用于皮肤护理的乳杆菌
文献发布时间:2023-06-19 10:14:56
技术领域
本发明涉及用于通过局部施用治疗和/或预防皮肤问题的微生物,其中,所述微生物选自由植物乳杆菌HEAL 19(DSM 15313)和植物乳杆菌HEAL 99(DSM 15316)组成的组。特别地,所述微生物用于治疗和/或预防皮肤屏障功能丧失、炎症性皮肤问题和/或病原微生物生长。本发明还涉及一种包含所述微生物和载体的微粒制剂、以及包含所述微生物的药物或美容组合物或者产品。本发明还提供了所述微生物或组合物用于皮肤上的美容用途和美容方法,特别是用于改善皮肤外观。
背景技术
众所周知,益生菌可改善肠道健康,这归因于肠-脑轴相关性的提高,缓解乳糖不耐症,有益于治疗阴道或泌尿生殖道感染或预防炎性肠病。特别是乳杆菌在食品发酵过程中有着悠久而安全的传统。与肠道相比,对表皮、皮肤微生物群和环境微生物之间的相互作用了解甚少。
如今,越来越多的研究表明,益生菌还具有其他促进健康的作用,包括皮肤健康。双歧杆菌和乳酸菌是最常见的益生菌类型,在过去几年里,使用它们的皮肤护理领域得到了积极发展。
但是,并非所有益生菌菌株都对皮肤表现出有益的作用,很少提及单一菌株。而且即使如此,在美容组合物中作为活性组分引起的抗炎或其他作用与微生物本身不引起任何促炎副作用之间也要取得平衡。
皮肤持续暴露于细菌、微生物和潜在病原体。为了避免这些病原细菌的感染或入侵,皮肤已经制定了多方面的防御策略。除了角质层的物理和化学屏障外,皮肤还包括本构性和诱导性AMP屏障,在此情况下这是必不可少的(Harder等人,2013;Wiesner和Vilcinskas,2010)。
抗菌肽(AMP)是一类多样化且丰富的分子。其特征是小体积、氨基酸组成、具有两亲性和/或阳离子电荷。根据它们的氨基酸组成,它们通常被分为特征子群。抗菌肽的抗菌潜力和作用机理与其结构和组成一样具有多样性。可以在无脊椎动物、动物物种和植物的各种组织和细胞类型中检测到抗菌肽(Brogden 2005,Zasloff 2002)。抗菌肽在人体皮肤中起着第一道防线的作用,因为它们对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、真菌、真核寄生虫和/或病毒具有活性(Brown and Hancock 2006)。
AMP表达可响应诸如与病原体接触或细胞内炎症途径的各种环境刺激而被上调。共生细菌和致病细菌在诱导AMP表达和激活人体皮肤中不同的信号传导通路以产生人体先天性免疫力方面的能力不同。我们对两者之间具体的相互作用知之甚少。例如,β-防御素通过各种炎症和/或感染刺激而上调,如白介素1或细菌脂多糖(Chung和Dale 2004)。Mahe等人(US2009/0035294 A1)公开了来自包含脂质A的线状透明颤菌(Vitreoscillafiliformis)的LPS能够刺激角质形成细胞中AMP表达而没有致病活性。
已知皮肤微生物组可以在各种皮肤疾病和/或健康问题中起关键作用。微生物组的复杂性和个体间/个体内的多样性、以及表征、分类和分析的困难,对理解相互作用和开发有助于影响、相互作用和/或支持微生物组的局部治疗和/或诊断施用和/或治疗来说是挑战。虽然如此,微生物组和与微生物组有关的疾病已经成为越来越重要的方面,并且引起了对开发与微生物组有关的疾病和健康问题的治疗方法的需求。
例如,特应性皮炎(AD)是一种多功能综合症,具有多种遗传风险因素,但有重要的环境诱因。AD与物理屏障缺陷和/或失调(微生物失衡)有关。患者表现出对各种AMP的抑制,如Cathelicidin或β-Defensin或T细胞稳态改变。抗菌与物理屏障缺陷的组合物可能会推动失调,从而导致细胞免疫平衡的进一步破坏,这也是与外部环境建立平衡所必需的(Ong等人,2002;Palmer等人,2006;Sakaguchi等人,2010)。
此外,其他常见的人体皮肤疾病,诸如酒渣鼻或牛皮癣也与AMP表达失调有关。通过这些内源性肽的特异性操作和诱导,可以恢复、维持和/或改善平衡的皮肤微生物组。这代表了一种在广泛的施用领域中创造皮肤益处的新策略。
此外,已知在AD患者的湿疹皮肤病变中经常发现金黄色葡萄球菌,并且其似乎是导致病情恶化的重要且主要原因。因刮伤、晒伤或其他创伤而发炎或损伤的皮肤更容易被感染。例如,干燥的皮肤也容易受损。避免这种感染示出了开发替代治疗方法的第二个高度相关的起点。
根据现有技术,已知一些出版物涉及益生菌对皮肤护理和皮肤健康的各种有益作用。乳杆菌制剂已用于各种用途的美容施用中。这些主要基于对皮肤、身体、头发或指甲的健康益处,但也涉及技术施用。大部分所述组合物包含不同的活性或无活性益生菌菌株的混合物,优选与发酵植物、食物或化学试剂组合使用。另一方面,很少示出单一纯培养菌株的有益作用。
在WO2013153358中,描述了罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和长双歧杆菌在美容施用和局部皮肤治疗中的用途。
WO2015048511公开了用于局部施用的含水乳液组合物,其包含来自益生菌微生物(包括乳杆菌属或双歧杆菌属)发酵的提取物。
微生物对皮肤屏障功能的有益作用已在WO2009031106中进行了描述。公开了至少一种益生菌微生物/级分与橙皮苷组合的美容用途,其用于预防皮肤屏障功能的下降和/或增强皮肤屏障功能。
WO2005091933中描述了两种植物乳杆菌(L.plantarum)菌株在皮肤细胞中诱导β-防御素的可能性。对于皮肤显示出抗菌作用,对于痤疮和敏感性皮肤也有改善。
US2014186409描述了乳酸菌和/或包含它们的组合物的美容用途,其用于局部治疗和/或预防由病原微生物,如金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌引起的皮肤感染、慢性伤口或皮肤疾病。该功效是由乳酸菌与病原体的特定细菌共聚集引起的。
在WO2010056198中,公开了一种药物制剂,其包含多种活的α-链球菌和乳杆菌菌株的组合物,可用于治疗葡萄球菌诱导的人体皮肤上的感染。
WO2005077391公开了一种配方,其包含至少两种乳酸菌菌株,该菌株选自包括植物乳杆菌的库,用于治疗和/或预防应激诱导的炎症性疾病。其中声称的局部施用效果仅限于严重受伤的皮肤,即溃疡或烧伤引起的伤口。
已经描述了在严重的人体烧伤上局部施用植物乳杆菌以改善组织修复和预防感染(Peral等人,2009)。
KR2011134151公开了多种乳酸菌,包括植物乳杆菌,它们产生活性物质,尤其是细菌素或类细菌素的物质。建议将这些菌株用于预防和治疗细菌引起的皮肤感染或炎症性皮肤疾病,诸如特应性皮炎或痤疮。
WO2016023688描述了用于预防或治疗皮肤感染的组合物,包括植物乳杆菌CNCM1-4026。特别地,发现在乳杆菌发酵后收集的浓缩上清液抑制或延缓了不同的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的生长,特别是金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌的生长。仅使用从生长培养基获得的可溶性细菌组分,而不使用整个细菌细胞。
使用无细胞的上清液和提取物已观察到金黄色葡萄球菌对不同乳酸菌(包括植物乳杆菌)具有抑制作用(Yong等人,2015)。
WO2017125447A1涉及用于治疗和预防口腔炎症的微生物,特别是用于治疗或预防牙龈炎和牙周炎的微生物。在所公开的微生物中,植物乳杆菌HEAL 19被证明对单核细胞具有抗炎作用。然而,从W02017125447A1不能得出以下结论:这种作用扩展到了口腔外部的表皮皮肤细胞,即非粘膜角质形成细胞。由于非粘膜皮肤具有完全不同的结构,特别是在保护层(例如角质层)和相关的强大屏障功能方面,因此不能期望在单核细胞上观察到的相同效果也适用于皮肤。此外,表皮是完全不含任何单核细胞或相关细胞形式的无血管组织。
发明内容
本发明的目的是提供可用于治疗和/或预防皮肤问题,特别是皮肤屏障功能丧失、炎症性皮肤问题和病原微生物生长的益生菌菌株。
本发明的另一目的是提供可用于美容施用的益生菌菌株,特别是能够改善皮肤外观并防止体臭的益生菌菌株。
特别地,还有一个目的是,本发明提供的菌株具有一种或优选两种、多种或全部作用,这些作用选自增强皮肤屏障、舒缓皮肤并减少或预防炎症、通过上调AMP增强皮肤的免疫防御、延缓皮肤衰老、抑制皮肤上病原微生物的生长并预防感染。
此外,所提供的菌株在皮肤上使用时不应有不良副作用,诸如促炎作用。
通过用于通过局部施用治疗和/或预防皮肤问题的微生物或者包括两种微生物或由两种微生物组成的混合物来实现上述目的,其中,所述微生物选自由植物乳杆菌HEAL 19(DSM 15313)和植物乳杆菌HEAL 99(DSM 15316)组成的组。
根据本发明,在任一实施例中,可以使用植物乳杆菌菌株HEAL 19和HEAL 99中的一种或二者的混合物。因此,表述“微生物或者包括两种微生物或由两种微生物组成的混合物”是指存在两种菌株中的一种或两种菌株都存在。
从现有技术中了解到,一些益生菌能够改善某些方面的皮肤问题和皮肤外观,但是并非所有细菌菌株都对皮肤产生有益的作用,有些细菌菌株甚至可能有害。此外,将微生物施用于严重受伤或烧伤的皮肤以及口腔粘膜上已显示出有益作用。但是,这些作用不能传递到具有强大屏障功能的非粘膜皮肤上或与施用在这种非粘膜皮肤上相比。为了诱发本发明中描述的作用,皮肤屏障的存在是前提。
现在已经发现植物乳杆菌HEAL 19和HEAL 99提供了一种独特的组合物和全面的活性领域,这有助于果断地改善皮肤的临床症状和美容外观,还支持健康的皮肤并防止异常。结果表明,除了抗炎能力之外,这些菌株的局部施用提供了一种组合物,该组合物既可以通过诱导各种AMP来支持皮肤的屏障,而且还可以通过多种途径增强皮肤物理屏障。另外,对于所述的植物乳杆菌菌株,也可以展现出对金黄色葡萄球菌的生长抑制作用。
已经表明,特别是包括水溶性和水不溶性组分的经过热处理的乳杆菌属能够改善皮肤健康。细菌悬浮液有可能通过减少经表皮水分流失(TEWL)和/或增加与天然保湿因子有关的组分来增强皮肤的物理屏障。同时,可以诱导皮肤产生各种AMP,从而增强皮肤的自卫能力。可以通过抑制金黄色葡萄球菌等病原体的生长来预防皮肤的潜在感染。另外,植物乳杆菌HEAL 19和HEAL 99显示出抗炎作用。
综上所述,当局部施用时,植物乳杆菌HEAL 19和99菌株显示出用作改变皮肤特性和皮肤健康的药剂的高度综合潜力。
在本发明的上下文中,术语“皮肤”是指非粘膜皮肤的皮肤。特别是,术语“皮肤”不涵盖在体腔中发现的粘膜,诸如例如,口腔、胃、肠、支气管、肛门或阴道粘膜。因此,术语“局部施用”是指药剂和/或配方在皮肤上的施用,并且不包括在被粘膜覆盖的体腔内部的任何施用。优选地,皮肤仍保持未受到如严重伤害或烧伤的明显损害的保护功能。
在本发明的上下文中,“通过局部施用”是指微生物、或包含在此说明的微生物的制剂、药物或美容组合物或者产品通过局部施用而在皮肤上直接给药,即直接用到皮肤表面。
在本发明的上下文中,“皮肤问题”是指与皮肤的医学问题相关的皮肤的任何状态,优选地除了伤害或烧伤之外。“皮肤问题”优选地涉及以诸如瘙痒等不适感为特征的状态,或者表示由于细菌生长引起的美容问题,诸如脱皮、干燥、发红、皮疹、痤疮、油腻或体臭。皮肤问题的示例如下。
植物乳杆菌HEAL 19菌株已由位于瑞典隆德
在优选实施例中,已经对微生物进行了热处理,优选导致微生物的失活、减毒或死亡的热处理。优选地,经过热处理的微生物具有完整的物理结构。
可以通过超声波、紫外线照射或加热来进行热处理。优选地,通过加热至60至121℃1秒至120分钟,诸如20秒至120分钟来进行。在优选实施例中,优选在70至100℃之间进行热处理20秒至15分钟,优选使用工业巴氏灭菌器。优选地,微生物是死亡的且因此不能再繁殖。优选地,经热处理的微生物仍具有完整的物理结构,这意味着热处理没有破坏细胞结构,并且可以传递包含代谢产物的微生物。有利的是,在热处理过程中,微生物通常保持其赋予治疗在此说明的皮肤问题有益效果的能力,并且由于不需要有活性的微生物来实现本发明的目的这一事实,有可能将它们与防腐剂组合在一起。这对于大多数施用非常重要,因为药物和美容产品通常包含防腐剂,以防止在产品用完之前反复打开和关闭容器期间细菌或真菌在产品中生长。
要治疗和/或预防的皮肤问题优选为皮肤屏障功能丧失、炎症性皮肤问题和/或病原微生物生长。
在本发明的上下文中,“皮肤屏障”一方面是指角质层的物理和化学屏障,其防止物质进入体内并防止变干,但另一方面也涉及感应性AMP屏障,其与如pH值的其他化学性质一起可防御微生物病原体的定殖或入侵。因此,“皮肤屏障功能丧失”,还包括“皮肤屏障功能下降”,其意味着正常或健康的皮肤结构和/或功能被破坏,从而不再能够提供令人满意的上述保护或防御。然而,优选地,这种破坏不是诸如割伤或严重烧伤之类的伤害。
“炎症性皮肤问题”是由皮肤对诸如刺激物或病原微生物的有害刺激(病原)的生物反应所引起的问题,其通常会导致患处发红、肿胀、发热和/或疼痛。炎性介质,诸如炎性细胞因子或趋化因子,例如白介素8(IL-8),可以在受影响的组织中测得,以评估炎症状态。
诸如细菌或真菌的“病原微生物”在皮肤上或皮肤中的生长会导致感染和/或发炎,但也会引起美容问题,诸如皮疹、痤疮或体臭。特别是,“病原微生物生长”是指病原微生物的数量增加,以致其超过皮肤上或皮肤中与健康微生物组相关的水平。其尤其是指微生物感染。
上述三个方面是紧密联系的。例如,屏障功能丧失会导致病原微生物或有害物质的入侵,进而引起炎症。
在优选实施例中,将所述微生物用作药剂来:
(a)增强皮肤屏障功能,和/或
(b)减少经表皮水分流失,和/或
(c)诱导丝聚蛋白表达,和/或
(d)增加与天然保湿因子有关的组分,和/或
(e)提供抗炎活性,特别是降低和/或抑制炎症参数,和/或
(f)提供趋化因子诱导的抗炎活性,和/或
(g)提供由外部病原,诸如病原微生物,特别是金黄色葡萄球菌,和/或空气污染物,和/或紫外线辐射和/或表面活性剂诱导的抗炎活性,和/或
(h)抑制病原微生物,特别是金黄色葡萄球菌的生长和/或入侵和/或感染,和/或
(i)诱导抗菌肽(AMP)的表达,和/或
(j)维持和/或建立和/或恢复皮肤微生物组的健康状态,和/或
(k)改善皮肤的免疫反应。
发现植物乳杆菌菌株HEAL 19和HEAL 99能够以不同方式增强皮肤屏障。例如,它们可以通过诱导丝聚蛋白的表达来减少经表皮水分流失(TEWL),这对于调节表皮稳态,特别是保水至关重要。此外,已显示菌株增加了与天然保湿因子有关的组分,这对于适当的角质层水合作用和屏障稳态同样起着重要作用。另一方面,在有助于增强皮肤屏障功能的另一方面,该菌株可以诱导抗菌肽(AMP)的表达,从而加强保护以防止诸如细菌和真菌之类的病原微生物的入侵。
在本发明的上下文中,基因的“诱导”或上调表达可以使用参考基因来确定,例如,所谓的看家基因,其表达在不同组织或不同条件下均无明显变化。适于作为人体细胞中的参考基因的基因是技术人员已知的。在以下的实验过程中,解释了使用参考基因作为标准来确定表达的诱导或上调。
进一步发现植物乳杆菌菌株HEAL 19和HEAL 99可以减少皮肤中的炎症介质,诸如IL-8,这种炎症介质响应于不同的刺激而释放,诸如外部病原,例如病原微生物或污染物。因此,它们可以减少炎症反应和相关症状。
另外,植物乳杆菌菌株HEAL 19和HEAL 99显示出对病原微生物特别是金黄色葡萄球菌的生长具有抑制作用。它们诱导抗菌肽(AMP)的表达,从而增强皮肤的免疫反应,并能够维持或建立健康的皮肤微生物组。健康的微生物组由某些无害甚或有益的微生物(数量)的平衡定殖来表示。当这种平衡转变为一种称为微生物失调的状态时,可能会产生有害影响。
由于上述各种相互关联的作用,植物乳杆菌菌株HEAL 19和HEAL 99可用于预防和/或治疗多种医学问题,也可改善皮肤外观和其他美容方面,诸如体臭。
在优选实施例中,皮肤问题选自由特应性皮炎、微生物感染、干性皮肤、皮肤瘙痒、敏感性皮肤、特应性皮肤、皮肤炎症、微生物失调、酒渣鼻、牛皮癣、皮疹和痤疮组成的组。
本发明还涉及一种制剂,其包含一种微生物或两种微生物的混合物和载体,或者由一种微生物或两种微生物的混合物和载体组成,所述微生物选自由植物乳杆菌HEAL19(DSM 15313)和植物乳杆菌HEAL 99(DSM 15316)组成的组,其中,所述制剂为微粒制剂,优选为颗粒或粉末。
已经发现,对于本发明而言,以带有载体的微粒制剂的形式传递微生物是特别有利的。微粒制剂,尤其是干燥的颗粒或粉末,比例如悬浮液更稳定,且在施用前存放时具有明显更长的保存期限。因此,不需要防腐剂来稳定制剂,并且不需要特殊的储存措施,诸如冷却。即使在更长的储存时间内,制剂也不会变色或有其他变质迹象。此外,就微生物的分布而言,微粒制剂是均质的,并且没有会影响均质性的不良效果,诸如沉淀或凝聚。因此,微粒制剂也可以容易且高效地被加工成药物或美容组合物或者产品。
在本发明的上下文中,“微粒制剂”是由不同微粒组成的制剂。优选地,微粒体积均一且微生物和载体分布均匀,并且干燥且可流动,不会趋于结块。特别是,微粒制剂可以是颗粒或粉末。这种微粒制剂或颗粒或粉末可以包含平均粒径为0.1至200μM,优选1至100μM范围内的微粒,或者由平均粒径为0.1至200μM,优选1至100μM范围内的微粒组成。
根据本发明的微粒制剂可以通过将微生物与载体冷冻干燥、喷雾干燥或造粒来获得。
在上述制剂的优选实施例中,微生物已经过热处理,并且优选为减毒的或死亡的微生物。但是,如上所作说明,优选地,经热处理的微生物仍具有完整的物理结构。
有利地,微生物在热处理期间相对于皮肤问题的局部治疗保持其有益特性。因此,由于不需要具有活性的微生物,该制剂可用在包含防腐剂的药物或美容产品中。
在根据本发明的制剂中使用的载体是一种材料,其适合以颗粒形式提供,例如通过冷冻干燥、喷雾干燥或造粒获得。更重要的是所述载体是药学和美容可接受的材料。
在如上所述的制剂中,所述载体可以选自由多糖,优选菊粉、淀粉、阿拉伯胶、乳清蛋白、脱脂奶粉和麦芽糊精及其组合物组成的组,优选为麦芽糊精。
在本发明的上下文中已经发现,微生物与载体之比对于制剂的性质是决定性的。如果使用的载体例如麦芽糊精太少,该制剂通常会具有吸湿性,这会对稳定性产生不利影响并加速结块的趋势。
在优选实施例中,在上述制剂中,微生物与载体之比为1∶9至3∶7,优选1.5∶8.5至2.5至7.5,和/或所述制剂包含10至30重量%的微生物和70至90重量%的载体,优选为15至25重量%的微生物和75至85重量%的载体,每种情况下都以该制剂的总重量计。
本发明还涉及一种根据上述任一实施例的制剂,其用于通过局部施用来治疗和/或预防皮肤问题。特别地,要治疗和/或预防的皮肤问题是皮肤屏障功能丧失、炎症性皮肤病和/或病原微生物生长,优选地,皮肤问题选自由特应性皮炎、微生物感染、干性皮肤、皮肤瘙痒、敏感性皮肤、特应性皮肤、皮肤炎症、微生物失调、酒渣鼻、牛皮癣、皮疹和痤疮组成的组。
本发明还涉及一种生产制剂的方法,所述制剂包含一种微生物或两种微生物的混合物和载体,或者由一种微生物或两种微生物的混合物和载体组成,该微生物选自由植物乳杆菌HEAL 19(DSM 15313)和植物乳杆菌HEAL 99(DSM 15316)组成的组,优选为根据上述任一实施例的制剂,该方法包括以下步骤:
(1)提供选自由植物乳杆菌HEAL 19(DSM 15313)和植物乳杆菌HEAL 99(DSM15316)组成的组的一种微生物或两种微生物的混合物;
(2)可选地,对步骤(1)的微生物进行热处理,优选在60至121℃的温度下进行热处理1秒至120分钟;以及
(3)将步骤(1)或(2)中的微生物与载体组合,并进一步处理所得组合物以得到颗粒或粉末,优选通过冷冻干燥、喷雾干燥或造粒进行处理。
上述方法表示了用于本发明目的的一种非常有利的处理微生物的方法,因为所得的制剂如上所述非常稳定,并且可以容易且高效地被加工成各种药物或美容产品。
根据另一方面,本发明还涉及一种供局部施用于皮肤的药物或美容组合物或药物或美容产品,包括选自由植物乳杆菌HEAL 19(DSM 15313)和植物乳杆菌HEAL 99(DSM15316)组成的组的一种微生物或两种微生物的混合物或包含一种根据上述任一实施例的制剂,其中,微生物的总量足以治疗和/或预防皮肤问题,特别是炎症性皮肤问题、皮肤屏障功能丧失和/或病原微生物生长,优选地,其中,微生物的总量干重在0.01%至5%之间,优选干重在0.02%至1%之间,诸如干重为0.1%至1%,每种情况下都以组合物的总重量计,和/或其中,以每克计,所述微生物的总量至少为10
令人惊讶地发现,植物乳杆菌HEAL 19和植物乳杆菌HEAL 99能够以低至药物或美容组合物或者产品干重的0.01或0.02%的浓度提供在此说明的效果。
例如,乳杆菌悬浮液或更优选地如上所述的微粒制剂可以被用作各种药物或美容施用的活性成分,诸如局部免洗或冲洗型配方。含有有效量的组合物可用于降低皮肤敏感性或治疗皮肤病,如干燥、皮肤瘙痒或特应性皮炎。所述组合物适合于特应性皮肤的连续治疗以及施用在特定的受影响皮肤区域,如损伤、刮伤或伤口。此外,所述组合物可以每天使用,用于维持完整屏障以及皮肤微生物组的健康状态。
在药物或美容组合物或者产品的优选实施例中,所述微生物已经过热处理,并且优选为减毒或死亡微生物,但仍具有完整的物理结构。对于热处理的条件,以上定义的参数相应地适用。
有利地,由于微生物在热处理期间一般相对于皮肤问题的局部治疗保持其有益特性,并且不需要具有活性的微生物,因此药物或美容产品可以包含防腐剂。
因此,在优选实施例中,根据在此说明的任一实施例的药物或美容组合物或者产品包含至少一种防腐剂。
在本发明的上下文中,“防腐剂”是指抑制或压制微生物生长的物质。
本发明还涉及一种如上所述的药物或美容组合物或者产品,其用于通过局部施用来治疗和/或预防皮肤问题,特别是皮肤屏障功能丧失、炎症性皮肤问题和/或病原微生物生长。
由于植物乳杆菌菌株HEAL 19和HEAL 99在局部施用于皮肤时具有上述a)至k)的效果,因此,如上所述,包含有效量的一种或两种菌株的组合物和产品可以有效治疗和/或预防各种皮肤问题并改善皮肤外观。
根据本发明的所述组合物和产品旨在在皮肤上局部施用,因此优选适合在皮肤上局部施用的配方。这样的配方可以是免洗型或冲洗型配方。
在另一优选实施例中,如上所述的药物或美容组合物或者产品选自由水包油或油包水型乳剂、软膏、乳霜、乳液和啫喱组成的组。
所述组合物和产品可以包含提供适合施用在皮肤上的性质的其他成分。因此,优选的是还包含一种或多种选自由载体、赋形剂和其他活性成分组成的组的药物或美容组合物或者产品,该组分优选自麦芽糊精、菊粉、润肤剂和植物油。
本发明还涉及一种用于生产药物或美容组合物或者产品(优选地,一种根据在此说明的任一实施例的药物或美容组合物或者产品)的方法,其包括以下步骤:
(1)提供选自由植物乳杆菌HEAL 19(DSM 15313)和植物乳杆菌HEAL 99(DSM15316)组成的组的一种微生物或两种微生物的混合物,优选地,其中,该微生物已经过热处理,并且优选为具有完整物理结构的减毒或死亡微生物,或提供一种根据上述任一实施例的制剂或一种通过上述方法生产的制剂,以及
(2)将步骤(1)中的微生物或制剂与选自载体、赋形剂和其他活性成分的一种或多种物质组合以得到一种药物或美容组合物或者产品。
在该方法的优选实施例中,在步骤(2)中,将至少一种防腐剂与步骤(1)的所述微生物或制剂组合。
根据本发明,植物油可以选自由摩洛哥坚果油、苦莓(籽)油、鳄梨油、桃(核)油、菜籽油、黑种草油、南瓜(南瓜子)油、野玫瑰花(籽)油、石榴籽油、荷荷芭(液体蜡)油、可可/可可脂、麦芽油、椰子油、红花油、玉米油、山茶油、亚麻籽油、澳洲坚果油、覆盆子籽油、绣线菊籽油、西番莲籽油、杏仁油、苦楝油、辣木油、琉璃苣油、橄榄油、花生油、榛子油、核桃油、棕榈油、木瓜籽油、欧芹籽油、沙棘油、蓖麻油、大米油、芝麻油、乳木果油/karité黄油、向日葵油、大豆油、琼崖海棠油、月见草油、葡萄籽油、蔓越莓籽油组成的组。
根据本发明,其他合适的油体可以选自由基于具有6至18个,优选8至10个碳原子的脂肪醇的格尔伯特醇、直链C
在根据本发明的组合物和产品中,优选地,植物乳杆菌菌株HEAL 19和HEAL 99与用于预防、减少或缓解干燥和/或皮肤瘙痒问题的一种或多种(其他)物质和/或一种或多种皮肤刺激减少剂组合使用,特别是选自由抗炎剂、生理降温剂和减轻皮肤发红的化合物组成的组的一种或多种物质,优选地,其中,所述一种或多种附加物质选自由以下物质组成的组:
(1)止痒化合物,
(2)皮质甾类的甾体抗炎物质,特别是氢化可的松、诸如氢化可的松17-丁酸酯的氢化可的松衍生物、地塞米松、磷酸地塞米松、甲基强的松龙或可的松,
(3)非甾类抗炎物质,特别是诸如吡罗昔康或替诺昔康的奥昔康姆、诸如阿司匹林、双盐、舒普林或芬度柳的水杨酸盐、诸如双氯芬酸、芬氯芬酸、消炎痛、舒林酸、托美汀或克林达那克的乙酸衍生物、诸如甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸或尼氟洛芬的芬那酯、诸如布洛芬、萘普生或苯恶洛芬的丙酸衍生物、以及诸如苯基丁氮酮、氧苯基丁氮酮、草柏灵或氮杂丙烷的吡唑,
(4)天然或天然存在的抗炎物质或减轻发红和/或瘙痒的物质,特别是洋甘菊、芦荟、没药属、茜草属、柳树、柳草、燕麦、金盏花、山金车、圣约翰草、金银花、迷迭香、西番莲、金缕梅、生姜或松果菊的提取物或级分、或其单一活性化合物,
(5)α-红没药醇、芹菜素、芹菜素-7-葡萄糖苷、姜醇、姜烯酚、姜二醇、脱氢姜二酮、姜酮酚、天然燕麦生物碱、非天然燕麦生物碱,优选二氢燕麦生物碱D、乳香酸、植物甾醇、甘草甜素、光甘草定和甘草查尔酮A,优选是纯净物质的形式,
(6)皮肤护理剂,优选为皮肤保湿调节剂或皮肤修复剂,优选选自由乳酸钠、脲和衍生物、甘油、丙二醇、1,2-戊二醇、1,2-己二醇和1,2-辛二醇、胶原蛋白、弹性蛋白或玻尿酸、己二酸二酰基酯、凡士林、尿酸、卵磷脂、尿囊素、泛醇、植物三醇、番茄红素、类神经酰胺(优选神经酰胺2、羟丙基双棕榈酰胺MEA、鲸蜡氧丙基甘油基甲氧丙基肉豆蔻酰胺、N-(1-十六烷酰基)-4-羟基-L-脯氨酸(1-十六烷基)酯、羟乙基棕榈氧基羟丙基棕榈酰胺)、鞘糖脂、胆固醇、植物甾醇、壳聚糖、硫酸软骨素、羊毛脂、羊毛脂酯、氨基酸、维生素E及其衍生物(优选生育酚、乙酸生育酚酯)、α-羟基酸(优选柠檬酸、乳酸、苹果酸)及其衍生物、单糖、二糖和低聚糖,优选葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、紫苏糖和乳糖、诸如β-葡聚糖,特别是燕麦中的1,3-1,4-β-葡聚糖的聚糖,α-羟基脂肪酸、诸如白桦脂酸或熊果酸的三萜酸、以及藻类提取物或其单一活性化合物组成的组,
(7)生理降温剂,优选地,选自由薄荷酮甘油缩醛、乳酸薄荷酯(优选1-乳酸薄荷酯,特别是1-乳酸1-薄荷酯)、草酸薄荷基乙酯、取代的薄荷基-3-羧酸酰胺(例如薄荷基-3-羧酸N-乙基酰胺、N
(8)组胺受体拮抗剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、TRPV1拮抗剂、NK1拮抗剂、大麻素受体激动剂和TRPV3拮抗剂。
根据另一方面,本发明还涉及一种在皮肤上局部施用的微生物或者包含两种微生物或由两种微生物组成的混合物的美容用途,特别是用于改善皮肤外观和/或预防体臭的美容用途,其中,所述微生物选自由植物乳杆菌HEAL 19(DSM 15313)和植物乳杆菌HEAL 99(DSM 15316)组成的组,优选地,其中,微生物已经过热处理和/或是具有完整物理结构的减毒或死亡微生物。
“美容用途”是非治疗用途,即在外观受到例如刺激、发红、干燥、脱皮、皮疹、衰老迹象或轻度痤疮影响的皮肤上的用途,这些表示美容问题或轻微不适,但不会被视为病理性疾病。另一种“美容用途”是预防或减少体臭,这与某些微生物在皮肤上的生长有关,这些微生物会引起难闻的气味,但并不表示其对被影响人的健康有直接的危险。
因此,上述美容用途优选用于减少或预防皮肤刺激、皮肤干燥、皮疹、痤疮、体臭和/或皮肤老化。
在根据本发明的美容用途中,将所述微生物用作药剂来:
(a)增强皮肤屏障功能,和/或
(b)减少经表皮水分流失,和/或
(c)诱导丝聚蛋白表达,和/或
(d)增加与天然保湿因子有关的组分,和/或
(e)提供抗炎活性,特别是降低和/或抑制炎症参数,和/或
(f)提供趋化因子诱导的抗炎活性,和/或
(g)提供由外部病原(诸如病原微生物,特别是金黄色葡萄球菌)和/或空气污染物和/或紫外线辐射和/或表面活性剂诱导的抗炎活性,和/或
(h)抑制病原微生物特别是金黄色葡萄球菌的生长和/或入侵和/或感染,和/或
(i)诱导抗菌肽(AMP)的表达,和/或
(j)维持和/或建立和/或恢复皮肤微生物组的健康状态,和/或
(k)改善皮肤的免疫反应。
(a)至(k)项所述的效果以及上文更详细说明的效果,也表示了一种适当的组合,以解决许多纯粹的美容问题。例如,皮肤屏障功能丧失可能会导致经表皮水分流失增加,导致皮肤干燥,表现出刺激迹象,诸如发红或脱皮,从而影响皮肤外观。丝聚蛋白的上调和与天然保湿因子有关的组分的增加防止或缓解了这种问题。抗炎活性可减少因皮肤对某些刺激的反应而引起的肿胀或发红,这会影响皮肤的外观,但并不表示病理状况。抑制病原微生物的生长,例如,通过诱导AMP的表达可以解决轻度痤疮或预防和减少体臭。
在上述美容用途的优选实施例中,所述微生物以根据上述任一实施例的制剂的形式使用。
在另一方面,本发明还涉及一种用于改善皮肤外观和/或预防体臭的美容方法,特别是用于减少或预防皮肤刺激、皮肤干燥、皮疹、痤疮体臭和/或皮肤老化的美容方法,其包括以下步骤:
1)将微生物或者包含两种微生物或由两种微生物组成的混合物局部施用于皮肤,其中,所述微生物选自由植物乳杆菌HEAL 19(DSM 15313)和植物乳杆菌HEAL 99(DSM15316)组成的组;或者将上述制剂或美容组合物或者产品施用于皮肤,优选地,其中,微生物已经过热处理和/或是具有完整物理结构的减毒或死亡微生物。
“美容方法”是一种解决美容问题但不治疗病理状况的非治疗方法,如以上在美容用途中更详细说明的。在根据本发明的美容方法中,所述微生物充当药剂以提供上文(a)至(k)项中描述的效果,并因此能够解决上述美容用途中所解释的许多美容问题。
附图说明
图1示出了HaCaT角质形成细胞中植物乳杆菌HEAL 19对抗菌肽的诱导作用。被明显诱导的基因是β-防御素3、β-防御素4、肽酶抑制剂3、RNase 7、银屑素、乳酸转铁蛋白和分泌性白细胞肽酶抑制剂。使用基因阵列,用0.05%植物乳杆菌HEAL 19处理24小时后,测量HaCaT角质形成细胞中抗菌肽的基因表达;诱导被定义为计算得到的RQ值>2。
图2示出了HaCaT角质形成细胞中植物乳杆菌HEAL 19对β-防御素3的浓度依赖性诱导。用各种浓度的植物乳杆菌HEAL 19处理HaCaT角质形成细胞24小时。这导致计算得到的RQ值为243.6(0.1%植物乳杆菌HEAL 19)到2.3(0.0125%植物乳杆菌HEAL 19)。
图3示出了24小时处理后AMP编码基因的各种诱导。用植物乳杆菌HEAL 99浓度(测试0.1%和0.05%)依赖性地诱导RNase 7、β-防御素3、肽酶抑制剂3、磷脂酶A2和分泌型白细胞肽酶抑制剂。
图4示出了植物乳杆菌HEAL19和99及地塞米松的抗炎作用,地塞米松作为阳性对照而被诱导。融合的HaCaT角质形成细胞用测试材料0.1mg/mL的植物乳杆菌HEAL 99、0.25mg/mL的植物乳杆菌HEAL 19和30μM的地塞米松预处理。温育48小时后,使用30ng/mL促炎性IL-1α刺激角质形成细胞8小时。使用ELISA,在细胞培养基中测量用植物乳杆菌HEAL19和HEAL 99预处理后由于IL-1α刺激而从HaCaT角质形成细胞释放的后续白介素8。示出了与阳性对照地塞米松和未预处理的角质形成细胞(IL-1α对照)的对比。
图5示出了用安慰剂和植物乳杆菌HEAL 19配方处理离体人体皮肤模型并用柴油颗粒1650b刺激(模拟空气污染)后IL-8的释放(纵坐标轴)。
图6示出了用植物乳杆菌HEAL 19预处理后由于金黄色葡萄球菌刺激而引起的HaCaT角质形成细胞的白介素8释放。示出了与未预处理的角质形成细胞(金黄色葡萄球菌对照)的对比。
图7示出了金黄色葡萄球菌以剂量依赖性方式的生长抑制作用,即当用0.1%和/或0.05%植物乳杆菌HEAL 19处理时。示出了与阳性生长对照和阴性对照的对比(抑制对照,添加杀生物剂法尼醇)。
图8示出了用各种浓度的植物乳杆菌HEAL 19(x轴)处理后在离体人体皮肤模型(纵坐标轴)中内披蛋白的产生。示出了与仅包括媒介物(DMSO)的阴性对照的对比。
图9示出了用各种浓度的植物乳杆菌HEAL 19(x轴)处理后在离体人体皮肤模型(纵坐标轴)中细胞角蛋白14(CK14)的产生。示出了与仅包括媒介物(DMSO)的阴性对照的比较。
图10示出了用安慰剂和植物乳杆菌HEAL 19配方离体治疗并用柴油颗粒1650b刺激后若丹明B的检测百分比(纵坐标轴)。
图11示出了在干性皮肤的3D表皮模型系统中测量的每1000nm2细胞间空间的细胞间脂质薄片的长度(nm)。该薄片由于SDS处理而受到干扰。在皮肤护理配方中用0.5%植物乳杆菌HEAL 19处理后,使用透射电子显微镜技术(TEM)测定皮肤修复性能。
图12示出了用植物乳杆菌HEAL 19和HEAL 99处理后HEPKp三维皮肤模型(纵坐标轴)的玻尿酸释放。示出了与仅包括细胞培养基的阴性对照(培养基对照),x轴的对比。
图13示出了用植物乳杆菌HEAL 19和HEAL 99处理后HEPKp三维皮肤模型(纵坐标轴)的丝聚蛋白释放。示出了与仅包括细胞培养基的阴性对照(培养基对照),x轴的对比。
图14示出了用两种不同浓度的植物乳杆菌HEAL 19处理后在离体人体皮肤模型中的丝聚蛋白含量。示出了与仅包括媒介物(DMSO)的阴性对照的对比。
图15示出了在美容乳霜中用浓度为1%的植物乳杆菌HEAL 19处理后通过体内人体皮肤中的电容确定的水含量。灰色阴影条代表具有植物乳杆菌HEAL 19的乳霜,白色条代表安慰剂乳霜,黑色条代表未处理。
图16示出了在美容乳霜中用浓度为1%的植物乳杆菌HEAL 19处理后通过体内人体皮肤中的经表皮水分流失确定的皮肤屏障强度。灰色阴影条代表具有植物乳杆菌HEAL19的乳霜,白色条代表安慰剂乳霜,黑色条代表未处理。
图17示出了在MRS培养基中超过16小时的植物乳杆菌属的生长曲线;起始OD=0.1;平均3个腔。
具体实施方式
通过以下示例进一步说明本发明,这些示例不应理解为对范围的限制。
示例中使用了以下实验过程:
可以在各种培养基中获得植物乳杆菌菌株HEAL 19和HEAL 99的生长。碳源可以是葡萄糖或淀粉。肉类提取物、酵母提取物、蛋白胨或蛋白酶蛋白胨(植物)等可用作氮源。培养基的pH值应约为6。培养温度是可变的,但优选37℃。培养时间可以约为8至24小时。可以添加震荡或充气震荡。
培养后,可以添加洗涤过程。可以按如下方式进行。首先可以通过离心收集细胞,倒出上清液,并用液体PBS、细胞培养基或纯净水悬浮细胞团块。如果需要,可以重复上述过程。
乳杆菌悬浮液的热处理可以在洗涤过程之前或之后进行。可以通过超声、紫外线照射或加热来实现,然而优选热处理。可以在60℃至121℃的温度范围内进行。对于高于100℃的温度,可以使用高压釜。热处理持续时间可以从1秒到120分钟,诸如20秒到120分钟。优选使用工业巴氏灭菌器在70至100℃之间进行20秒至15分钟的热处理。对经过热处理的乳杆菌的可选进一步处理可以包括冷冻干燥、喷雾干燥、造粒等。这可以用于改善产品本身的适用性和/或稳定性。
成品可以是粉末、颗粒、悬浮液或溶液,并且被定义为以0.001至10%w/v的浓度用于美容组合物中。这与1x10
使用
在Cascade Biologics公司的Gibco EpiLife培养基,包括Life Technologies公司的Gibco HKGS中培养HaCaT角质形成细胞。将测试物质在相等的培养基中稀释,并在6孔板上每孔加入2mL的体积。所有样本均在37℃,5%CO
裂解细胞并用乙醇沉淀,使用离心柱将匀浆洗涤3次,并用纯净水洗脱mRNA。根据样本,略微调整了该过程。
使用μCuvetteG 1.0和Eppendorf公司的BioPhotometer测量260nm处的吸收来测量RNA浓度。同时计算控制值,如E260/280或E260/230。每个样本最少转录0.5-1μg RNA。
使用Applied Biosystems公司的高容量RNA-to-cDNA Kit进行逆转录。该过程基于所提供的实验方案。在Biometra公司的PCR热循环仪中温育所有样本,该热循环仪在37℃下运行60分钟以进行逆转录,然后在95℃下进行5分钟(酶灭活)并在反应室中将温度保持在4℃。
使用Applied Biosystems公司的StepOne Plus Fast Real Time PCRInstrument来进行定量实时PCR。RT-PCR的初始步骤包括第一加热阶段,在95℃下保持20秒,然后在95℃下进行3秒40个cDNA变性循环,并在60℃下退火/拉伸30秒。
通过2-ΔCT Method来进行分析,详情如下:
1.使用参考基因(HPRT)对Ct值进行标准化
ΔC
2.减去对照样本的ΔC
ΔΔC
3.计算RQ-Ratio(相对定量值)
RQ-value=2
RQ值>2被定义为基因的相关诱导。
使用RPMI-A在96孔板中培养HaCaT角质形成细胞,用Capricorn公司的L-谷氨酰胺对培养基进行无菌过滤,再补以Capricorn公司的10%胎牛血清(FCS)。将板在37℃和5%CO
IL-8浓度是通过R&D Systems下Development Systems的DuoSet ELISA的人体CXCL8/IL-8来测量的。实验过程按照提供的方案中所述的进行。
在计算出重复/三重值的平均值并减去平均零标准光密度之后,使用四参数对数曲线拟合创建标准曲线来进行该计算。
培养人体表皮角质形成细胞祖细胞(HEPKp)生成的3d人体皮肤模型,并用测试物质进行系统地处理。简而言之,将定义浓度的测试物质添加到细胞培养基中,并在细胞培养皿中于37℃和5%CO
使用TECOmedical玻尿酸加ELISA测量玻尿酸浓度。实验过程按照提供的方案中所述的进行。
在620nm处用光度法测量各种细菌的生长曲线。
金黄色葡萄球菌的抑制:
根据DIN58940-8,用高压灭菌的CASO介质(MERCK 1.05459)和溶于DMSO或蒸馏水的测试物质制备96孔MTP。使用保持在-20℃的10%甘油中的母代培养物,将相关孔接种金黄色葡萄球菌(DSM799/ATCC6538)。每孔加入1-6×10
为了进行计算,计算检测到的吸收的平均值,并用空白值进行了归一化。将这些OD值绘制成时间函数,以便进行图形演示。
三维皮肤模型源自人体表皮角质形成细胞祖细胞(HEPKp),并在CnT-PR-3D培养基中用测试物质进行系统地处理4至9天。通过Cloud-Clone Corp.的ELISA,Enzyme-linkedImmunosorbent Assay Kit在培养基中检测丝聚蛋白释放。
为此目的,对针对干性皮肤的3D表皮模型系统进行了体外研究。该模型系统由14天龄的成熟表皮细胞培养物组成,由于SDS处理,其具有受到干扰的表皮屏障。表皮屏障的干扰被测量作为细胞间脂质薄片的损失。在用美容乳剂或安慰剂乳剂中配制的植物乳杆菌HEAL 19处理后,使用透射电子显微镜技术(TEM)确定皮肤修复性能,然后进一步培养以观察细胞间脂质薄片的重构。
离体试验由意大利的Cutech Srl进行。在离体皮肤模型中分析了所述乳杆菌菌株对各种参数的影响。使用来自腹部整形手术的人体皮肤。热灭活细菌悬浮液的施用是系统地或局部地以配方的形式或溶解在细胞培养基中来进行的。可以使用胶带剥离。浓度和温育时间可能会有所不同。
针对每种处理,以均值、标准差和均值标准误差(SEM)来处理所有数据。
表皮丝聚蛋白、内披蛋白和细胞角蛋白14
为进行分析,用选定的抗体丝聚蛋白兔多克隆[H-300]、内披蛋白小鼠单克隆(SY5)和/或细胞角蛋白14(CK14)兔单克隆(EPRl7350)对模型进行免疫染色。通过估计表皮中红色染料的强度和分布来评估每个玻片中存在的抗原量。针对基膜的长度,将获得的数据归一化。
皮肤屏障完整性(若丹明B)
在施用柴油颗粒之前(即1650b),已经用植物乳杆菌菌株对离体皮肤模型进行了局部处理。所有皮肤样本均已在35℃,5%CO
抗炎作用
上述离体人体皮肤模型已经用于验证植物乳杆菌菌株的抗炎潜力。该模型先用植物乳杆菌HEAL 19美容乳剂处理,然后施用外部有害剂和污染物1650b,模拟空气污染。在选定的端点处,器官细胞培养基已从孔中取出,并使用
在巴西的KosmoscienceCiência&TecnologiaCosméticaLtda进行了体内试验。他们在施用含有植物乳杆菌HEAL 19冻干物的美容o/w配方后评估了相关的皮肤参数。
o/w乳剂具有以下成分:
22名皮肤特别干燥的受试者参加了该研究。在前臂内侧每日两次局部施用乳剂。在第0、7、14和21天进行测量。
通过角质测量术测定皮肤水合作用
使用耦合到多探头适配器MPA 5(德国Ckeletronics公司)的
通过蒸发测定法测定皮肤屏障的有效性
使用耦合到多探头适配器MPA 5(德国Ckeletronics公司)的
以下结果证明了本发明的效能。单个实验应说明但不限制本发明的效果。
植物乳杆菌HEAL 19诱导人体角质形成细胞中多种抗菌肽的释放。所有这些肽一起代表人体皮肤复杂的防御系统。例如,能够杀死革兰氏阳性细菌的防御素被上调。总之,上调的肽对广泛的潜在病原革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、真菌、真核寄生虫和/或病毒有效。
图1示出了用0.05%植物乳杆菌HEAL 19处理24小时后在HaCaT角质形成细胞中抗菌肽的基因表达。已经使用基因阵列对基因表达进行了测量;诱导被定义为计算得到的RQ值>2。
结果表明,用植物乳杆菌HEAL 19处理可以诱导重要的AMP,如β-防御素1、3或4和/或银屑素和/或钙卫蛋白。这种处理导致AMP在人体皮肤中的表达水平更高,这与人体皮肤更强的第一道防线有关,从而支撑皮肤屏障。此外,在诸如特应性皮炎之类的疾病中,β-防御素或抗菌肽的诱导表达可以平衡AMP指纹。因此,可以通过处理植物乳杆菌HEAL 19来恢复、维持和/或改善皮肤微生物组。
植物乳杆菌HEAL 19对AMP的诱导是浓度依赖性的。在图2中,示出了β-防御素3的浓度依赖性诱导。用各种浓度的植物乳杆菌HEAL 19处理HaCaT角质形成细胞24小时。这导致计算得到的RQ值为243.6(0.1%植物乳杆菌HEAL 19)到2.3(0.0125%植物乳杆菌HEAL19)。
当处理HaCaT角质形成细胞时,使用植物乳杆菌HEAL 99可以观察到类似的效果。图3示出了24小时处理后AMP编码基因的示例性各种诱导。用植物乳杆菌HEAL 99浓度依赖性地(测试0.1%和0.05%)诱导RNase 7、β-防御素3、肽酶抑制剂3、磷脂酶A2和分泌型白细胞肽酶抑制剂。使用植物乳杆菌HEAL 19已经发现了类似的结果。
在表皮3D人体皮肤模型中,已经示出了各种AMP编码基因被类似地诱导(数据未示出)。
皮肤疾病、病变或刺激大多与受影响的皮肤区域发炎有关。结果表明,除了所述的乳杆菌菌株的有益作用外,它们的局部施用还具有抗炎作用。在这方面,乳杆菌菌株通过另一种机制支持皮肤健康。
图4示出了植物乳杆菌HEAL 19和99和地塞米松的抗炎作用,地塞米松作为阳性对照而被诱导。融合的HaCaT角质形成细胞用测试材料0.1mg/mL的植物乳杆菌HEAL99、0.25mg/mL的植物乳杆菌HEAL 19和30μM的地塞米松预处理。温育48小时后,使用30ng/mL促炎性IL-1d刺激角质形成细胞8小时。使用ELISA,测量随后IL-8在细胞培养基中的释放。与未经预处理的IL-1d对照相比,通过施用乳杆菌菌株,HaCaT的IL-8释放可以分别降至12.6%和5.1%(Heal 99和Heal 19)。这些抗炎作用类似于地塞米松中的一种(降至20.4%),表明这两种菌株的抗炎效力并凸显了它们用于舒缓皮肤方面的潜力。
已经表明,在离体人体皮肤模型中可以看到植物乳杆菌HEAL 19的类似抗炎作用。如图5所示,在用柴油颗粒(1650b)刺激从而模拟空气污染之后,与安慰剂对照相比,在植物乳杆菌HEAL 19处理的模型中,细胞培养基中的IL-8检测降至75%。通过使用含有植物乳杆菌HEAL 19的美容配方进行局部处理,可以改善皮肤的屏障完整性,镇定和舒缓皮肤。
皮肤中的炎症不仅可以由促炎性细胞因子引起,而且可以由细菌,特别是对皮肤致病的细菌,通过细胞与细胞的接触引起。图6示出了用0.25mg/mL植物乳杆菌HEAL19预处理48小时的HaCaT角质形成细胞大大减少了金黄色葡萄球菌诱导的炎症。与仅金黄色葡萄球菌刺激对照相比,培养基中的IL-8浓度可降至31%。
金黄色葡萄球菌常见于AD患者的湿疹皮肤病变中,并且其经常导致病情加重和/或引起炎症。用植物乳杆菌菌株在皮肤上进行治疗可减轻炎症,同时减少发红,使皮肤舒缓和镇定。
已知在AD患者的湿疹皮肤病变中经常发现金黄色葡萄球菌,并且金黄色葡萄球菌似乎是导致病情加重的重要且主要原因。可以通过在皮肤上施用植物乳杆菌菌株来抑制病原体(如金黄色葡萄球菌)的生长来预防皮肤的潜在感染。
金黄色葡萄球菌的生长曲线是通过在温育16小时内测量光密度来创建的。图7示出了当用0.1%和/或0.05%植物乳杆菌HEAL 19处理时金黄色葡萄球菌的生长抑制作用。总之,使用所述发明的局部皮肤治疗可以通过抑制金黄色葡萄球菌的生长来减轻和/或预防炎症和感染。
内披蛋白是为皮肤细胞提供结构支持的蛋白质,从而使细胞抵抗微生物的入侵。细胞角蛋白14通常被发现是异质二聚体,并形成上皮细胞的细胞骨架。如图8和图9所示,通过使用各种浓度的植物乳杆菌HEAL 19在离体再生的人体皮肤模型中进行局部治疗,两种标记蛋白均增加。
由此证明,用所述发明对皮肤进行局部治疗直接导致皮肤屏障功能的增强。
本发明通过在用植物乳杆菌HEAL 19治疗和用柴油颗粒(1650b)刺激后在体外模型中减少若丹明B的渗透而显示出对皮肤屏障的保护活性。皮肤形态的评估允许确定化合物是否影响所处理的皮肤样本的结构。为了进行该评估,用若丹明B染色法对皮肤切片进行染色。在对每个皮肤样本染色之后,已经评估了表皮的完整性。图10示出了用植物乳杆菌HEAL 19进行的处理改善了皮肤完整性,并且对皮肤屏障功能具有保护活性。
分析和定量评估角质层的细胞间空间中的细胞间脂质薄片,其被用作表皮屏障的质量度量。在皮肤护理配方中用0.5%的植物乳杆菌HEAL19进行局部治疗可提高3D表皮模型系统对干性皮肤的修复性能(图11)。包含本发明的皮肤护理配方的局部施用增强了表皮屏障功能并支持皮肤的修复性能。
玻尿酸(HYA)在皮肤中起着一系列重要作用。在皮肤中需要维持表皮屏障功能和角质层的结构。此外,玻尿酸在将水固定在组织中、组织修复或影响细胞分化和增殖中起着重要作用(Weindl等人,2004)。所有这些都可以通过处理所述植物乳杆菌菌株来实现。
图12示出了在细胞培养基中用0.005%植物乳杆菌HEAL 19或HEAL 99处理8天后HEPKp三维皮肤模型中的玻尿酸的释放增加。与培养基对照相比,玻尿酸释放增至145%和115%。
在3至9天温育后,可以检测到蛋白质丝聚蛋白向培养基中的释放增加。图13示出了8天后,在用乳杆菌处理的HEPKp三维皮肤模型的培养基中增加的丝聚蛋白(FLG)释放。使用浓度为0.05%的植物乳杆菌HEAL 19和HEAL 99,培养基中的FLG分别增至215%和150%。
所述发明的局部施用导致人体皮肤中的丝聚蛋白上调,并且随后导致皮肤屏障的增强和对皮肤保湿的积极作用。
在使用离体人体皮肤模型的研究中证实了由于用本发明的局部治疗引起的丝聚蛋白的诱导。图14示出了在用各种浓度的植物乳杆菌HEAL 19处理后丝聚蛋白释放的浓度依赖性诱导。所施用的浓度越高,离体人体皮肤模型的丝聚蛋白释放越高。
在研究HEPKp 3D人体皮肤模型的体外实验中观察到了类似的浓度依赖性效应(数据未示出)。
为了确认在模型系统中观察到的效果,对一组患有特干性皮肤的受试者进行了体内研究。将经过热处理的植物乳杆菌HEAL 19掺入美容乳霜中并施用于小组成员的内前臂。与未经过治疗和经过安慰剂治疗的区域相比,在0、7、14和21天后监测对皮肤水分保持能力(电容)和经表皮水分流失(TEWL)的影响。
体内研究证实了分子生物学研究所表明的效果:在所有时间点处,电容随着治疗时间的增加而稳定增加,并且效果明显强于安慰剂治疗的效果。TEWL在含乳杆菌的乳霜治疗中明显降低,而安慰剂不起作用。
这些结果证明本发明的经过热处理的乳杆菌菌株能够增加皮肤的保湿性和屏障强度,从而显著改善皮肤健康。
图15和图16示出了电容和TEWL随时间变化确定的水分含量和皮肤屏障强度。
用高压灭菌的MRS培养基(Oxoid CM0359)制备96孔MTP。使用保持在-20℃下的10%甘油中的母代培养物,将每个植物乳杆菌属菌株接种三个复制孔。每孔添加OD=0.1的接种物,并将96孔MTP在37℃下温育16个小时。使用Sunrise Photometer(Tecan,奥地利)和Magelan Software,经由在620nm处的吸收,来确定每个孔中的生长曲线。盐水(0.9%氯化钠溶液)被用作阴性生长对照。
为了进行计算,计算检测到的吸收的平均值,并将其绘制成时间函数,以便进行图形演示。
具有皮肤舒缓和屏障增强作用的根据本发明的包括乳杆菌的配方(组合物):
1:皮肤美白日霜o/w
2:舒缓乳液
3:晒后护肤膏,止痒
4:镇定身体喷雾
5:防晒乳液(o/w,宽频带保护)
6:w/o晚霜
7:头皮舒缓去屑洗发水
8:美黑霜
9:止痒屏障修复霜
10:走珠止汗剂/除臭剂
11:具有UV-A/B宽频带保护的乳剂
12:具有UV-A/B宽频带保护的低油量防晒喷雾
13:具有UV-A/UV-B保护的亮肤唇膏
14:具有UV-B/UV-A保护的头皮舒缓护发素,冲洗型
15:止痒护发素,免洗型
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