-(甲基氨基)腺嘌呤，2-(咪唑基烷基)腺嘌呤，2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其他杂取代的烷基腺嘌呤，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-羟甲基尿嘧啶，8-氮杂鸟嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤，N6(6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。见Kornberg,A.,DNA Replication,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,1980,pp75-77；和(Gebeyehu等,1987)。也可以包括本领域已知的“通用”碱基，例如肌苷。已显示5-Me-C取代可将核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃(anghvi,Y.S.,in Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)，是目前优选的碱基取代。

给定寡核苷酸中的所有位置不必均一地修饰，并且实际上可以将多个上述修饰中的一个以上掺入单个寡核苷酸中，或者甚至在寡核苷酸内的单个核苷内。

在一些实施方案中，核苷酸单元的糖和核苷间键合，即骨架，都被新的基团取代。维持碱基单元以与适当的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物，已显示出具有优异的杂交特性的寡核苷酸模拟物，被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含酰胺的骨架例如氨基乙基甘氨酸骨架取代。核碱基被保留并直接或间接结合到骨架酰胺部分的氮杂氮原子上。教导PNA化合物制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262，其各自通过引用并入本文。PNA化合物的进一步教导可以在(Nielsen等，1991)中找到。

抑制性核酸还可以包括一个或多个核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用的“未修饰的”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基：腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，和嘧啶碱基：胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其他合成的和天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假-尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代，特别是5-溴，5-三氟甲基等5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基奎宁和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤，3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。

此外，核碱基包括在以下文献中公开的那些：美国专利号3,687,808,在'TheConcise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering'(《聚合物科学和工程简明百科全书》),858-859页,Kroschwitz,J.I.,编John Wiley&Sons,1990公开的那些,Englisch等,Angewandle Chemie,国际版',1991,30,pp.613公开的那些,以及Sanghvi,Y.S.,15章,反义研究和应用，pp.289-302,Crooke,S.T.和Lebleu,B.ea.,CRC Press,1993公开的那些。这些核碱基中的某些对于增加本发明的寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2，N-6和O-6取代的嘌呤，其包含2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶取代可将核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,在Crooke,S.T.和Lebleu,B.,编的“Antisense Researchand Applications”(反义研究及应用),CRC出版社(CRC Press),Boca Raton,1993,pp.276-278)，是目前优选的碱基取代，当与2-O-甲氧基乙基糖修饰组合时尤其优选。修饰的核碱基如以下所述：美国专利号3,687,808,以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,750,692,和5,681,941(各自在此引入以供参考).

在一些实施方案中，抑制性核酸与增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或缀合物化学连接。这些部分包括但不限于脂类部分，例如胆固醇部分(Letsinger等,1989),胆酸(Manoharan等,1994),硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等,1992；Manoharan等,1993),硫代胆固醇(Oberhauser&Wagner,1992),脂肪链例如十二烷二醇或十一烷基残基(Kabanov等,1990；Svinarchuk等,1993),磷脂，例如二-十六烷基外消旋甘油或1,2-二-O-十六烷基外消旋甘油-3-H-磷脂三乙基铵(Manoharan等,1995；Shea等,1990),聚胺或聚乙二醇链(Mancharan等,Nucleosides&Nucleotides 14:969-973,1995),或金刚烷乙酸(Manoharan等,1995),棕榈酰基部分(Mishra等,1995),或十八烷胺或己基氨基-羰基-叔氧基胆固醇部分(Crooke等,1996)。还可参见美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941(各自在本文引入以供参考)。

这些部分或缀合物可包括与官能团例如伯或仲羟基共价结合的缀合基团。本发明的缀合基团包括嵌入剂，报道分子，聚胺，聚酰胺，聚乙二醇，聚醚，增强寡聚物的药效学性质的基团和增强寡聚物的药代动力学性质的基团。典型的缀合基团包括胆固醇，脂类，磷脂，生物素，吩嗪，叶酸，菲啶，蒽醌，吖啶，荧光素，罗丹明，香豆素和染料。在本发明的上下文中，增强药效学性质的基团包括改善摄取，增强对降解的抗性和/或增强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本发明的上下文中，增强药代动力学性质的基团包括改善本发明化合物的摄取，分布，代谢或排泄的基团。代表性缀合基团公开于国际专利申请号PCT/US92/09196,于1992年10月23日提交，和美国专利号6,287,860,其引入本文以供参考。缀合部分包括但不限于脂类部分，例如胆固醇部分,胆酸,硫醚，例如己基-5-三苯甲基硫醇,硫代胆固醇,脂肪链例如十二烷二醇或十一烷基残基,磷脂，例如二-十六烷基外消旋甘油或1,2-二-O-十六烷基外消旋甘油-3-H-磷脂三乙基铵,聚胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸,棕榈酰基部分,或十八烷胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分。可参见美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941(各自在此引入以供参考)。

可用于本发明方法的抑制性核酸与靶miRNA充分互补，即，充分良好地杂交并具有足够的特异性，以产生所需的效果。“互补的”是指通过氢键在包含天然或非天然存在的碱基或其类似物的两个序列之间配对的能力。例如，如果抑制性核酸在一个位置的碱基能够与miRNA对应位置的碱基氢键键合，则认为该碱基在该位置处彼此互补。在一些实施方式中，不需要100％互补。在一些实施方式中，需要100％互补。可以使用常规方法来设计以足够的特异性结合靶序列的抑制性核酸。

尽管本文阐述了某些示例性靶片段的具体序列，但是本领域技术人员将认识到，这些序列用于举例说明和描述本发明范围内的特定实施方案。鉴于本公开，本领域普通技术人员可以容易地识别其他目标片段。长度为5、6、7、8、9、10或10个以上核苷酸的靶片段，包括在种子序列内或与其紧邻的至少五(5)个连续核苷酸的片段，也被认为也适用于靶向。在一些实施方案中，靶片段可以包括包含来自种子序列的5'末端的至少5个连续核苷酸的序列(其余核苷酸是同一RNA的连续片段，从种子序列5'端的上游开始，一直持续到抑制性核酸含有约5至约30个核苷酸为止)。在一些实施方案中，靶片段由RNA序列表示，所述RNA序列包含来自种子序列之一的3'-末端的至少5个连续核苷酸(其余核苷酸是相同miRNA紧接在3'下游开始的连续片段。片段的末端并持续直到抑制性核酸含有约5至约30个核苷酸)。配备本文提供的序列的本领域技术人员将能够在无需过度实验的情况下识别出要靶向的其他优选区域。在一些实施方案中，抑制性核酸包含与靶标内至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸互补的序列(例如，靶标miRNA，例如成熟或前体miR-181，或靶标mRNA)。

一旦鉴定出一个或多个靶区域，区段或位点，就选择与靶标充分互补的抑制性核酸化合物，即与靶标充分杂交并具有足够特异性(即基本上不与其他非靶RNA结合)，以达到理想的效果。在本发明的上下文中，杂交是指互补核苷或核苷酸碱基之间的氢键，其可以是Watson-Crick，Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键而配对的互补核碱基。如本文所用，互补是指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸特定位置的核苷酸能够与miRNA分子或mRNA分子的相同位置的核苷酸氢键合，则认为抑制性核酸和该miRNA或mRNA在那个位置彼此互补。当每个分子中足够数量的相应位置被可彼此氢键结合的核苷酸占据时，抑制性核酸与该miRNA或mRNA彼此互补。因此，“可特异性杂交的”和“互补的”是用于表示足够程度的互补性或精确配对的术语，从而在抑制性核酸和miRNA靶标之间发生稳定和特异性的结合。例如，如果抑制性核酸在一个位置的碱基能够与miRNA或mRNA对应位置的碱基氢键键合，则认为该碱基在该位置处彼此互补。不需要100％的互补性。

本领域中应理解，互补核酸序列的可特异性杂交并不要求其与靶核酸的序列100％互补。当序列与靶标miRNA或mRNA分子的结合干扰靶标miRNA或mRNA的正常功能从而导致表达或活性丧失时，用于本方法目的的互补核酸序列可特异性杂交，并且存在足够程度的互补性，以避免在需要特异性结合的条件下，例如在体内测定或治疗的生理条件下，在体外测定的情况下在适当的严格条件下进行测定的条件下，序列与非靶RNA序列的非特异性结合。例如，严格的盐浓度通常为小于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选小于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，更优选小于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。在没有有机溶剂(例如甲酰胺)的情况下可以获得低严格度的杂交，而在至少约35％的甲酰胺，更优选至少约50％的甲酰胺的存在下可以获得高严格度杂交。严格的温度条件通常将包括至少约30℃，更优选至少约37℃，最优选至少约42℃的温度。可变的其他参数，例如杂交时间，去污剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS))的浓度以及载体DNA的包含或排除，是本领域技术人员众所周知的。根据需要组合这些各种条件来实现各种严格程度。在一个优选的实施方案中，杂交将在30℃在750mM NaCl，75mM柠檬酸三钠和1％SDS中进行。在一个更优选的实施方案中，杂交将在37℃下在500mM NaCl，50mM柠檬酸三钠，1％SDS，35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精DNA(ssDNA)中进行。在一个最优选的实施方案中，杂交将在42℃下在250mM NaCl，25mM柠檬酸三钠，1％SDS，50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中进行。在这些条件下有用的变化对于本领域技术人员将是显而易见的。

对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤的严格性也将会有所不同。洗涤严格条件可以通过盐浓度和温度来限定。如上所述，可以通过降低盐浓度或通过提高温度来提高洗涤严格性。例如，洗涤步骤的严格盐浓度可为优选小于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，最优选小于约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件通常将包括至少约25℃，更优选至少约42℃，和甚至更优选至少约68℃的温度。在一个优选的实施方案中，洗涤步骤将在25℃在30mM NaCl，3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。在一个更优选的实施方案中，洗涤步骤将在42℃在15mM NaCl，1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。在一个更优选的实施方案中，洗涤步骤将在68℃在15mM NaCl，1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。对这些条件的其它变化对于本领域技术人员将是显而易见的。杂交技术对于本领域技术人员是熟知的，例如在以下所述：{Benton,1977；Grunstein,1975和Ausubel等.(《分子生物学最新方法》(Current Protocols in Molecular Biology),Wiley Interscience出版公司,纽约(New York),2001)；Berger和Kimmel(《分子克隆技术指南》(Guide to Molecular CloningTechniques),1987,学术出版社(Academic Press,纽约)；和Sambrook等,《分子克隆实验手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),纽约冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York)。

通常，可用于本文描述的方法的抑制性核酸与靶核酸内的靶区域具有至少80％的序列互补性，例如与miRNA内的靶区域具有90％，95％或100％的序列互补性。例如，其中反义寡核苷酸的20个核碱基中的18个是互补的并且因此可与靶区域特异性杂交的反义化合物将具有90％的互补性。抑制性核酸与靶核酸区域的互补性百分数可使用碱基局部比对搜索工具(BLAST程序)常规确定(Altschul，1990；Zhang，1997)。通过常规实验鉴定与miRNA或mRNA杂交的本发明的反义和其他化合物。通常，抑制性核酸必须保留对其靶标的特异性，即，不得与预期靶标以外的转录本直接结合或直接显著影响其表达水平，其中所述预期靶标可以是一种或多种属于同一家族或不同家族的miRNA。

对于抑制性核酸的进一步公开，可参见US2010/0317718(反义寡聚物)；US2010/0249052(双链核酸(dsRNA))；US2009/0181914和US2010/0234451(LNA)；US2007/0191294(siRNA类似物)；US2008/0249039(修饰的siRNA)；和WO2010/129746和WO2010/040112(抑制性核酸)。

反义

反义寡核苷酸通常被设计成通过与靶标结合并在转录，翻译或剪接水平上停止表达来阻断DNA或RNA靶标的表达。本发明的反义寡核苷酸是设计成在严格条件下与靶标微小RNA或靶标炎症标记物mRNA杂交的互补核酸序列。因此，选择与靶标充分互补的寡核苷酸，即充分杂交并具有足够特异性以产生所需效果的寡核苷酸。

修饰的碱基/锁核酸(LNA)

在一些实施方案中，本文所述方法中使用的抑制性核酸包含一个或多个修饰的键或碱基。修饰的碱基包括硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，肽核酸或锁核酸(LNA)分子。

LNA是修饰的核糖核苷酸，其在核糖糖部分的2'和4'碳之间包含一个额外的桥，导致“锁”构象，从而增强了热稳定性。因此，LNA包括一类双环RNA类似物，其中糖磷酸骨架中的呋喃糖环通过引入2'-O，4'-C亚甲基桥被化学锁定在模仿N型(C3'-内)构象的RNA中。所述修饰增加了核酸酶抗性和反义寡核苷酸对其同源miRNA的结合亲和力。

优选地，修饰的核苷酸是锁核酸分子，包括α-L-LNA。LNA包含核糖核酸类似物，其中核糖环被2'-氧和4'-碳之间的亚甲基桥“锁定”，即含有至少一种/个LNA单体，即一个2'-0,4’-C-亚甲基-D-呋喃核糖基核苷酸的寡核苷酸。LNA碱基形成标准的Watson-Crick碱基对，但是锁构型增加了碱基配对反应的速率和稳定性(Jepsen等，2004)。与DNA相比，LNA与RNA碱基对的亲和力也有所提高。这些性质使得LNA特别可用作荧光原位杂交(FISH)和比较基因组杂交的探针，作为miRNA敲低工具，以及作为靶向mRNA或其他RNA(例如本文所述的miRNA和mRNA)的反义寡核苷酸。

LNA分子可以包括在每条链中包含10-30，例如12-24，例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的分子，其中链中的一条与miRNA或mRNA中的靶区域基本相同，例如，至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％或100％相同，例如具有3,2,1,或0个错配核苷酸。LNA分子可以使用本领域已知的方法化学合成。

可以使用本领域已知的任何方法设计LNA分子，许多算法是已知的，并且是市售的(例如，在互联网上，例如在exiqon.com上)。参见例如(Levin等,2006；McTigue等,2004；You等,2006)。例如，类似于用于设计反义寡核苷酸的“基因漫步”方法可用于优化LNA的抑制活性；例如，可以制备一系列跨越靶miRNA或mRNA长度的10-30个核苷酸的寡核苷酸，然后测试活性。

任选地，可以在LNA之间留下缺口,例如5-10个核苷酸或更多的缺口，以减少合成和测试的寡核苷酸的数量。GC含量优选在约30-60％之间。设计LNA的通用方针在本领域中是已知的；例如，LNA序列将与其他LNA序列非常紧密地结合，因此优选避免LNA内的显著互补性。在可能的情况下，应避免三个或更多G或C，或四个以上LNA残基的连续运行(例如，使用非常短的寡核苷酸(例如约9-10nt)可能无法实现)。在一些实施方式中，LNA是木糖-DNA。

在一些实施方案中，可以将LNA分子设计为靶向miPvNA的特定区域。例如，可以靶向特定功能区，例如包含种子序列的区域。另外或另选地，可以靶向高度保守的区域，例如，通过比对来自诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠)的不同物种的序列鉴定的区域，并寻找具有高度同一性的区域。可以使用碱基局部比对搜索工具(BLAST程序)(Altschul等，1990；Zhang&Madden，1997)(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990；Zhang和Madden，Genome Res。7：649-656，1997)，例如，使用默认参数确定同一性百分比。

其它有关LNA的信息见美国专利号6,268,490；6,734,291；6,770,748；6,794,499；7,034,133；7,053,207；7,060,809；7,084,125；和7,572,582；和美国授权前公开号2010/0267018；2010/0261175；和2010/0035968；Koshkin等,Tetrahedron 54:3607-3630,1998；Obika等,Tetrahedron Lett.39:5401-5404,1998；Jepsen等,Oligonucleotides 14:130-146,2004；Kauppinen等,Drug Disc.Today 2(3):287-290,2005；和Ponting等,Cell 136(4):629-641,2009,"锁核酸(Locked nucleic acids)"(LNAs),J Am Chem Soc.2002年5月29日；124(21):5974-82.“RNA的锁核酸(LNA)识别：LNA:RNA杂交子的NMR解析结构(Lockednucleic acid(LNA)recognition of RNA:NMR solution structures of LNA:RNAhybrids)”.Petersen M1,Bondensgaard K,Wengel J,Jacobsen JP；Handb ExpPharmacol.2006；(173):405-22.“锁核酸：RNA组学的互补RNA的高亲和力靶标(Lockednucleic acid:high-affinity targeting of complementary RNA for RNomics)”Kauppinen S1,Vester B,Wengel J.；

“作为一类新治疗剂的锁核酸(Locked nucleic acid as a novel class oftherapeutic agents)”Veedu RN1,Wengel J.Chem Biodivers.2010年3月；7(3):536-42.doi:10.1002/cbdv.200900343.“锁核酸：用于治疗应用的有希望的核酸类似物。(Locked nucleic acids:promising nucleic acid analogs for therapeuticapplications).”Veedu RN1,Wengel J.Curr Opin Mol Ther.2001年6月；3(3):239-43.；“锁核酸：用于基因功能分析和反义药物开发的有前途的分子家族(Locked nucleicacids:a promising molecular family forgene-function analysis and antisensedrug development)”.Orum H1,Wengel J.和其中引用的文献。

还参见USSN 61/412,862，其通过引用整体并入本文。

另外，反义寡核苷酸可包含肽核酸(PNA)，其包含基于肽的骨架而不是糖-磷酸骨架，例如磷酸脱氧核糖骨架被N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元的聚酰胺链取代(Fabani，MM；Abreu-Goodger，C.；Williams，D.；Lyons，PA；Torres，AG；Smith，KG；Enright，AJ；Gait，MJ；Vigorito，E.肽核酸在体内有效抑制miR-155的功能(Efficient inhibition of miR-155function in vivo by peptide nucleic acids.)，Nucleic Acids Res.2010,38，4466-4475)。反义寡核苷酸可包含一种或多种化学修饰，包括但不限于糖修饰，例如2'-O-烷基(例如2'-O-甲基，2'-O-甲氧基乙基)，2'-氟和4'硫代修饰以及骨架修饰，例如一个或多个硫代磷酸酯，吗啉代或膦酰基羧酸酯键(参见，例如，美国专利号6,693,187和7,067,641，其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，合适的反义寡核苷酸是2'-O-甲氧基乙基“缺口聚合物(gapmer)”，其在5'和3'末端均包含2'-O-甲氧基乙基修饰的核糖核苷酸，中心具有至少十个脱氧核糖核苷酸。这些“缺口聚合物”能够触发RNA酶H依赖性的RNA靶标降解机制。反义寡核苷酸的其他增强稳定性和提高功效的修饰，例如美国专利号6,838,283所述的(其通过引用整体并入本文)在本领域中是已知的，并且适用于本发明的方法。

本发明的其他反义寡核苷酸包括小RNA拉链。

用于抑制微小RNA活性的反义寡核苷酸的长度为约19至约25个核苷酸。反义寡核苷酸可包含与成熟和/或前体miRNA序列至少部分互补的序列，例如至少约75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％与成熟和/或前体miRNA序列互补。在一些实施方案中，反义寡核苷酸可以与成熟和/或前体miRNA序列基本上互补，即与靶多核苷酸序列至少约95％，96％，97％，98％或99％互补。在一个实施方案中，反义寡核苷酸包含与成熟和/或前体miRNA序列100％互补的序列。

本发明的反义核苷酸可以靶向miR-181的序列，包括但不限于miR-181a(SEQ IDNO.1)，miR-181b(SEQ ID NO.2)，miR-181c(SEQ ID NO.3)或miR-181d(SEQ ID NO.4)或其组合。

本发明优选的反义核苷酸是锁核酸，其包含与SEQ ID NO 1或3的成熟miR-181a序列至少部分互补的序列，例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％与所述miRNA序列互补并靶向miRNA 181a和/或mir-181c。

本发明还优选的反义核苷酸是锁核酸，其包含与SEQ ID NO 2或4的成熟miR-181a序列至少部分互补的序列，例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％与所述miRNA序列互补并靶向miRNA 181b和/或mir-181d。

特别优选的锁核酸包含SEQ ID No.1、2、3或4，并在一个或多个核苷酸处被修饰。

本发明的优选实施方案包括靶向mir-181a/c和miR-181b/d的LNA的组合，特别优选的实施方案包括如本文所述的LNA A(SEQ ID NO.6)和LNA B(SEQ ID NO.7)的组合。

Antagomir(安塔够妙)

在一些实施方案中，反义序列是安塔够妙(antagomir)(Krutzfeldt，J；Rajewsky，N.；Braich，R.；Rajeev，KG；Tuschl，T.；Manoharan，M.；Stoffel，M.用安塔够妙(Antagomir)在体内沉默微小RNA(Silencing of microRNAs in vivo with'antagomirs'"),Nature2005，438，685–689)。安塔够妙(Antagomir)是靶向微小RNA(例如，靶向hsa-miR-181)的化学修饰的反义寡核苷酸。例如，用于本文描述的方法的安塔够妙(antagomir)可包括充分互补以与约12至25个核苷酸，优选约15至23个核苷酸的miRNA靶序列杂交的核苷酸序列。合适地，安塔够妙(antagomir)可以是与miRNA序列至少部分互补的单链化学修饰的核糖核苷酸。安塔够妙(Antagomir)可包含一个或多个修饰的核苷酸，例如2'-O-甲基糖修饰。

通常，安塔够妙(antagomir)包括胆固醇部分，例如在3'端。在一些实施方案中，安塔够妙(antagomir)对RNA酶保护和药理性质具有各种修饰，例如增强的组织和细胞摄取。例如，除了以上针对反义寡核苷酸讨论的修饰之外，安塔够妙(antagomir)还可以具有糖和/或硫代磷酸酯骨架的全部或部分2'-0-甲基化中的一个或多个。硫代磷酸酯修饰提供针对RNA酶活性的保护，其亲脂性有助于增强组织吸收。在一些实施方案中，安塔够妙(antagomir)可包含六个硫代磷酸酯骨架修饰；两个硫代磷酸酯位于5'末端，四个位于3'末端。见例如Krutzfeldt等,Nature 438:685-689,2005；Czech,N.Engl.J.Med.354:1194-1195,2006；Robertson等,Silence 1:10,2010；Marquez和McCaffrey,Human Gene Ther.19(l):27-38,2008；van Rooij等,Circ.Res.103(9):919-928,2008；和Liu等,Int.J.Mol.Sci.9:978-999,2008。

在本方法中有用的安塔够妙(antagomir)也可以就其长度或组成安塔够妙(antagomir)的核苷酸数进行修饰。通常，为了获得最佳功能，安塔够妙(antagomir)的长度约为20-21个核苷酸，因为该尺寸与大多数成熟微小RNA的尺寸匹配。安塔够妙(Antagomir)必须保留对其靶标的特异性，即，不得与预期靶标以外的转录本直接结合或直接显著影响其表达水平。

安塔够妙(Antagomir)可与成熟/或前体miRNA序列至少约75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％互补。在一些实施方案中，安塔够妙(antagomir)可以与成熟miRNA序列基本上互补，即与靶多核苷酸序列至少约95％，96％，97％，98％或99％互补。在其他实施方案中，安塔够妙(antagomir)与成熟miRNA序列100％互补。

在一些实施方案中，抑制性核酸是有锁的并且包括胆固醇部分(例如，锁安塔够妙(antagomir))。

siRNA

在一些实施方案中，与靶miRNA或靶mRNA互补的核酸序列可以是干扰RNA，包括但不限于小干扰RNA(“siRNA”)或小发夹RNA(“shRNA”)。构建干扰RNA测定的方法是本领域熟知的。例如，干扰RNA可以由两条分开的寡核苷酸组装而成，其中一条链是正义链，另一条链是反义链，其中反义和正义链是自身互补的(即，每条链包含与另一条链内的核苷酸序列互补的核苷酸序列；例如当反义链和正义链形成双链体或双链结构时)；反义链包含与靶核酸分子或其部分(即不想要的基因)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，正义链包含与靶核酸序列或其一部分相对应的核苷酸序列。另外，从单个寡核苷酸组装干扰RNA，其中通过基于核酸或基于非核酸的接头连接自身互补的正义和反义区域。干扰RNA可以是具有双链体，不对称双链体，发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸，具有自身互补的正义和反义区，其中反义区包含与分离的靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，其中正义区域具有与靶核酸序列或其部分相对应的核苷酸序列。干扰物可以是具有两个或多个环结构以及包含自身互补的正义和反义区的茎的环状单链多核苷酸，其中反义区包含与靶核酸分子或一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，正义区具有与靶核酸序列或其一部分相对应的核苷酸序列，并且其中环状多核苷酸可以在体内或体外加工以产生能够介导RNA干扰的活性siRNA分子。

在一些实施方案中，干扰RNA编码区编码具有正义区，反义区和环区的自身互补RNA分子。此类RNA分子在表达时理想地形成“发夹”结构，并且在本文中称为“shRNA”。环区的长度通常在约2至约10个核苷酸之间。在一些实施方式中，所述环区长约6-约9个核苷酸。在一些实施方案中，正义区和反义区的长度为约15至约20个核苷酸。转录后加工后，小发夹RNA通过Dicer酶介导的切割事件被转化为siRNA，该酶是RNA酶III家族的成员。然后，siRNA能够抑制与其具有同源性的基因的表达。详见Brummelkamp等,Science 296:550-553,2002；Lee等,Nature BiotechnoL,20,500-505,2002；Miyagishi和Taira,NatureBiotechnol.20:497-500,2002；Paddison等,Genes&Dev.16:948-958,2002；Paul,NatureBiotechnol.20,505-508,2002；Sui,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,99(6):5515-5520,2002；Yu等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:6047-6052,2002。

miRNA海绵

MiRNA海绵或诱饵(Ebert等.,Nat Methods.2007年9月；4(9):721-6.Epub2007年8月12日.miRNA海绵构建物的产生(Generation of miRNA sponge constructs).Kluiver,J.,Slezak-Prochazka,I.,Smigielska-Czepiel,K.,Halsema,N.,Kroesen,B.J.,和Ankevan den Berg.Methods–2012年7月23日.电子出版提前于印刷.；F.C.Tay,等.,“使用人造microRNA海绵实现癌细胞中microRNA的功能丧失”(Using artificial microRNA spongesto achieve microRNA loss-of-function in cancer cells),Adv.Drug Deliv.Rev.(2014))是体内表达的转录本，其包含多个高亲和力的miRNA反义结合位点(MBS)，这些位点模仿在mRNA中发现并与要靶向的miRNA互补的转录本；这些转录本可以有效隔绝特定的miRNA，从而防止其与内源性靶基因结合。这些结合位点通常是相同位点的串联重复序列，设计为靶向单特异性miRNA或具有相同种子区的miRNA家族成员；考虑到微小RNA与靶标之间的相互作用取决于种子区域(微小RNA的2-8位)中的碱基配对，因此诱饵靶标应与微小RNA种子家族的所有成员相互作用。如此，其应该比反义寡核苷酸更好地抑制微小RNA的功能类别，反义寡核苷酸被认为可以阻断单条微小RNA序列。

例如在Ebert MS,Neilson JR,Sharp PA(2007)“MicroRNA海绵：哺乳动物细胞中小RNA的竞争性抑制剂”(MicroRNA sponges:competitive inhibitors of small RNAs inmammalian cells).Nat Methods 4:721-72”和Kluiver J,Slezak-Prochazka I,Smigielska-Czepiel K,Halsema N,Kroesen BJ,van den Berg A(2012)“miRNA海绵构建体的生成”(Generation of miRNA sponge constructs)Methods 58:113-117中公开了miRNA海绵或诱饵的设计。

海绵序列通常由被4-6个核苷酸长的间隔序列隔开的多个miRNA结合位点(MBS)组成。MBS优选是完全反义的，或者在中央位置带有凸起。但是，完美碱基配对的miRNA-海绵相互作用很容易受到Ago2介导的切割作用，因此，据报道，含有4个核苷酸中央凸起的MBS更有效。MiRNA海绵具有抑制所有种子家族成员的优势，而且当引入多个MBS时，可用于抑制整个miRNA簇。鉴于其与其他抑制miRNA的方法相比的优势，miRNA海绵具有用于疾病治疗的潜力(Ebert MS等人，Nat Methods 2007，Ebert MS和Sharp PA，RNA 2010，Liu Z等人，Int JMol Sci 2008，Kluiver J等人，Methods 2012，Kluiver等人，PLoS One 2012)，通过引用并入本文。

miRNA海绵构建体设计和脱靶测试可以使用基于Web的工具MiRNAsong：microRNASpONge生成器和测试器进行。

海绵合适地由高亲和力miRNA反义结合位点(MBS)组成，该位点包括与靶标miRNA互补的序列，以及“突出”区域，即MPS序列的核苷酸9至12中的错配区域。合适地，互补区域与靶miRNA至少75％，80％，85％，90％，95％，99％或100％相同。最优选地，互补区与靶miRNA至少80％相同。合适地，与靶miRNA序列互补的序列包括种子(SEED)序列，例如给定miRNA内对靶标转录本的识别至关重要的序列，而“突出”区域位于所述种子序列的外部。每个MBS序列(MBS SEQ)的长度与成熟靶标miRNA的长度相同。每个MBS SEQ重复数次，在6至24次之间，优选在6至12次之间，最优选6次。合适地，MPS SEQ通过由4至6个核苷酸，优选4个核苷酸组成的“间隔子”序列彼此分开。

适当地，本发明的miRNA海绵可以包含针对两个或更多个miRNA，优选相同家族内的两个或更多个miRNA，或者两个或更多个不同家族的miRNA的两个或更多个MBS序列。

适当地，包含与给定种子序列互补的MPB序列的miRNA海绵体抑制所有携带所述种子序列的miRNA。合适地，miRNA家族包含具有高度相关序列的miRNA，合适地，来自相同家族的miRNA具有相同的种子序列。

本发明的抑制剂由两个由间隔子序列隔开的MBS序列组成；合适地，这两个MBS序列可以靶向相同或不同的miRNA。

例如，miRNA抑制剂可具有下式：

(X1sX2sX3)n

其中：

X1,X2和X3独立选自：

-与miR-181a和/或miR-181c互补的MPS SEQ，优选从核苷酸9到核苷酸12经修饰以产生凸起；或者

-与miR-181b和/或miR-181d互补的MPS SEQ，优选从核苷酸9到核苷酸12经修饰以产生凸起；

X3可以存在或不存在；

S是4-6个核苷酸的间隔子序列，优选为4个核苷酸；

S2是4至6个核苷酸的中央间隔子序列，优选为6个核苷酸，优选对应于限制性内切酶位点，优选为XbaI限制性内切酶的位点。

n1和n2是独立选自3、6和24的数字，优选地在3、6和12之间，最优选地n是3，n1和n2可以相同或不同。

优选本发明的miRNA抑制剂由两条MBS序列组成，它们由下式的间隔子序列分开：

(AsB)n

其中：

A是与miR-181a和/或miR-181c互补的MPS SEQ，优选从核苷酸9到核苷酸12经修饰以产生凸起；

B是与miR-181b和/或miR-181d互补的MPS SEQ，优选从核苷酸9到核苷酸12经修饰以产生凸起；

S是4-6个核苷酸的间隔子序列，优选为4个核苷酸；

S2是4至6个核苷酸的中央间隔子序列，优选为6个核苷酸，优选对应于限制性内切酶位点，优选为XbaI限制性内切酶的位点。

n1和n2是独立选自3、6和24的数字，优选地在3、6和12之间，最优选地n是3，n1和n2可以相同或不同。

优选X1,X2,X3,A是3’TTGTAAGT

其中根据IUPAC命名学

V＝A或C或G

H＝A或C或T

D＝A或G或T

更优选X1,X2,X3,B是3’TTGTAAGT

其中根据IUPAC命名学

B＝C或G或T

D＝A或G或T

H＝A或C或T

仍优选地n

优选S由4个核苷酸组成，优选S＝tagc；

还优选S2由6个核苷酸组成，优选S2＝Tctaga。

合适地，在一些实施方案中，miR-181的抑制剂是化学修饰的反义寡核苷酸，合适地是LNA，RNA抑制剂，例如包含与miR-181a和/或miR-181b的成熟序列或它们的组合基本互补的序列的安塔够妙(antagomir)或miRNA海绵。

如本文所用，“基本上互补”是指与靶多核苷酸序列(例如，成熟或前体miRNA序列)至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％互补的序列。

反义寡核苷酸可包含与前体miRNA序列(前-miRNA)基本互补的序列。反义寡核苷酸包含与位于前-miRNA序列的茎环区域外部的序列基本互补的序列。本发明的反义寡核苷酸合适地与成熟miRNA序列互补。

siRNA引导的靶RNA切割反应具有高度的序列特异性。通常，抑制所优选的是含有与靶核酸的一部分相同的核苷酸序列的siRNA(即，包含靶miRNA或mRNA的种子序列的靶区域)。然而，实施本发明不需要siRNA和靶基因之间100％的序列相同性。因此，本发明具有能够耐受由于遗传突变，菌株多态性或进化差异而可能预期的序列变异的优点。例如，还发现相对于靶序列具有插入，缺失和单点突变的siRNA序列对于抑制是有效的。另外,具有核苷酸类似物取代或插入的siRNA序列也可以有效用于抑制。一般而言,siRNA必须保留对其靶标的特异性，即，不得与预期靶标以外的转录本直接结合或直接显著影响其表达水平。

miRNA，miRNA模拟物或miRNA抑制剂的“治疗有效剂量或量”是指当按本文所述给药时可引起积极治疗反应的量，例如提高特定miR-181靶标的mRNA水平，改善线粒体功能和/或线粒体数目增加，氧化应激减少和细胞死亡并改善细胞存活率。

核酶

也可以使用反式切割的酶性核酸分子；其已显示出有望作为人类疾病的治疗剂(Usman&McSwiggen,Ann.Rep.Med.Chem.30:285-294,1995；Christoffersen和Marr,J.Med.Chem.38:2023-2037,1995)。可以设计酶性核酸分子以在细胞RNA的背景内切割特定的miRNA或mRNA靶标。这种切割事件使miRNA或mRNA失去功能。

通常，具有RNA切割活性的酶性核酸通过首先结合靶RNA而起作用。这样的结合通过酶性核酸的靶标结合部分发生，该酶性核酸与切割靶RNA的分子的酶部分紧密靠近。因此，酶性核酸首先通过互补碱基配对识别然后结合靶RNA，且一旦结合到正确的位点，就以酶促作用切割靶RNA。此类靶RNA的策略性切割将破坏其活性。酶性核酸结合并切割其RNA靶标后，会从该RNA中释放出来以寻找另一个靶标，并可以重复结合并切割新的靶标。

诸如体外选择(进化)策略的若干种方法(Orgel，Proc.R.Soc.London，B 205：435，1979)已被用于开发能够催化多种反应的新核酸催化剂，所述核酸反应例如裂解和连接磷酸二酯键和酰胺键，,(Joyce,Gene,82,83-87,1989；Beaudry等,Science 257,635-641,1992；Joyce,Scientific American 267,90-97,1992；Breaker等,TIBTECH 12:268,1994；Barrel等,Science 261:1411-1418,1993；Szostak,TIBS 17,89-93,1993；Kumar等,FASEBJ.,9:1183,1995；Breaker,Curr.Op.Biotech.,1:442,1996)。对于催化活性而言最佳的核酶的开发将对采用RNA切割性核酶以调节基因表达的任何策略做出重大贡献。例如，在饱和(10mM)浓度的Mg

抑制性核酸制备和使用

可以从多种来源分离，一般基因工程改造，扩增，和/或表达/重组产生用于实施本文所述方法的核酸序列，无论是RNA，cDNA，基因组DNA，载体，病毒还是其杂合子。

可以单独分离或克隆重组核酸序列，并测试所需活性。可以使用任何重组表达系统，包括例如体外，细菌，真菌，哺乳动物，酵母，昆虫或植物细胞表达系统。可将本发明的核酸序列(例如，本文所述的任何抑制性核酸或正义核酸)插入递送载体中并从载体内的转录单位表达。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。载体构建物的产生可使用本领域熟知的任何合适的基因工程技术来完成，包括但不限于PCR标准技术，寡核苷酸合成，限制性内切核酸酶消化，连接，转化，质粒纯化和DNA测序，例如如下中所述:Sambrook等，(1989.《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual).冷泉港实验室出版社，纽约),Coffin等(《逆转录病毒》(Retroviruses).冷泉港实验室出版社，纽约(1997))和《RNA病毒：实践方法》(RNA Viruses:A Practical Approach)(Alan J.Cann,编，牛津大学出版社(2000)。

对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，可用多种合适的载体将本发明的核酸转移到细胞中。选择合适的载体以递送核酸和优化用于将所选择的表达载体插入细胞中的条件，这在本领域普通技术人员的范围内，而无需过度的实验。病毒载体包含具有在包装细胞中产生重组病毒的序列的核苷酸序列。可以基于病毒骨架构建表达本发明核酸的病毒载体，所述病毒骨架包括但不限于逆转录病毒，慢病毒，疱疹病毒，腺病毒，腺相关病毒，痘病毒或α病毒。能够表达本发明的核酸的重组载体(例如，病毒载体)可以如本文所述地递送，并且在靶细胞(例如，稳定的转化体)中持续存在。例如，可以将这种重组载体(例如，导致与hsa-miR-155互补的反义寡聚物表达的重组载体)施用于(例如注射或输注入)对象的脑脊髓液(例如，颅内注射，实质内注射，脑室内注射和鞘内注射，参见例如Bergen等人，Pharmaceutical Res.25：983-998，2007)。用于表达本文所述的任何核酸的许多示例性重组病毒载体也描述于Bergen等{同上)。重组病毒载体的其它例子是本领域已知的。

本文提供的核酸(例如，抑制性核酸)可以进一步与一种或多种阳离子聚合物(例如，聚-L-赖氨酸和聚(乙烯亚胺)，阳离子脂质(例如，1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)，N-甲基-4-(二油酰基)甲基吡啶和3P-[N-(N'，N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇)和/或纳米颗粒(例如阳离子聚氰基丙烯酸丁酯纳米颗粒，二氧化硅纳米颗粒或基于聚乙二醇的纳米颗粒)复合，然后给予对象(例如注射或输注至对象的脑脊髓液中)。用于核酸的治疗性递送的阳离子聚合物、阳离子脂质和纳米颗粒的其他实例是本领域已知的。鞘内注射聚乙烯亚胺/DNA复合物后，也显示出核酸的治疗性递送(Wang等，Mol.Ther.12：314-320，2005)。本文所述的用于递送核酸的方法是非限制性的。用于将核酸治疗性递送至对象的其他方法是本领域已知的。

在一些实施方案中，抑制性核酸(例如，靶向hsa-miR-155的一种或多种抑制性核酸)可以全身性(例如，静脉内，动脉内，肌内，皮下或腹膜内)或鞘内(例如，硬膜外施用)施用。在一些实施方案中，抑制性核酸在一种或多种阳离子脂质的组合物中(例如与之复合)施用。可用于施用一种或多种抑制性核酸(例如本文所述的任何抑制性核酸)的阳离子脂质的非限制性实例包括：Lipofectamine，WO 97/045069中所述的阳离子脂质分子，以及美国专利申请公开号2012/0021044、2012/0015865、2011/0305769、2011/0262527、2011/0229581、2010/0305198、2010/0203112和2010/0104629(其每一个都通过引用并入本文)。用于实施本发明的核酸序列可以通过众所周知的化学合成技术在体外合成，如例如以下所述：Adams,J.Am.Chem.Soc.105:661,1983；Belousov,Nucleic Acids Res.25:3440-3444,1997；Frenkel,Free Radic.Biol.Med.19:373-380,1995；Blommers,Biochemistry 33:7886-7896,1994；Narang,Meth.Enzymol.68:90,1994；Brown,Meth.Enzymol.68:109,1979；Beaucage,Tetra.Lett.22:1859,1981；和美国专利号4,458,066。

可以通过例如引入修饰，如核苷酸修饰使本发明的核酸序列稳定，以防止核酸降解。例如，本发明的核酸序列在核苷酸序列的5'或3'端至少包括第一，第二或第三核苷酸间键合的硫代磷酸酯。作为另一个实例，核酸序列可以包含2'-修饰的核苷酸，例如2'-脱氧，2'-脱氧-2'-氟，2<*>-0-甲基,2<*>-0-甲氧基乙基(2<*>-0-MOE),2<*>-0-氨基丙基(2<*>-0-AP),2<*>-0-二甲基氨基乙基(2<*>-0-DMAOE),2<*>-0-二甲基氨基丙基(2<*>-0-DMAP),2<*>-0-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-0-DMAEOE),或2'-0～N-甲基乙酰氨基(2'-0～NMA)。作为另一实例，核酸序列可包含至少一个2'-0-甲基修饰的核苷酸，并且在一些实施方案中，所有核苷酸均包含2'-0-甲基修饰。在一些实施方案中，核酸被“锁定”，即包含核酸类似物，其中核糖环被连接2'-0原子和4'-C原子的亚甲基桥“锁定”(参见，例如，Kaupinnen等人，Drug Disc.Today 2(3)：287-290，2005；Koshkin等人，J.Am.Chem.Soc，120(50)：13252-13253，1998)。对于其他修饰，请参见US 2010/0004320，US 2009/0298916和US 2009/0143326(将其各自通过引用以供参考)。

用于实施本发明的核酸操纵技术，例如，亚克隆，标记性探针(例如，使用Klenow聚合酶的随机引物标记，切口翻译，扩增)，测序，杂交等，在科学和专利文献均有详细描述，请参见例如Sambrook等.,分子克隆：实验手册，第三版(2001)；《分子生物学最新方法》Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等编(John Wiley&Sons,Inc.,NewYork 2010)；Kriegler,基因转移和表达：实验手册(Gene Transfer and Expression:ALaboratory Manual)(1990)；“化学和分子生物学实验室技术：与核酸探针杂交”(Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology:HybridizationWith Nucleic Acid Probes),第I部分，“理论与核酸制备”(Theory and Nucleic AcidPreparation),Tijssen,编.Elsevier,N.Y.(1993)。

治疗方法

还提供了治疗线粒体疾病的方法，该方法包括向对象施用降低一种或多种(例如至少两种、三种、四种、五种或六种)SEQ ID No.1、2、3或4的微小RNA活性的至少一种(例如，至少两种，三种，四种，五种或六种)试剂(例如，核酸)(例如，抑制性核酸，例如，安塔够妙(antagomir))。

在一些实施方案中，向对象施用至少一种抑制性核酸，其包含与miR-181中存在的连续序列(例如，成熟或前体hsa-miR-181中存在的连续序列)互补的序列。在非限制性实施方案中，抑制性核酸可以是反义寡核苷酸，核酶，siRNA或安塔够妙(antagomir)。在一些实施方案中，将至少一种抑制性核酸注射入对象的脑脊髓液中。在一些实施方案中，所述注射是颅内注射或鞘内注射。在一些实施方案中，至少一种抑制性核酸与一种或多种阳离子聚合物和/或阳离子脂质(例如，本文所述或本领域已知的任何阳离子聚合物)复合。可以使用本领域已知的方法设计降低特定靶miRNA(例如，miR-181)的表达和/或活性的安塔够妙(antagomir)(参见，例如，Krutzfeld等，Nature 438：685-689，2005)。本文描述了用于设计和制备安塔够妙(antagomir)和其他类型的抑制性核酸的其他示例性方法。

在一些实施方案中，降低miR-181水平的抑制性核酸是antogmir-181LNA序列。Obad等人，Nature Genetics 43：371-378，2011中介绍了设计靶向微小RNA分子的安塔够妙(Antagomir)的方法。用于降低miR-181的水平或表达的其他抑制性核酸如Worm等，NucleicAcids Res.37：5784-5792，2009和Murugaiyan等人，J.Immunol.187：2213-2221，2011中描述。

可以给对象施用至少一剂(例如，至少2、3、4或5剂)剂量的试剂(例如，一种或多种抑制性核酸)。所述试剂(例如，一种或多种抑制性核酸)可以每天至少一次(例如，一天两次，一天三次和一天四次)，每周至少一次(例如，每周两次，每周三次，每周四次)和/或每月至少一次对对象施用。可以对对象进行延长时间段(例如，至少一个月，两个月，六个月，一年，两年，三年，四年或五年)的治疗(例如，定期给予该药剂)。如本文中详细描述的，待施用于对象的药剂剂量可以由医师通过考虑许多生理因素来确定，所述生理因素包括但不限于对象的性别，对象的体重，对象的年龄，以及所存在的其他医疗状况。可以通过口服，静脉内，动脉内，皮下，肌内，颅内(注射到脑脊髓液中)或通过眼内注射(玻璃体内或视网膜下注射)将该试剂施用给对象。类似地，药剂可以配制成固体(例如用于口服给药)或生理上可接受的液体载体(例如，盐水)(例如，用于静脉内，动脉内，皮下，肌内，脑脊髓(鞘内)，颅内，玻璃体内或视网膜下给药)。在一些实施方案中，试剂(例如，一种或多种抑制性核酸)可以通过注射施用或可以在一段时间内通过输注施用。

在本文中描述了要给予对象以治疗线粒体疾病的药剂，并且可以以任何组合使用(例如，至少一种，两种，三种，四种或五种药剂的任何组合的药剂或如下所述的药剂类别)

本发明的疾病

本发明要治疗和/或预防的疾病包括例如PMD，包括Leigh综合征，Leber遗传性视神经病变(LHON)，线粒体肌病，脑病，乳酸性酸中毒和中风综合征(MELAS)，肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(MERRF)，进行性眼外肌麻痹(PEO)，皮尔逊氏综合征，母体遗传性肌病和心肌病(MIMyCA)，凯氏视神经病变，共济失调性神经病变和色素性视网膜炎(NARP)，常染色体显性视神经萎缩，Kearns-Sayre综合征，伴有参差不齐的红纤维的肌阵挛性癫痫(MERRF)综合征；SMD，包括Friedreich氏共济失调，遗传性痉挛性截瘫，腓骨肌萎缩症；与线粒体功能障碍有关的影响中枢神经系统和/或眼相关的神经退行性疾病：包括散发的与年龄相关的神经退行性疾病，例如帕金森氏病(PD)，阿尔茨海默氏病(AD)，年龄相关性黄斑变性(AMD)，糖尿病性视网膜病变，青光眼；家族性神经退行性疾病，包括家族性PD，AD，亨廷顿氏病，色素性视网膜炎(RP)，斯塔加特氏病。

LHON是线粒体视神经病变的一种非综合征形式，其特征是RGS变性导致中央视力丧失。它是最常见的线粒体疾病之一(患病率1：30000)，通常发生在15至35岁之间。与其他MD相似，LHON具有高遗传异质性特征，因为它是由线粒体基因组(mtDNA)编码的多个基因中的点突变引起的。在大约95％的LHON患者中，突变位于ND1，ND4或ND6基因中，这些基因编码复合物I亚基(Carelli，2004；Meyerson，2015)。

具有线性皮肤缺损的小眼畸形(MLS)综合征是一种X染色体相关的神经发育障碍，特征在于杂合子雌性的小眼症，脑部异常和皮肤缺陷，以及半合子雄性的宫内死亡(Indrieri，2016)。该疾病归因于MRC关键参与者的突变，例如参与复合物III功能的全细胞色素c型合酶(HCCS)(Bernard等，2003；Indrieri等，2013；Wimplinger等，2006)，和COX7B，细胞色素c氧化酶的亚基7B(MRC复合物IV)(Indrieri等，2012)。

视紫红质基因的突变是显性和隐性视网膜色素变性(RP)的病因，约占所有病例的10％。因此，显性视紫红质突变体是功能获得性突变体或显性负突变体。划分成几类：I类，定位于细胞质膜并结合11-顺-视黄醛以形成具有光谱活性的视紫红质的能力类似于野生型(wt)视蛋白；II类，可能在蛋白质折叠和/或稳定性方面存在缺陷，在粗面内质网中异常积累，不能像wt视蛋白一样有效地转运到细胞质膜上，并且无法结合11-顺式视黄醛形成具有光谱活性的光色素；III类，组成型激活转导蛋白。

I类突变体中包括那些影响羧基末端附近的脯氨酸347的突变体。该残基在所有已知的视觉色素中都是保守的。在RP患者中已鉴定出六个不同的错义突变影响此残基，表明脯氨酸347介导了视紫红质的某些重要功能。

递送方法

在某些实施方案中，从载体体内表达miR-181的抑制剂。“载体”是物质的组合，其可以用于将感兴趣的核酸递送至细胞内部。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸，与离子或两亲性化合物结合的多核苷酸，质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体，腺相关病毒(AAV)载体，逆转录病毒载体，慢病毒载体等。可以在活细胞中复制表达构建体，也可以合成制备。出于本申请的目的，术语“表达构建体”，“表达载体”和“载体”可互换使用，以一般说明性的意义说明本发明的应用，而不是意图限制本发明。

在一个实施方案中，用于miR-181抑制剂的表达载体包含与编码miR-181抑制剂的多核苷酸“可操作性连接”的启动子。本文使用的短语“可操作地连接”或“在转录控制下”是指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶的转录开始和多核苷酸的表达。

特别优选的病毒载体是AAV载体，合适的是AAV9，AAV5和AAV2载体(例如AAV2/2，AAV2/8，AAV2/7m8，AAV2/9，AAV2/PhP.B)。

本发明优选的启动子是遍在启动子，例如驱动本发明miRNA遍在表达的启动子，例如CMV或CBA启动子；或者本发明的启动子可以是细胞或组织特异性的启动子，例如用于神经元特异性表达的a-syn启动子或例如用于感光细胞特异性表达的RHO启动子。

非病毒递送系统是由质粒和合成的(通常带正电荷)的材料组成的复合物，例如D.Ibraheem,A.Elaissari,H.Fessi,“基因治疗和DNA递送系统”(Gene therapy and DNAdelivery systems),Int.J.Pharm.459(2014)70–83(以引用方式纳入本文)中所述的脂质体、多糖、多肽和人工聚合物。一个这样的例子是基于使用磷酸二鲸蜡酯-四亚乙基五胺基聚阳离子脂质体(TEPA-PCL)的递送系统。通过该系统，miRNA以及其他核苷酸(包括miRNA海绵)通过巨胞饮作用递送到细胞中，并高效释放到细胞质中。非病毒递送系统提供了低免疫原性和低毒性的可能性，从而在提供改善的安全性方面具有吸引力。

发明具体实施方式

材料和方法

动物研究

伦理学声明：所有关于鱼和小鼠的研究均根据动物研究的机构指南进行，并根据动物实验法(第7条；D.L.116/92；协议编号：389/2015-PR)获得了意大利卫生部公共卫生、动物健康、营养和食品安全部的批准。泰莱托恩遗传与医学研究所(意大利波佐利)的机构伦理委员会事先审核并批准了所有动物治疗/处理方法。

细胞系

HeLa和SH-SY5Y细胞获自ATCC((CRM-CCL-2，CRL-2266))，并如供应商建议分别用Dulbecco改良的Eagle培养基(GIBCO)或Dulbecco改良的Eagle培养基和营养混合物F-12的1：1混合物(补充有10％FBS(SIGMA)和1％青霉素/链霉素)，维持在培养物内。

荧光素酶分析

含有miR-181a/b预测结合位点的3'UTR人序列通过PCR扩增，并插入到pGL3-tk-荧光素酶载体中。使用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene)获得含有诱变的miR-181a/b结合位点的构建体。

表I报道了引物序列。将质粒转染到HeLa细胞(PolyFect试剂，QIAGEN)中。7小时后，使用干扰素(Polyplus)用100nM miRIDIAN负模拟物或Mimic-miR-181(DHARMACON)转染细胞。24小时后，使用双重荧光素酶报告基因测定法(Promega)定量荧光素酶活性。

表I：人类3’UTR扩增和诱变的引物序列

RNA提取

在QIAzol裂解试剂(QIAGEN)中处理用于提取总RNA的组织或细胞样品。按照制造商的说明，使用RNeasy抽提试剂盒(凯杰公司)分离总RNA。

定量实时PCR

对于定量实时PCR(qRT-PCR)实验，根据制造商的说明，使用QuantiTect逆转录试剂盒(QIAGEN)生成cDNA。

qRT-PCR反应的引物被设计为跨越两个不同的外显子，从而避免扩增基因组DNA，使用计算机工具(www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html)以预测其解链温度(T

对于进食(FED)和饥饿(STARVED)条件下的分析：在缺乏营养12小时后(例如，停止供应食物12小时),对处于饥饿状态的小鼠实施安乐死，而在缺乏营养12小时和重新进食(例如重新对每个笼子提供食物)1小时后，对处于进食状态的小鼠实施安乐死。

表II：qRT-PCR分析的引物序列

SH-SY5Y转染和FCCP处理

使用Dharmafect(DHARMACON)，用100nM阴性对照miRNA抑制剂和miR-181a和miR-181b抑制剂(分别为DHARMACON IH-300552-07-0005和IH-300554-08-0005)转染SH-SY5Y细胞。

miR抑制剂是设计用于抑制内源性微小RNA活性的合成单链RNA分子。转染72小时后，用25μM FCCP(Sigma，C2920)处理SH-SY5Y细胞。FCCP处理6小时后，通过锥虫蓝染色评估细胞死亡。

ARPE细胞LNA处理

用80nM LNA阴性对照miRNA抑制剂和miR-181a(CGACAGCGTTGAATGT SEQ ID NO.6)LNA和miR-181b(CGACAGCAATGAATGT SEQ ID NO.7)LNA抑制剂(Exiqon)使用干扰素(Polyplus)转染ARPE-19细胞(CRL-2302)。转染48小时后，用100uM A2E(ACME生物科学有限公司(ACME BIOSCIENCE INC.)定制合成A2E，AB4344)处理ARPE-19细胞。A2E处理6小时后，评估细胞自发荧光。

成熟miRNA定量测定

为了对miR-181a和miR-181b进行成熟定量检测，发明人使用了水解探针(TaqMan，Applied Biosystem)。使用TaqMan微小RNA逆转录试剂盒和miRNA特异性引物，根据制造商的说明生成用于成熟miRNA分析的cDNA。通过TaqMan-PCR反应获得的来自不同处理方法的TaqMan-cDNA的定量数据以循环阈值(Ct)表示。将RNA sno234的TaqMan探针用作实验的内源对照。如“实时定量PCR”部分所述分析Ct值。每块板一式两份进行，所有结果显示为3个独立生物复本的平均值±SEM。

RNA原位杂交(ISH)

将小鼠眼睛或脑在4％PFA中固定过夜，用30％蔗糖冷冻保护并包埋在OCT中。用5μg/mL蛋白酶K处理20微米冷冻切片15分钟。用2mg/mL甘氨酸洗涤并用4％PFA/0.2％戊二醛后固定后，用50％甲酰胺，5X柠檬酸钠盐水缓冲液(SSC)和柠檬酸(pH 6)，1％十二烷基硫酸钠(SDS)，500μg/mL酵母tRNA和50μg/mL肝素预杂交切片。使用miRCURY检测的miR-181a和miR-181b锁核酸探针(Exiqon)，终浓度为30nM。42℃过夜杂交探针。在杂交温度下，用50％甲酰胺，2×SSC洗涤杂交的切片。在含有1％封闭剂(Roche)和10％绵羊血清的MABT(100mM马来酸，150mM NaCl和0.1％Tween20)中封闭切片1小时，然后与碱性磷酸酶(AP)标记的抗地高辛配基抗体(1：2000；Roche)在MABT/1％封闭剂中在4℃过夜。将切片用NBT-BCIP(ROCHE)染色，并在莱卡DM5000显微镜下拍照。

如(Carrella等，2015)所述在medakafish上进行ISH。

定量线粒体DNA含量分析

如(Viscomi等，2009)所述，使用COI基因(mtDNA)和RNaseP(核基因参照)的引物进行SYBR绿色实时PCR。从阈值循环值(ΔCt)计算mtDNA相对拷贝数，并将mtDNA拷贝数/细胞计算成2×2

蛋白质分离和蛋白质印迹(WB)

将用于总蛋白提取的组织和细胞样品在含有蛋白酶抑制剂混合物片(Roche)的RIPA缓冲液中匀浆。使用Bio-Rad蛋白质测定法(Bio-Rad)确定蛋白质提取物浓度。将每个样品中总共30μg的蛋白质上样到SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。如(Comitato等，2014)所述从没有晶状体的整眼获得线粒体和胞质提取物。将来自每个样品的线粒体和胞质部分的30μg蛋白上样到SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。对于WB，将凝胶电转印到硝酸纤维素滤膜上，并依次用以下一抗进行免疫染色：抗-p62(Abnova,克隆2C11,1:1000)；抗-LC3B(Novus,1:500)；抗-Mfn2(Abcam,ab56889,1:1000)；抗-柠檬酸合酶(Abcam,ab9660,1:1000)；抗-p115(SantaCruz,sc-48363,1:3000)；抗-Tim23(Santa Cruz,sc-13298,1:250)；抗-Ndufb11(Proteintech,1:1000)；抗-Ndufb8(Abcam,全OXPHOS啮齿类WB抗体混合物ab110413,1:250)；抗-CoxIV(细胞信号转导公司(Cell Signaling)4844,1:1000)；抗-Parkin(细胞信号转导(Cell Signaling)4211,1:500)；抗-Gapdh(Santa Cruz sc-32233,1:3000)。

用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠或抗兔IgG抗体(1：3000，GE Healthcare)，以Luminata Crescendo底物(Millipore)或Super Signal West Femto底物(ThermoScientific)根据制造商方案对感兴趣的蛋白质进行了可视化检测。使用Chemidoc-lt成像系统(UVP)获取WB图像，并使用ImageJ软件计算带强度。定量每种蛋白质染色信号，然后对同一样品中的GAPDH或p115或Ndufb8(线粒体级分)进行标准化(内部标准化)。然后将这些标准化值与对照样品中的值进行比较。仅比较同一印迹上的条带。将来自三个不同生物学重复物的标准化值的均值报告为相对倍数变化。

对于进食(FED)和饥饿(STARVED)条件下的分析：在缺乏营养物12小时后对处于饥饿状态的小鼠进行安乐死，而在缺乏营养物的12小时和重新进食1小时后，对处于进食状态的小鼠进行安乐死。

青鳉鱼和吗啉代

按照(Iwamatsu，2004)所述维持青鳉鱼(Cab株)并对其分期。先前已经描述了MO的设计，特异性和抑制效率(Carrella等，2015；Indrieri等，2013；Indrieri等，2012)。吗啉代寡聚物是封闭RNA上的位点以破坏细胞过程的高级工具。吗啉代寡聚物特异性结合其选定的靶位点，以阻止细胞组分进入该靶位点。可利用此特性来阻断翻译，阻断剪接，阻断miRNA或其靶标并阻断核酶活性。吗啉代寡聚物与天然核酸截然不同，亚甲基吗啉环取代了核糖或脱氧核糖部分，非离子二氨基磷酸酯键取代了DNA和RNA的阴离子磷酸酯。每个吗啉环适当地定位了一个标准的DNA碱基(A，C，G，T)进行配对，从而使25个碱基的吗啉代寡聚物通过华生克里克配对牢固地特异性结合到RNA链中其互补的25个碱基的靶位点上。由于吗啉代寡聚物不带电的骨架无法被酶识别，因此其对核酸酶完全稳定。将hccs-MO，cox7b-MO，miR-181a-MO和miR-181b-MO(MO-miR-181a5'-AACTCACCGACAGCGAGTTTTATATGTTC-3'SEQ IDNO.111；MO-miR-181b5'-AACCCACCGACAGCAATGAATGTTG-3'SEQ ID NO.112)分别以0.3mM，0.1mM，0.075mM和0.075mM的浓度注射到受精的单细胞青鳉鱼胚胎中。

Tunel实验

如(Indrieri等人，2013)所述，使用原位细胞死亡检测试剂盒(Roche)对st30青鳉鱼胚胎进行了完全的TUNEL测定。染色后，将胚胎包埋在BSA/明胶的混合物中，并振动切片。用Leica DM-6000显微镜分析切片，并在整个视网膜中手动计数TUNEL阳性细胞。

胱冬酶分析

在st32将二十个用于样品的胚胎去绒毛膜，并在液氮中冷冻至少24h。如先前报道的那样，使用胱冬酶-3/7-和胱冬酶-9-GLO荧光素酶试剂(Promega)对蛋白裂解物进行胱冬酶分析(Indrieri等，2013)。发射的发光信号对每个样品的蛋白质浓度进行标准化。

青鳉鱼中的药物处理

将St24胚胎去绒毛膜，并在50nM巴佛洛霉素A(SIGMA，B1793)，25μM PD98059(CellSignaling，#9900)或6μM HA14-1(SIGMA，48787)中孵育24h。将药物稀释在3％DMSO/胚胎培养基中。在3％DMSO/0.2％抗坏血酸/胚胎培养基中的500μM 6-OHDA(SIGMA，H4381)中通过将胚胎从st32培育到st38而产生PD青鳉鱼模型。培养基一天更换两次。在3％DMSO/胚胎培养基中生长对照胚胎。

青鳉鱼中的多巴胺能神经元检测

将对照和miR-181a/b-MOs DMSO或6-OHDA处理的鱼固定在4％PFA中。用10μg/ml的蛋白酶K处理鱼1小时30分钟，用2mg/ml的甘氨酸洗涤，并在4％PFA中固定20分钟。然后将胚胎与0.1％柠檬酸钠/0.1％Triton X-100在冰上孵育10分钟。与抗TH抗体(Abcam ab112，1：500)孵育过夜后，将鱼与过氧化物酶偶联的抗兔抗体(1：200；Vector Laboratories)一起孵育，然后进行二氨基联苯胺染色(DAB；Sigma)。将胚胎包埋在BSA/明胶的混合物中，并振动切片。用Leica DM-6000显微镜观察切片，并在整个青鳉鱼蓝斑核(locus coeruleus)中手动计数抗TH阳性细胞。

鱼藤酮注射

如(Heitz等，2012)报道的那样，以5mM的终浓度玻璃体内注射鱼藤酮(SIGMA，R8875-)。为了对RGC进行组织学分析，向两个月大的小鼠miR-181a/b-

NADH脱氢酶活性染色

如{Marella，2010}所述稍加改动进行NADH脱氢酶的组织化学反应。简而言之，将视网膜切片在PBS中洗涤3次，然后在含有2mg/ml硝基蓝四唑，0.5mM NADH，50mM Tris-Cl，pH 7.6的溶液中于37℃温育30分钟。将载玻片用PBS洗涤两次，并用PBS/甘油50％固定。

视动跟踪

如(Chadderton等，2013)所述，通过使用视动系统(OptoMotry；CerebralMechanics)评估注射鱼藤酮的小鼠的视敏度。

免疫荧光和免疫组化分析

为了进行免疫荧光分析，将小鼠眼睛固定在4％PFA中，用30％蔗糖冷冻保护，包埋在OCT中并冷冻切片。通过在柠檬酸钠缓冲液中煮沸或通过与1％NP40孵育15分钟以进行视锥抑制蛋白免疫染色来透化切片。使用以下一抗孵育过夜：抗-视紫红质(Abcam,ab3267,1:5000)；抗-视锥抑制蛋白(Millipore,1:1000)；抗-Pax6(Covance,1:250)；抗-GS6,(Millipore,1:100)；抗-突触融合蛋白(SIGMA1:100)；抗-NeuN(Millipore,克隆A60 1:400)；抗-CoxIV(Cell Signaling 4844,1:400)。然后将切片与Alexa Fluor二抗(1：1000；Invitrogen)一起孵育。用DAPI(Vector Laboratories)对切片进行复染。在视神经周围区域的每只眼的8个不同载玻片上对用抗NeuN抗体染色的RGC进行计数。在LSM710蔡司共聚焦显微镜下拍摄切片。

为了在小鼠中检测多巴胺能神经元，麻醉小鼠，然后在手术后30-35天后灌注4％PFA。将脑后固定在4％PFA中并进行振动切片。对中脑进行全深度(full-depth)切片，并连续收集切片。将漂浮的切片在PBS1x/FBS10％/Triton0.1％中孵育20分钟，然后在BSA0.1％/FBS10％/Triton0.1％的PBS1x溶液中孵育1小时。与抗TH抗体(Abcam ab112，1：1000)孵育过夜后，将切片与过氧化物酶偶联的抗兔抗体(1：200；Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)一起孵育，然后进行二氨基联苯胺染色(DAB；Sigma)。使用小鼠脑图谱选择所有含有SN区域的切片{Paxinos，2004}(Bregma-2.54至-3.64mm)。将覆盖整个SN范围的每第四个切片用于计数。用莱卡DM-6000显微镜观察脑切片，并在每只动物的6-OHDA注射侧和对照侧手动计数TH阳性细胞。计数TH阳性细胞的标准是其焦平面中存在其核。SN致密部是使用小鼠脑图集{Paxinos，2004}小心定义的，并且要特别注意不要包括SN的其他TH阳性区域以及腹侧被盖区域。

视网膜电图(ERG)

避光饲养小鼠3小时并麻醉。视网膜电图(ERG)由通过Ganzfeld激发器(CSO，Costruzione Strumenti Oftalmici，佛罗伦萨，意大利)产生的10毫秒闪光诱发，并如先前所述进行注册(Botta等，2016；Surace等，2005)。使用以下方案评估ERG和b波阈值。在暗适应条件下，用从-5.2到+1.3log cd*s/m

6-OHDA注射和行为分析

麻醉两个月大的雄性小鼠miR-181a/b-+/+和miR-181a/b-1

P347S小鼠是携带人脯氨酸347到丝氨酸(P347S)突变的转基因小鼠，在PMID：8943080中进行了描述。

统计学分析

将动物随机分为实验组和对照组。没有数据从分析中排除。行为和视觉测试是盲选进行的。每个图例中都标明了实验重复的次数。在所有实验中，通过事后Tukey分析，单尾或双尾斯氏t检验，通用线性模型的偏差分析或负二项式广义线性模型的偏差分析，通过单向或双向ANOVA评估组之间差异的显著性，报告于图例。p<0.05被认为是显著的。定量数据以平均值±SEM表示，p<0.05被认为是显著的。

实施例

miR-181a/b控制线粒体更新(turenover)

本发明人鉴定了PPARGC1A和NRF1，其是线粒体生物发生的主要调节剂(Finck&Kelly，2006；Wu等人，1999)，COX11和COQ10B，其参与线粒体呼吸链(MRC)的装配Carr等人，2002；Desbats等，2015)和PRDX3(一种重要的线粒体ROS清除剂)(Wonsey等人，2002年)，作为通过生物信息学搜索推定的miR-181a/b靶基因(Gennarino等人，2012年)。有趣的是，qRT-PCR分析表明，用购自Dharmacon的抑制剂沉默R-181a/b后，SH-SY5Y人成神经细胞瘤细胞中所有上述转录本的含量均增加，如下所详述(图1A)。

为了验证新预测的miR-181a/b靶标，将每个人类基因(PPARGC1A，NRF1，COX11，COQ10B和PRDX3)的3'-UTR(包括预测的miR-181靶位点)克隆到pGL3-TK-萤光素酶质粒中，位于萤光素酶报告基因编码区的下游。然后测试了转染的Mimic-miR-181影响荧光素酶活性的能力。所分析基因的3'-UTR序列的存在抑制了响应mimic-miR-181(合成双链寡核苷酸的序列与miRNA 181a和b的序列相同，模仿其功能，图1B，购自Dharmacon，方法部分中有详细说明)的荧光素酶活性。此外，每个基因3'-UTR中miR-181a/b结合位点的点突变消除了萤光素酶抑制作用，表明这些miRNA直接且特异性地靶向NRF1，COX11，COQ10B和PRDX3基因(图1B)。PPARGC1A的直接靶向未得到验证(图1B)，表明在miR-181a/b沉默后通过qRT-PCR观察到的上调(图1A)可能是间接作用的结果。

基于上述结果，本发明人推断miR-181a/b的下调能刺激线粒体生物发生，并在体内测试该猜想。在哺乳动物中，miR-181a和miR-181b分为两个簇，即miR-181a/b-1和miR-181a/b-2，分别位于不同的基因组位点中(分别为染色体1和2)。miR-181a-1和miR-181a-2的成熟形式，以及miR-181b-1和miR-181b-2的成熟形式都显示相同的序列。此外，miR-181a和miR-181b都包含相同的“种子”序列(Ji等，2009)ACAUUCA，即据信在靶标识别中起最重要作用的区域(Bartel，2009)。选择了(Henao-Mejia等，2013)中描述的具有miR-181a/b-1簇靶向缺失的小鼠模型，因为该簇构成了脑和视网膜中成熟miR-181a/b表达的大部分，如通过RNA原位杂交，Taqman分析和几种已验证的miR-181a/b靶标(例如Bcl2，Mcl1，Xiap，Atg5，Erk2和Park2)的表达证明的(Cheng等，2016；He等，2013；Hutchison等，2013；Ouyang等，2012；Rodriguez-Ortiz等，2014；Tekirdag等，2013)(图7A-D；9)。

有趣的是，通过RT-PCR观察到miR-181a/b-1

综上所述，这些结果揭示了miR-181a/b在体内通过协调线粒体的生物发生和清除在调节线粒体更新中的重要作用。

miR-181a/b抑制作用可保护神经元免受细胞死亡，并改善MLS综合征体内模型的表型

本发明人惊奇地发现miR-181a/b失活保护抵抗线粒体损伤。首先，他们测试了miR-181a/b体外下调是否能保护SH-SY5Y细胞免受FCCP(一种强效的氧化磷酸化(OXPHOS)解偶联剂)的作用：尽管有50％的对照细胞在用FCCP处理后6小时内死亡，但miR-181a/b沉默的细胞在细胞死亡程度上没有任何变化(图9)，表明miR-181a/b沉默确实可以保护细胞抵抗线粒体损伤。

本发明人进一步评估了miR-181a/b失活在两种针对稀有形式MD，具有线性皮肤缺损(MLS)的小眼症鱼模型中的线粒体介导的神经退变的体内模型中的神经保护作用。MLS是一种神经发育障碍，特征在于杂合子雌性的小眼症，脑部异常和皮肤缺陷，以及半合子雄性的宫内死亡(Indrieri，2016)。该疾病归因于MRC关键参与者的突变，例如参与复合物III功能的全细胞色素c型合酶(HCCS)(Bernard等，2003；Indrieri等，2013；Wimplinger等，2006)，和COX7B，细胞色素c氧化酶的亚基7B(MRC复合物IV)(Indrieri等，2012)。以前使用基于吗啉代(MO)的方法通过敲低hccs或cox7B表达来产生MLS的两种青鳉鱼(Oryziaslatipes)模型(Indrieri等，2013；Indrieri等，2012)。两种模型(hccs-MO和cox7b-MO)均显示出严重的小眼表型和小头表型，这是由于CNS中细胞死亡增加所致(Indrieri等，2013；Indrieri等，2012)。在青鳉鱼中，与哺乳动物对应物相比，miR-181a和b的成熟形式在序列同一性(100％)和表达模式方面都非常保守，尤其是在视网膜中(Carrella等，2015)。MO介导的青鳉鱼miR-181a/b沉默导致线粒体功能和自噬中涉及的大多数靶标水平升高(图10)。有趣的是，在两种MLS青鳉鱼模型中，miR-181a/b的下调均导致脑和眼中细胞死亡明显减少，如图2的TUNEL和胱冬酶活化试验所示。因此，miR-181a/b下调导致大约50％的hccs(图3A-C，M)和cox7B变体(morphants)(图3G-I，N)中的疾病表型得到完全挽救，而MO介导的miR-181a/b沉默没有引起任何明显的形态学改变(图11A，B)。这些数据表明，miR-181a/b的下调改善了MRC复合体III和IV缺陷模型的表型，表明miR-181a/b沉默在MLS模型中的保护作用不依赖于基因。

由于miR-181a/b调节眼中的线粒体自噬和自噬，发明人测试了所述过程是否与miR-181a/b下调介导的表型的改善有关。为此，用浓度为50nM的通用自噬抑制剂巴佛洛霉素A1(Baf-A1)处理注射了hccs-MO/miR-181a/b-MO-和cox7b-MO/miR-181a/b-MO的胚胎。该浓度能够阻止自噬而不会在对照胚胎中引起任何明显的形态异常(图11C，F)。有趣的是，Baf-A1处理在大量的hccs-MO/miR-181a/b-MO(图3D,M)和cox7b-MO/miR-181a/b-MO胚胎(图3J,N)中都消除了miR-181a/b下调的保护作用，表明自噬/线粒体自噬的增加在MLS青鳉鱼模型中显著改善了表型。

如图10所示，由于miR-181a/b下调也增加了MAPK/ERK级联反应的关键成分erk2，以及bcl2和mcl1(Bcl2抗凋亡家族成员)的mRNA水平，发明人还测试了后两种途径是否与MLS表型的改善有关。因此，发明人用PD98059(一种MAPK/ERK途径的选择性抑制剂，Alessi等，1995)或用Bcl-2蛋白抑制剂HA14-1(Wang等，2000b)处理了注射hccs-MO/miR-181a/b-MO-和cox7b-MO/miR-181a/b-MO的胚胎。。PD98059和HA14-1的使用浓度不会在对照胚胎中引起任何形态学改变[(Carrella等，2015)和图11D，E]。在这两种MLS模型中，PD98059的处理对表型拯救的程度均没有任何影响(图3E，K，M，N)，这表明MAPK途径不主要参与miR-181a/b在分析的MLS模型中下调产生的保护作用。另一方面，HA14-1显著降低了注射hccs-MO/miR-181a/b-MO的胚胎的表型拯救程度，但未降低注射cox7b-MO/miR-181a/b-MO的胚胎的表型拯救程度(图3F，L-N)。

这些数据加在一起表明，在两个模型中，自噬/线粒体自噬的增加都参与了MLS表型的改善，表明该途径在miR-181a/b下调介导的神经元保护中起着主要作用。而且，增加的bcl2水平仅在改善hccs缺陷型胚胎中起作用，这表明Bcl2介导的凋亡途径的贡献可能由于特定的线粒体缺陷而有所不同。

miR-181a/b抑制改善LHON综合征小鼠模型的表型

在药物诱导的Leber遗传性视神经病变(LHON)的小鼠模型中进一步测试了抑制miR-181a/b的功效。LHON是线粒体视神经病变的一种非综合征形式，其特征是视网膜神经节细胞(RGC)变性导致中央视力丧失。LHON代表最常见的MD形式之一，个体患病率为1：30000，发病年龄在15至35岁之间(Carelli等，2004)。与其他MD相似，LHON具有高遗传异质性特征，因为它是由线粒体基因组(mtDNA)编码的多个基因中的点突变引起的(Carelli等,2004；Meyerson等,2015)。在大约95％的LHON患者中，突变位于ND1，ND4或ND6基因中，这些基因编码复合物I亚基(Carelli等，2004；Meyerson等，2015)。玻璃体腔注射鱼藤酮(一种MRC复合物I抑制剂)会导致RGC的选择性损伤，并且注射的小鼠被认为是可靠的药物诱导的LHON模型(Carelli等，2013)。为了评估miR-181a/b的基因失活是否对鱼藤酮诱导的LHON具有保护作用，向miR-181a/b-1

miR-181a/b失活挽救Ndufs4

注射鱼藤酮的小鼠被认为是LHON的可靠模型(Carelli等，2013)。但是，后者代表了一个急性模型，其中很难剖析miR-181a/b下调发挥其保护功能的机制。因此，发明人利用了Ndufs4

为了深入了解改善miR-181a/b抑制诱导的Ndufs4

总而言之，这些数据表明miR-181a/b的下调主要是通过同时刺激线粒体自噬和线粒体生物发生来发挥其保护作用，从而导致视网膜线粒体更新的增加，最终导致线粒体形态和生化表型的改善。

miR-181a/b抑制作用在6-OHDA诱发的帕金森氏病模型中保护多巴胺能神经元

miR-181a/b在黑质(SN)和纹状体中显著表达[(Boudreau等，2014)和图10B)]，并且先前已显示在PD患者脑中其表达上调。使用神经毒素6-羟基多巴胺(6-OHDA)评价了miR-181a/b失活在鱼和小鼠药物诱导的PD模型中的作用。6-OHDA诱导鱼类(Parng等，2007)和小鼠(Jagmag等，2015)的黑质纹状体多巴胺能(DA)神经元选择性死亡，并广泛用于研究PD中的运动和生化功能障碍。在青鳉鱼中，脑中miR-181a和miR-181b表达是保守的，在硬骨鱼DA神经元成簇处的蓝斑核中有很强的信号(图8A)。如酪氨酸羟化酶(TH)免疫染色和计数所示，在对照的青鳉鱼幼体中，6-OHDA处理导致蓝斑中约30％的DA神经元丢失(图8B，C，E)。相反，如[39]所述注射miR-181a/b MO(MO-miR-181a 5′-AACTCACCGACAGCGTTGAATGTTC-3’SEQID NO.111；MO-miR-181b 5′-AACCCACCGACAGCAATGAATGTTG-3’SEQ ID NO.112)的动物受到对6-OHDA毒性的保护，并在TH阳性细胞数量上与未处理的对照比较不显示显著差异(图8B,D,E)。

此外，分析了立体定位注射6-OHDA的小鼠PD模型。根据报道的数据(Jagmag等人，2015)，与注射盐水的对照侧相比，如TH阳性细胞免疫染色和计数(图9A，C，E)所示，在miR-181a/b-1

总而言之，目前的数据表明，青鳉鱼和小鼠中miR-181a/b下调通过保护DA神经元免受6-OHDA诱导的死亡而改善了PD临床前模型的表型。

与年龄相关的黄斑变性中的miR-181a/b抑制

线粒体功能障碍涉及几种年龄相关疾病的病理生理学，包括年龄相关黄斑变性(AMD)，一种复杂的多因素变性疾病。AMD的视力障碍是由感光细胞损伤引起的，但主要的致病事件涉及视网膜色素上皮(RPE)变性。在AMD中，已经假设脂褐素是感光细胞外部区段(POS)更新的产物，其在RPE中的累积是导致该病的主要原因，该疾病通过产生活性氧物质(ROS)而导致RPE功能障碍和细胞凋亡。越来越多的证据表明，RPE和感光细胞中受损的自噬和线粒体功能障碍加剧了氧化应激，并导致了AMD的发病。发明人测试了miR-181a/b抑制在改善AMD表型中的功效。特别是使用由载有脂褐素(A2E)的ARPE-19细胞系(RPE)组成的AMD的体外模型。可通过定量自发荧光来测量ARPE-19中A2E的积累。用可抑制miR-181活性的锁核酸(LNA)寡核苷酸反义物转染ARPE-19细胞，并将其与对照样品进行比较。

转染后两天，将100μM A2E加到对照和LNA-miR-181转染的细胞上，持续6小时(图16A)。miR-181抑制将A2E自发荧光降低约50％，表明与对照细胞相比，脂褐素的积累减少，在图中进行了量化(A2E强度平均值，图16B)。而且，与对照细胞相比，miR-181的下调导致A2E点强度和A2E点面积减少(图16B)，这表明miR-181的抑制导致与脂褐素积聚有关的视网膜病变的减轻。

AMD主要由环境和生活方式因素引起，也由遗传因素引起，例如ABCA4中的多态性会增加AMD风险。ABCA4基因的隐性突变是造成Stargardt病的原因，Stargardt病是一种以脂褐素积聚为特征的黄斑营养不良，这种症状通常在AMD中发现。因此，Abca4-/-小鼠模型被认为是评估AMD治疗策略的合适体内模型。发明人测试了Abca4-/-小鼠和miR-181a/b-1-/-小鼠杂交对miR-181a/b下调的效果。有趣的是，在Abca4-/-/miR-181a/b-1

色素性视网膜炎中的miR-181抑制

视紫红质基因的突变是显性和隐性视网膜色素变性(RP)的病因，约占所有病例的10％。因此，显性视紫红质突变体是功能获得性突变体或显性负突变体。定义了几种类型：

-第I类,类似于野生型(wt)视紫红质定位于细胞质膜并结合11-顺-视黄醛以形成具有光谱活性的视紫红质的能力；影响纤毛靶向信号VXPX的突变是错误定位，包括在突触处，其可能会抑制突触小泡融合或异常激活转导蛋白。

-第II类可能在蛋白质折叠和/或稳定性方面存在缺陷，在粗面内质网中异常聚集，不能有效地转运到细胞质膜上，并且无法结合11-顺式视黄醛形成具有光谱活性的光色素；

-第III类，组成性激活转导蛋白。

I类突变体中包括那些影响羧基末端附近的脯氨酸347的突变体。该残基在所有已知的视色素中都是保守的。在RP患者中已鉴定出六个不同的错义突变影响此残基，表明脯氨酸347介导了视紫红质的某些重要功能。

携带人脯氨酸347到丝氨酸(P347S)突变的转基因小鼠(参考PMID：8943080)发生感光细胞变性。在一个月龄(P30)时，感光细胞层已经显著减少，而在三个月(P90)时，P347S视网膜中仅存在一排感光细胞体。相应地，视网膜电图(ERG)响应在P30时显著降低，在P90时几乎为零。

发明人将P347S转基因动物与miR-181a/b-1杂合动物杂交。将来自P347S转基因小鼠的视网膜与来自同一窝的P347S/miR-181a/b+/-小鼠的视网膜进行了比较。通过ERG测试以及组织学和分子分析对P30和P90时的小鼠进行鉴定。

如图18所示，与P347S视网膜相比，P347S/miR-181a/b+/-视网膜在P30时的ERG响应(b波)明显更高(N＝16)。由于视锥功能性，响应显示出明视略微增加。因此，视杆细胞(视紫红质，Rhod)和视锥细胞(C-抑制蛋白，C-arr)的两个主要标记物的免疫荧光(IF)染色显示视紫红质染色水平增加，而C-抑制蛋白染色无差异(图19A)，尽管外部核层(ONL)的厚度没有差异(图19B)。图19C中报道的qRT-PCR分析也证实了视紫红质以及其他感光细胞受体标记物的水平增加。此外，发明人还观察到如图20所示定量的外部区段(OS)长度的改善。

在P90时，与P347S动物相比，P347S/miR-181a/b+/-动物的ERG反应仍然明显更高(图21)。Rhod和C-arr的IF染色显示P90时的两种标记物水平均升高(图22)，组织学切片显示P347S/miR-181a/b+/-ONL由多于一排的感光细胞体构成，与P347S ONL的差异记录在图22B的图表中。图22C中报道的qRT-PCR分析也证实了视紫红质和C-抑制蛋白以及其他感光细胞受体标记物的水平增加。

来自P347S小鼠模型的转录组数据(图23A)显示，在P347S小鼠模型中，线粒体相关基因和途径的表达下调很强，此外还显示了miR-181a/b如何能调控线粒体相关途径的数据，促使发明人分析携带miR-181a/b-1基因组簇杂合缺失的P347S小鼠中的线粒体表型。

为了理解miR-181a/b下调如何改善P347S小鼠的视网膜表型，发明人证实了与P347S模型相比，p347S/miR-181a/b+/-小鼠的视网膜中miR-181a/b验证的靶标是否被上调。通过qRT-PCR(图23B)对以下miR-181a/b验证的靶标进行了分子分析：Ppargc1a和Nrf1，参与线粒体的生物发生；Cox11和Coq10b，其是线粒体呼吸链的组成部分；Prdx3，其编码具有抗氧化功能的蛋白质，Erk2，Atg5和Park2，参与自噬/线粒体自噬途径的调控；Xiap，在调节线粒体介导的细胞死亡中起着至关重要的作用；Bcl2和Mcl1，它们是抗凋亡和促存活的基因。发明人发现所有靶标上调：Cox11,Erk2,Mcl1,Bcl2,Nrf1,Coq10b,Xiap,Ppargc1a,Park2和Prdx3,除了Atg5。所有这些数据共同表明，上述miR-181a/b靶基因的上调原则上可有助于在P347S/miR-181a/b+/-小鼠中观察到的PR保护。

为了进一步了解由miR-181a/b-基因簇-1耗竭对P347S小鼠产生的保护作用，发明人进行了细胞死亡试验。如先前所示，miR-181a/b靶向多种抗凋亡和促存活基因。首先，他们在冰冻的视网膜上对P347S和P347S/miR-181a/b+/-小鼠中的抗活性胱冬酶3进行了免疫荧光检测(图24A)。胱冬酶-3在凋亡细胞中通过外部(死亡配体)和自身(线粒体)途径被激活。该蛋白质以无活性的酶前体形式存在，其经过蛋白水解过程以产生在凋亡途径中起主要作用的活性酶。如免疫荧光测定法及其定量分析所揭示(图24B)，在P347S/miR-181a/b+/-小鼠模型中，抗活性胱冬酶3阳性细胞显著减少，表明miR-181a/b下调确实可以保护细胞免于凋亡。此外，本发明人使用细胞死亡的另一标记物TUNEL-POD实验证实了数据。末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)是一种通过标记3'-羟基末端来检测DNA片段的方法。细胞死亡的标志是DNA降解。DNA切割可能会产生双链和单链DNA断裂(缺口)。可以通过在酶促反应中用修饰的核苷酸(例如，生物素-dUTP，荧光素-dUTP)标记游离的3'-OH末端来检测这两种类型的断裂。酶末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)催化脱氧核糖核苷酸的模板非依赖性聚合反应至单链和双链DNA的3'末端。使用这种技术，可能独立于机制来检测所有类型的细胞死亡。如图25A所示，其中用深灰色标记垂死细胞并用箭头标出，并在图25中量化，与P347S小鼠相比，P347S/miR-181a/b+/-的视网膜中的死细胞大大减少。

所有这些数据共同表明，miR-181a/b-基因簇-1耗竭保护P347S小鼠中的细胞免受死亡。

相应地，利用转录组数据(图23A)，透射电子显微镜(TEM)揭示了在P347S小鼠模型中存在特征是线粒体较小且碎片化的线粒体表型(图26A)。

通过TEM分析，与P347S/miR-181+/+相比，P347S/miR-181+/-小鼠的视网膜显示出更好的结构。P347S/miR-181+/+小鼠的OS完全被破坏，而在P347S/miR-181+/-动物中，OS和IS的组织和包装都更好(图26A)。此外，两个模型之间的线粒体形态差异非常明显。在P347S视网膜中，线粒体碎片化且非常小。相反，在P347S/miR-181+/-动物中，线粒体更细长且形态更好(图26A，在图26B中用图量化)，与所有以前的数据一致，表明miR-181参与了线粒体功能。

通过WB进一步研究了线粒体相关表型的改善。发明人分析了位于线粒体外膜上的GTP酶Mfn2(丝裂融合蛋白)的蛋白质水平(图27A)。Mfn2是一种参与线粒体融合的蛋白质。在细胞内，线粒体以不断变化的动态状态存在，不断伸长和分裂(分别为融合和裂变)。裂变在分离(segregating)功能异常的线粒体中起作用，而另一方面，融合已被证明有助于平衡基质代谢物和完整的mtDNA。某些受损的线粒体可以与其他健康的线粒体融合，以挽救受损的线粒体。这两个事件的平衡被认为对于线粒体稳态，细胞稳定性和细胞存活至关重要。特别是线粒体融合是由包括Mfn2在内的三种不同的GTP酶介导的。WB分析显示，与P347S小鼠相比，P347S/miR-181a/b+/-中Mfn2蛋白水平有增加的趋势。尝试推测Mfn2上调可能与TEM观察到的P347S/miR181-a/b+/+小鼠视网膜中线粒体形态的改善有关。发明人还进行了OXPHOS BLOT分析MRC(图27B)。此过程依赖于蛋白质印迹，其中同时使用针对五种线粒体链复合物的特定抗原的抗体。他们观察到在P347S小鼠模型中，相对于WT小鼠眼睛，这些蛋白质的表达下调。在P347S/miR-181a/b+/-模型中，检测到蛋白质水平的显著回复(rescue)。另外，他们发现普通线粒体标记物柠檬酸合酶(Cs)的蛋白质水平上调，该酶参与柠檬酸循环(Krebs循环)的第一步(图27C)。该蛋白位于线粒体基质中，可以指示P347S/miR-181a/b+/-眼相对于P347S眼的线粒体质量增加。在图27D的图中量化数据。

miR-181海绵效率的体外实验验证

产生了在巨细胞病毒(CMV)组成型启动子的控制下表达用于miR-181抑制的“海绵”构建体(见上述miR-181海绵序列)的AAV载体(血清型2)(AAV.CMV.miR-181.sponge)。据报道，AAV2血清型在玻璃体内给药后可在多种物种，包括小鼠和非人类灵长类动物内有效转导RGC(Koilkonda等,2014a；Koilkonda等,2014b；Kwong等,2015；Tshilenge等,2016)。这种AAV血清型被参与视网膜疾病基因治疗的研究人员普遍使用(Botta等，2016；Maguire等，2009；Maguire等，2008；Mussolino等，2011)。miRNA海绵是具有串联重复的miRNA反义序列的RNA分子(miRNA结合位点(MBS)，可以将miRNA从其内源靶标中隔离出来，并且是实现体内miRNA长期功能丧失的有价值的工具(Ebert&Sharp，2010)。miRNA海绵已成功应用于动物模型(Ebert&Sharp，2010；Tay等，2015)。根据(Ebert等，2007；Gentner等，2009；Kluiver等，2012)进行海绵设计。简单说，发明人设计了针对miRNA181a的6MBS反义序列和针对miRNA181b的6MBS反义序列，其在miR-181a或b序列的9–12位具有中心错配(“凸出”)。通过改变9-12位的核苷酸以减少碱基配对(包括G-U摆动)的机会来产生凸起。两个MBS将以4个核苷酸的序列(“间隔子”)分隔。将海绵寡核苷酸双链体(双链)克隆到含有表达盒的载体中，该表达盒的miRNA结合性海绵序列插入到GFP报告基因的3'UTR中(Karali等，2011)。

用AAV2.1-CMV-eGFP-miR-181海绵(海绵181)转染48h后，进行SH-SY5Y细胞中miR-181a/b直接靶转录本(XIAP，NRF1，PRDX3，MCL1，ATG5，SIRT1，BCL2，BCL2，ERK2，PARK2，COX11)的qRT-PCR分析。在海绵181样品中，相对于对照样品(对照＝AAV2.1-CMV-eGFP转染的细胞，N＝3)，miR-181a/b靶标的转录水平增加(图28)。该数据表明，miR-181海绵隔绝内源性miR-18，从而阻止了其直接靶标的结合并抑制了其活性。

miR-181a/b调节的途径之一是线粒体依赖性细胞死亡，其中Bcl-2蛋白家族具有关键的调节作用。该蛋白家族控制线粒体外膜通透性(MOMP)，形成称为线粒体通透性转换孔(PTP)的内膜通道以及细胞色素c和其他凋亡触发因子的释放(Rasola&Bernardi，2007；Tait&Green，2010)。尽管尚未明确确定凋亡对原发性MD发病机制的贡献，但增加抗凋亡Bcl-2蛋白的水平可能代表延长细胞存活和减慢疾病进展的有效策略。值得注意的是，通过过表达Bcl-2家族蛋白Bcl-xL或通过环孢霉素A(CsA)处理来抑制MOMP和PTP，可以抵消细胞死亡增加并改善hccs缺陷型MLS青鳉鱼模型的表型(Indrieri等，2013)。线粒体依赖性细胞死亡在与线粒体功能障碍相关的疾病中的重要性也已通过CsA治疗对Ullrich先天性肌营养不良和Bethlem肌病患者，以及在PD动物模型中的积极作用得到证明(Merlini等，2008)(Tamburrino等，2015)。在此，发明人表明，miR-181a/b抑制导致Bcl-2家族成员(例如Bcl-2和Mcl-1)的水平升高，并在两个测试的MLS模型中恢复了表型。此外，HA14-1(一种有效的Bcl-2蛋白抑制剂)(Wang等，2000b)显著消除了hccs缺陷型模型而不是cox7b缺陷型模型中的miR-181a/b介导的MLS表型改善。这些数据表明，取决于潜在的遗传缺陷，单个途径例如线粒体依赖性细胞死亡及其调节可能对高度相关形式的MD具有不同的影响。此外，这一观察结果进一步证实了我们的假设，即同时作用于多个途径代表了治疗遗传异质性MD的更有效策略。

已显示自噬和线粒体自噬能力的增强对包括PD在内的各种神经退行性疾病具有保护作用(Decressac等，2013；Martinez-Vicente，2017)。值得注意的是，PD早发性的家族性形式中突变的两种基因产物即Parkin和PINK1通过自噬途径参与清除受损的线粒体(Geisler等，2010；Vives-Bauza等，2010)。此外，使用可激活自噬的mTOR抑制剂雷帕霉素治疗可显著延缓神经变性进程和Ndufs4-/-小鼠(Leigh综合征的模型)的致命结局，Leigh综合征是MD最严重的形式之一(Johnson等，2013)。在此，发明人表明miR-181a/b的下调导致CNS中的自噬和线粒体自噬增多。与这些数据相一致，在hccs/miR-181a/b-MO和cox7B/miR-181a/b-MO胚胎中抑制总体自噬会降低miR-181a/b下调对MLS表型的神经保护作用，表明自噬/线粒体自噬的增加显著促进了两种模型的表型拯救。

尽管去除功能异常的线粒体会限制细胞凋亡的风险，但如果没有适当的代偿性线粒体生物发生，线粒体自噬的失控激活可能会导致线粒体功能障碍，从而导致线粒体质量下降，能量崩溃和细胞死亡(Villanueva Paz等，2016；Zhu等，2013)。此外，增强的线粒体生物发生本身在MD中可能是保护性的。线粒体DNA含量和线粒体的生物发生的变化确实与LHON的非表现载体中的不完全渗透有关(Giordano等，2014)，发现增加的生物发生可以改善不同的体内和体外MD模型的表型(Komen和Thorburn，2014年)。但是，使用触发线粒体生物发生的化合物(包括苯扎贝特，白藜芦醇和AICAR)获得的一些相互矛盾的结果(Komen&Thorburn，2014)明确表明，需要有效开展线粒体生物发生调节以增加患者线粒体功能的研究。线粒体自噬与线粒体生物发生之间的紧密平衡正在成为确定线粒体功能障碍疾病的细胞生存力的关键方面(Zhu等人，2013)。在这里，发明人表明miR-181a/b可以同时控制这两个过程。伴随着miR-181a/b失活后观察到的线粒体增加，发明人观察到几种线粒体蛋白和mtDNA的水平升高，表明线粒体的生物发生增强。相应地，在鱼藤酮诱导的LHON模型中，miR-181a/b耗竭的动物显示出增强的MRC复合物I活性并保留了线粒体完整性。总而言之，发明人证明了miR-181a/b代表线粒体更新的新型控制物，并且该活性可能在神经保护中起关键作用。

MD是遗传上异质性的一组疾病。尽管每种疾病都很罕见，但总体上，成年MD的总患病率估计为4300分之一左右，代表了遗传性神经疾病中最普遍的群体之一(Gorman等，2015)。在这项研究中，发明人证明了miR-181a/b的下调在多种MD模型中均具有神经保护作用。对于遗传异质性疾病(例如LHON)，我们的研究结果特别有意义，因为这些疾病非常需要基因非依赖性的治疗策略。此外，发明人在PD的体内模型中产生的原始数据证据突出了miR-181a/b作为该疾病的新治疗靶标的可能性。

值得注意的是，miR-181a/b-1

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<223> 合成的

<400> 4

aacauucauu guugucggug ggu 23

<210> 5

<211> 7

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 5

acauuca 7

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 6

cgacagcgtt gaatgt 16

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 7

cgacagcaat gaatgt 16

<210> 8

<211> 322

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 8

ttgtaagtga taacagccac tcatagcttg taagtcgtaa cagccaccca tagcttgtaa 60

gtgataacag ccactcatag cttgtaagtc gtaacagcca cccatagctt gtaagtgata 120

acagccactc atagcttgta agtcgtaaca gccacccatc tagattgtaa gtgataacag 180

ccactcatag cttgtaagtc gtaacagcca cccatagctt gtaagtgata acagccactc 240

atagcttgta agtcgtaaca gccacccata gcttgtaagt gataacagcc actcatagct 300

tgtaagtcgt aacagccacc ca 322

<210> 9

<211> 323

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 9

ttgtaagtgt aaacagccac tcatagcttg taagtcttaa cagccaccca tagcttgtaa 60

gtgtaaacag ccactcatag cttgtaagtc ttaacagcca cccatagctt gtaagtgtaa 120

acagccactc atagcttgta agtcttaaca gccacccatc tagattgtaa gtgtaaacag 180

ccactcatag cttgtaagtc ttaacagcca cccaatagct tgtaagtgta aacagccact 240

catagcttgt aagtcttaac agccacccat agcttgtaag tgtaaacagc cactcatagc 300

ttgtaagtct taacagccac cca 323

<210> 10

<211> 322

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 10

ttgtaagtct aaacagccac tcatagcttg taagtcttaa cagccaccca tagcttgtaa 60

gtctaaacag ccactcatag cttgtaagtc ttaacagcca cccatagctt gtaagtctaa 120

acagccactc atagcttgta agtcttaaca gccacccatc tagattgtaa gtctaaacag 180

ccactcatag cttgtaagtc ttaacagcca cccatagctt gtaagtctaa acagccactc 240

atagcttgta agtcttaaca gccacccata gcttgtaagt ctaaacagcc actcatagct 300

tgtaagtctt aacagccacc ca 322

<210> 11

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 11

ttgtaagtct ggacagccac tcatagcttg taagtcgaaa cagccaccca tagcttgtaa 60

gtctggacag ccactcatag cttgtaagtc gaaacagcca cccatagctt gtaagtctgg 120

acagccactc atagcttgta agtcgaaaca gccacccatc tagattgtaa gtctggacag 180

ccactcatag cttgtaagtc gaaacagcca cccatagctt gtaagtctgg acagccactc 240

atagcttgta agtcgaaaca gccacccata gttgtaagtc tggacagcca ctcatagctt 300

gtaagtcgaa acagccaccc a 321

<210> 12

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 12

ttgtaagtgt aaacagccac tcatagcttg taagtcttaa cagccaccca tagcttgtaa 60

gtgtaaacag ccactcatag cttgtaagtc ttaacagcca cccatagctt gtaagtgtaa 120

acagccactc atagcttgta agtcttaaca gccacccatc tagattgtaa gtctggacag 180

ccactcatag cttgtaagtc gaaacagcca cccatagctt gtaagtctgg acagccactc 240

atagcttgta agtcgaaaca gccacccata gttgtaagtc tggacagcca ctcatagctt 300

gtaagtcgaa acagccaccc a 321

<210> 13

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 13

ttgtaagtgt aaacagccac tcatagcttg taagtcttaa cagccaccca tagcttgtaa 60

gtgtaaacag ccactcatag cttgtaagtc ttaacagcca cccatagctt gtaagtgtaa 120

acagccactc atagcttgta agtcttaaca gccacccatc tagattgtaa gtctggacag 180

ccactcatag cttgtaagtc gaaacagcca cccatagctt gtaagtctgg acagccactc 240

atagcttgta agtcgaaaca gccacccata gttgtaagtc tggacagcca ctcatagctt 300

gtaagtcgaa acagccaccc a 321

<210> 14

<211> 5838

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 14

agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccagattta 240

attaaggctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc 300

gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc 360

catcactagg ggttccttgt agttaatgat taacccgcca tgctacttat ctacgtagcc 420

atgctctagg aagatcggaa ttcgccctta agctagctag ttattaatag taatcaatta 480

cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg 540

gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 600

ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 660

ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca 720

atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta 780

cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 840

acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg 900

acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca 960

actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca 1020

gagctggttt agtgaaccgt cagatcctgc agaagttggt cgtgaggcac tgggcaggta 1080

agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga gaccaataga aactgggctt gtcgagacag 1140

agaagactct tgcgtttctg ataggcacct attggtctta ctgacatcca ctttgccttt 1200

ctctccacag gtgtccaggc ggccgccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg 1260

gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc 1320

ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc 1380

ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc 1440

ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa 1500

ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc 1560

gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc 1620

aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc 1680

tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac 1740

atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac 1800

ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac 1860

cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact 1920

ctcggcatgg acgagctgta caagtaataa gcttggatcc aatcaacctc tggattacaa 1980

aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata 2040

cgctgcttta atgcctttgt gctgcgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc 2100

cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg 2160

tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac 2220

ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat 2280

cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt 2340

ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat 2400

tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc 2460

ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgagatcttc tagaacccac 2520

cgacaatgct gaatgtttag cactcaccga caatagtgaa tgtttagcac ccaccgacaa 2580

tgctgaatgt ttagcactca ccgacaatag tgaatgttta gcacccaccg acaatgctga 2640

atgtttagca ctcaccgaca atagtgaatg tttctagaac ccaccgacaa tgctgaatgt 2700

ttagcactca ccgacaatag tgaatgttta gcacccaccg acaatgctga atgtttagca 2760

ctcaccgaca atagtgaatg tttagcaccc accgacaatg ctgaatgttt agcactcacc 2820

gacaatagtg aatgttagat ctgcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt 2880

ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta 2940

ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg 3000

ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggactc 3060

gagttaaggg cgaattcccg attaggatct tcctagagca tggctacgta gataagtagc 3120

atggcgggtt aatcattaac tacaaggaac ccctagtgat ggagttggcc actccctctc 3180

tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg 3240

cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagccttaa ttaacctaat tcactggccg 3300

tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag 3360

cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc 3420

aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg 3480

cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc 3540

ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa 3600

atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac 3660

ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccccg atagacggtt tttcgccctt 3720

tgacgctgga gttcacgttc ctcaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca 3780

accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt tccgatttcg gcctattggt 3840

taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta 3900

taatttcagg tggcatcttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 3960

aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 4020

attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 4080

cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 4140

aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaatagt ggtaagatcc 4200

ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 4260

gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 4320

attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 4380

tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 4440

tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 4500

atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 4560

agcgtgacac cacgatgcct gtagtaatgg taacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 4620

aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 4680

caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 4740

ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 4800

gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 4860

tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 4920

atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 4980

tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 5040

accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 5100

gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 5160

caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc 5220

tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 5280

ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 5340

tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 5400

gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 5460

tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 5520

gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 5580

gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 5640

ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 5700

gcggttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta 5760

ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag 5820

tgagcgagga agcggaag 5838

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 15

gctctagaga cttctttctg cggaaatg 28

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 16

gctctagact gttttctatg gccaggtg 28

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 17

ccacaggcag atgcgcgtct tgaaagctcc cgggcc 36

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 18

ggcccgggag ctttcaagac gcgcatctgc ctgtgg 36

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 19

gctctagagc actacagata tcatattgag g 31

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 20

gctctagata gatttgaaac attcgtttcc c 31

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 21

ctgagctaat aaagggaaac gccggtttca aatctctagg tcggg 45

<210> 22

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 22

cccgacctag agatttgaaa ccggcgtttc cctttattag ctcag 45

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 23

gctctagagc ctagctagaa tatatgac 28

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 24

gctctagaca caggcttcct acatttag 28

<210> 25

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 25

caagtccatg cgcgttaaaa tgtacaggtg ggattg 36

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 26

caatcccacc tgtacatttt aacgcgcatg gacttg 36

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 27

gctctagagc cacctgcttc tgactttag 29

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 28

gctctagaca acttcagtcc ttacattg 28

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 29

gaagataagt tggttgggcg tctccagcac tatgcatccc 40

<210> 30

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 30

gggatgcata gtgctggaga cgcccaacca acttatcttc 40

<210> 31

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 31

gctctagact gagagaagaa ccacagttg 29

<210> 32

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 32

gctctagacc ctggatttga taaatatcc 29

<210> 33

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 33

cggtcctgaa attttcatct tgccggtctt tgtattaaac tgaattttc 49

<210> 34

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 34

gaaaattcag tttaatacaa agaccggcaa gatgaaaatt tcaggaccg 49

<210> 35

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 35

gccgtgtaac tcctgcaatg ccggtttatg tgattgaagc 40

<210> 36

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 36

gcttcaatca cataaaccgg cattgcagga gttacacggc 40

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 37

aacacccttt ccaaatcctc a 21

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 38

tggcgtcgtg attagtgatg 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 39

atgttcgtca tgggtgtgaa 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 40

aggggtgcta agcagttggt 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 41

gcttggccct ctcagactct 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 42

gccactacag acaccgcacg 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 43

gagtgatgtc cgcacagaag 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 44

gtttgcgttt gctgatcttc 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 45

gctgccgtac ccctttatcg 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 46

cactggagac ttgcatgcac 20

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 47

ggcgttttag cccaggtctt c 21

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 48

gctaccatct gcttcacaac 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 49

cccgagacta cggtgtgctg 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 50

cactgggaga tcgttgacgc 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 51

agcttgctgg tgaaaaggac 20

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成的

<400> 52

gtcaagggca tatccacaac 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 53

ggtgctgagt atgtcgtgga 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 54

ctaagcagtt ggtggtgcag 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 55

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成的

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

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ttgtaagtnn nnacagccac cca 23