一种美洲大蠊PCR鉴定引物及鉴定方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种美洲大蠊PCR鉴定引物及使用该引物鉴定美洲大蠊的方法。

背景技术

美洲大蠊(Periplanetaamericana)属昆虫纲，蜚蠊目，蜚蠊科，俗称蟑螂。在我国作为药用始见于《神农本草经》。性味：味咸、性寒；归经：肝、脾、肾经。现代药理学研究表明其提取物中含有多种糖蛋白、氨基酸和多肽等活性成分，具有增强机体免疫力、保护肝脏、促进组织修复和广泛的抗肿瘤等作用。目前美洲大蠊已开发成3种药品上市销售，分别为康复新液、肝龙胶囊、心脉隆注射液，用于皮肤黏膜损伤、肝炎和心衰治疗。

作为康复新液主要原料的美洲大蠊，其质量标准收载于湖南省中药材标准、云南省中药材标准以及四川省中药材标准。目前地方标准的定性采用薄层色谱鉴别方法。其中，湖南省中药材标准和云南省中药材标准以丙氨酸作为对照，四川省中药材标准以美洲大蠊对照药材为对照。试验表明(可提供研究图谱)，混伪品与正品几乎无法区别，不能确定是否会采用蜚蠊目其他属种的昆虫替代美洲大蠊投料，故迫切需要寻找美洲大蠊专属性鉴别方法。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)法是体外酶促合成特定基因或DNA片段的方法。其基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，主要由变性、退火、延伸三个基本反应构成一个周期，循环进行。DNA分子作为遗传信息的直接载体，不受环境因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响，每一个体的任一体细胞均含有相同的遗传信息。因此，较之传统鉴定方法，PCR法进行物种鉴别更准确可靠，特别是在珍稀贵重药材的鉴定方面有独特优势。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种美洲大蠊PCR鉴定引物及使用该引物鉴定美洲大蠊的方法。

为了实现上述目的，本发明的一方面提供了一种美洲大蠊PCR鉴定引物，所述引物序列如下：

上游引物为：5'-AGAATATTAATTCGTGCTGAGCTCG-3'；

下游引物为：5’-TGGGTATACTGTTCATCCTGTTCCG-3'。

本发明的另一方面提供了一种鉴定美洲大蠊的方法，包括以上述的上游引物和下游引物作为PCR引物通过PCR方法对鉴定物DNA样本进行扩增反应，如有290bp扩增条带，则该鉴定物为美洲大蠊。

在本发明的一个实施方案中，一种鉴定美洲大蠊的方法包括以下步骤：

1)提取待鉴定物的总DNA；

2)以步骤1)提取的总DNA为模板，以上述的上游引物和下游引物作为PCR引物通过PCR方法对鉴定物DNA样本进行扩增反应；

3)使用琼脂糖凝胶电泳检测步骤2)中得到的PCR扩增反应产物，如有290bp扩增条带，则该鉴定物为美洲大蠊。

上述步骤中PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环反应30次，最后72℃延伸10分钟，4℃保温。

本发明提供的技术方案达到了如下的有益效果：1)选择了区分力好、适合动物鉴别的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COI)序列进行PCR引物设计，并根据美洲大蠊与其他三种混伪蜚蠊科品种(德国小蠊、杜比亚、土鳖虫)COI基因的差异片段进一步设计筛选出特异性最佳的引物对，可以将美洲大蠊与其它蜚蠊科品种区分开来；2)该方法普遍适用于幼虫、成虫等不同生长期美洲大蠊的鉴别；3)本方法取材量少、无特殊组织要求，适合美洲大蠊药材及药材粉末的鉴别需求。4)此法专属性强，操作简单，成本低，易应用于美洲大蠊的质量控制。

附图说明

图1为本发明实施例1的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本发明实施例2的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但并不因此将本发明限制在所述的具体实施例中。实施例中未说明的条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照商品说明书建议的步骤和条件。

一、引物设计

根据美洲大蠊COI基因序列，寻找美洲大蠊与其他三种混伪蜚蠊科品种(德国小蠊、杜比亚、土鳖虫)COI基因的差异片段进一步设计筛选出特异性最佳的引物，引物序列如下：

上游引物为：5'-AGAATATTAATTCGTGCTGAGCTCG-3'；

下游引物为：5'-TGGGTATACTGTTCATCCTGTTCCG-3'。

二、DNA提取

取鉴定物待测样品0.5g，置乳钵中，加液氮适量，充分研磨使成粉末，取2～3mg置1.5ml离心管中，用动物基因快速抽提试剂盒提取DNA，加入裂解液96μl，混合酶4μl，涡旋混匀，在55℃水浴保温15分钟，再置95℃水浴保温5分钟，向上述样品中加入终止液100μl，涡旋混匀，离心(转速为每分钟12000转)10分钟，取上清液，作为供试品溶液，置零下20℃保存备用。另取美洲大蠊对照药材，同法制成对照药材模板DNA溶液。

三、PCR扩增反应

反应体系为在200μl离心管中进行，反应总体积为20μl，反应体系为10μl预混合试剂2×(含有2×普通Taq DNA聚合酶，2×PCR缓冲液，2×dNTP和2×上样缓冲液)，鉴别引物(10μmol/L)各0.8μl，模板1μl，无菌双蒸水7.4μl。将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环反应30次，最后72℃延伸10分钟，4℃保温。

四、电泳检测

照琼脂糖凝胶电泳法(中国药典2015年版四部通则0541)，胶浓度为1.5％，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed。供试品与对照药材PCR反应溶液的上样量分别为4μl，DNA分子量标记上样量为4μl(90ng/μl)。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。

实施例1

采用本发明提供的美洲大蠊PCR鉴定引物及其鉴定方法对美洲大蠊、德国小蠊、杜比亚和土鳖虫的DNA样本按照上述具体实验方法进行了美洲大蠊鉴定，其琼脂糖凝胶电泳图见图1。图1中从右到左依次为：M-DL500Marker；1-美洲大蠊对照药材；2-美洲大蠊；3-德国小蠊；4-杜比亚；5-土鳖虫；6-空白。

对图1电泳图分析，根据目的片段大小进行美洲大蠊的真伪判定。从美洲大蠊对照药材及美洲大蠊药材中提取的DNA(见图1中标记1和2)经PCR扩增后，在1.5％琼脂糖凝胶电泳胶板290bp处出现单一扩增条带。而从其他蜚蠊科，如：德国小蠊(见图1中标记3)、杜比亚(见图1中标记4)、土鳖虫(见图1中标记5)中提取的DNA经PCR扩增后，在1.5％琼脂糖凝胶电泳胶板290bp处未出现单一扩增条带。以上结果说明本方法可用于美洲大蠊药材真伪的鉴定。

实施例2

采用本发明提供的美洲大蠊PCR鉴定引物及其鉴定方法,对美洲大蠊对照药材和其余26批不同产地、不同生长周期的美洲大蠊以及3批混伪品(德国小蠊、杜比亚、土鳖虫)进行鉴别，其琼脂糖凝胶电泳图见图2。图2中M为DL500 Marker，其余编号及对应样品信息如下表所示：

结果表明，美洲大蠊对照药材、不同产地及不同生长周期的美洲大蠊均在290bp处出现单一扩增条带，而3种不同混伪品均未在290bp处出现单一扩增条带，说明本方法能稳定准确地鉴别不同产地、不同生长周期的美洲大蠊以及混伪品。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改和改进，均落入本发明的保护范围内。