用于雄性不育的生物传感器

技术领域

本发明涉及用于定量精子功能和评估雄性育性(fertility)的生物传感器及其应用。

背景技术

全球约有15％的人口受到不育的影响，其中已知男性不育占所有病例的20-70％(Reprod Biol Endocrinol.2015,13:37)。还有估计认为，所有男性中有2.5-12％是不育的。随着出生率的下降以及欧洲的其他男性不育相关因素，这种情况令人担忧。由于治疗男性不育依赖于准确的诊断，对潜在原因的分析和检测至关重要。除了解剖学和内分泌分析外，男性不育实验室诊断的当前趋于涵盖精子和精液的特征(梅奥诊所)。30-40％的男性不育病例与未知的男性不育相关因素有关(欧洲泌尿外科协会，2015)。这称为特发性男性不育，其治疗需要探究详细的功能分析。

另外，辅助生殖技术(ART)作为一种标准的治疗选择，也遇到了这一障碍。在2015年，美国有1.6％的婴儿是通过ART出生的。尽管仅在2015年美国就进行了231,936轮ART，但它们导致了60,778例活产(疾病控制与预防中心，2016年)。在2017年，欧洲人类生殖与胚胎学会确定了常规体外受精(IVF)后卵母细胞的失败受精率(FFR)作为ART实验室的一项关键考核指标(key performance indicator)，胜任水平很低，仅为5％(Human ReprodOpen.2017,2)。值得注意的是，虽然不能将精子形态与IVF成功/失败关联，但受精失败是由于精子功能问题引起的(Human Reprod.2000,15(3):702；Fertil Steril.2003Jan；79(1):74)。因此，需要开发一种稳健的方法来诊断精细胞的受精能力，以预测IVF的可行性，并更好地选择合适的ART方法。

在ART之前，通常会检测男性不育相关因素，包括精子质量分析，精子数量、浓度、形态和运动性，对精液中非典型细胞类型的识别以及自身免疫抗体的存在。其他分析可包括研究精细胞与宫颈粘液的相互作用，顶体反应，对附属性器官功能的生化测定以及对活性氧和DNA损伤的估计(世界卫生组织，2010年)。在特发性男性不育和IVF受精失败的情况下，这些数值并不提供太多有关不育潜在原因的信息。在大多情况下，采用胞浆内精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)是优选方法，但不必要的IVF步骤会导致健康卵母细胞的浪费和经济负担。

虽然精细胞的形态和动力学性质对于体内受精或IVF受精至关重要，但受精的最终步骤是精细胞与卵细胞的融合。研究方法例如Hemizona分析，人精子-卵母细胞相互作用检测和人透明带结合检测，能够模拟这个步骤的某些部分。然而，由于这些方法依赖于不容易获得的人卵母细胞或其部分，而无法被商业化。为了使用仓鼠卵母细胞代替人卵母细胞，开发了无透明带仓鼠卵母细胞穿透检测。尽管这个检测消除了对人卵母细胞的需求，但其对IVF治疗中任何受精浓度下的受精成功性的预测价值很低，因此这个检测的使用受到了显著限制。

两个配子之间的主要结合是通过卵细胞周围的透明带(ZP)糖蛋白细胞外层介导的(Cell.2017,169(7):1315；Reprod Biomed Online.2003,7(6):641)。这种相互作用负责触发精细胞中的顶体反应。而且，在遇到ZP之前尚未开始顶体反应的精细胞不能使卵细胞受精。接下来，从顶体中释放的水解酶需要消化ZP，从而使精子进入卵细胞膜。

在2014年发现了这种结合中的关键步骤。精子表面抗原IZUMO1与雌性对应的JUNO蛋白结合，该蛋白以前被称为叶酸受体4(Nature.508:483–487；Nature.2016,534(7608):566)。已经发现这个生化事件对于两个配子的融合至关重要。任何生化错配都可能导致受精失败。

因此，能够定量精液样品中能够与JUNO蛋白结合的精细胞的数量对于评估育性是重要的。

生物传感器是一种利用生物材料例如微生物、酶、抗体、DNA和RNA的分子识别功能，并将这些生物材料用作分子识别元件的传感器。换句话说，生物传感器利用了在固定的生物材料识别靶标底物、微生物呼吸消耗的氧气、酶反应、发光等时发生的反应。在生物传感器中，酶传感器的实际应用正在发展。例如，针对葡萄糖、乳酸、尿酸和氨基酸的酶传感器可用于医疗器械和食品加工行业。

可以使用不同的技术来跟踪例如与电极结合的蛋白和靶标物质(例如精子)之间的相互作用。此类技术中有一种依赖于表面等离子体共振(SPR)。在SPR中，一个分子配偶体(例如蛋白)被固定在金属(芯片)上。光激发金属中的表面等离子体；当结合配偶体与固定的分子结合时，这会引起可检测到的表面等离子体信号变化。此类技术中还有一种依赖于电化学转导，其中通过将生物事件直接转换为电信号来分析生物样品的含量。电化学生物传感中最常见的技术包括基于循环伏安、计时电流、计时电位、阻抗谱和场效应晶体管的方法，以及基于纳米线或磁性纳米颗粒的生物传感技术。

发明内容

本发明人利用JUNO蛋白与精子表面抗原IZUMO1之间的生化反应来确定精细胞的受精潜力。除了揭示不育的潜在原因外，这尤其可用于选择合适的ART技术，即在常规IVF和ICSI之间进行选择，同时减少了卵细胞的浪费。本发明人还提出了一种检测精细胞受精潜力的电化学和/或光学感测平台的开发和临床验证，以诊断雄性不育。诊断雄性不育和检查精子质量的现有商业方法着眼于精细胞的物理方面，而忽略了受精事件所必需的生化相互作用。本发明人所提出的方法比现有诊断方法更具优势，因为它是第一个利用精细胞的生物受体分析雄性育性的仿生测定法，并且它模拟了精细胞受精的关键步骤，从而直接揭示它们的受精潜力。之前已经开发了精子-卵母细胞相互作用的检测方法，但是它们要么需要使用不容易获得的人卵母细胞和透明带，要么由于检测结果与各种精液参数之间的相关性低而不可靠。本发明通过创造模仿卵母细胞的条件，且特别是通过使用一个或多个参与精子-卵母细胞融合的关键蛋白受体，克服了卵母细胞利用率问题。

本公开的一方面提供了一种用于定量精子功能的生物传感器，所述生物传感器包含基底(substrate)和JUNO蛋白或其片段，其中所述JUNO蛋白或其片段被固定在所述基底上。

本公开的进一步方面提供了一种用于检测精子功能的生物传感器，所述生物传感器包含基底和JUNO蛋白或其片段，其中所述JUNO蛋白或其片段被固定在所述基底上。

本公开的另一方面提供了一种用于检测和/或定量精子功能的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a.提供来自受试者的精液样品，其中所述精液样品包含一个或多个精细胞，

b.使精液样品与前述权利要求中任一项所述的生物传感器接触，

c.测定精细胞与固定在传感器上的蛋白的结合，

从而检测和/或定量所述样品的精子功能。

本公开的另一方面提供了一种诊断雄性不育的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a.提供来自受试者的精液样品，

b.使精液样品与本公开的生物传感器接触，

c.根据本公开的方法定量所述样品的精子功能，

d.使用精子功能来诊断受试者是否不育。

本公开的另一方面提供了一种诊断雄性不育的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a.提供来自受试者的精子样品，

b.使精子样品与本公开的生物传感器接触，

c.根据本公开的方法定量所述样品的精子功能，

d.使用精子功能来诊断受试者是否不育。

本公开的另一方面提供了一种用于制造包含JUNO蛋白的生物传感器的方法，所述方法包括：

a.提供基底，

b.提供JUNO蛋白，

c.将JUNO蛋白固定在基底上，

从而制造包含JUNO蛋白的生物传感器。

本公开的进一步方面提供了一种选择精子的方法，所述方法包括：

a.提供来自受试者的精液样品，其中所述精液样品包含一个或多个精细胞，

b.使精液样品与本公开的生物传感器接触，

c.通过显微镜术显现与生物传感器结合的精子，

从而选择所述精子。

本公开的进一步方面提供了一种选择精子的方法，所述方法包括：

a.提供来自受试者的精子样品，

b.使精液样品与本公开的生物传感器接触，

c.通过显微镜术显现与生物传感器结合的精子，

从而选择所述精子。

本公开的另一方面提供了一种用于检测和/或定量精子功能的手持设备，所述设备包含：

a.样品进口；

b.包含JUNO蛋白或其片段的生物传感器，其中所述JUNO蛋白被固定在生物传感器上，并且其中所述进口经配置而使所述样品与传感器接触；

c.检测器，经配置而接收来自传感器的信号并将其转换为用户可读的格式；和

d.任选地，用于从样品中分离细胞组分的手段(means)。

附图说明

发明详述

本文公开了用于定量精子功能以评估雄性不育的生物传感器及其应用。此外，本公开还涉及用于诊断受试者不育的方法，包括测定获得自所述受试者的样品中的精细胞的精子功能。

精子的主要功能是到达卵细胞，通过与卵细胞融合来递送两个亚细胞结构：(i)含有遗传物质的雄性原核和(ii)作为帮助组织微管细胞骨架的结构的中心粒，以诱导受精。因此，精子的功能可以理解为精子到达卵细胞并诱导受精的能力。

两个配子之间的主要结合是通过卵细胞周围的透明带(ZP)糖蛋白细胞外层介导的(Cell.2017,169(7):1315；Reprod Biomed Online.2003,7(6):641)。这种相互作用负责触发精细胞的顶体反应。而且，在遇到ZP之前尚未开始顶体反应的精细胞不能使卵细胞受精。接下来，从顶体中释放的水解酶需要消化ZP，从而使精子进入卵细胞膜。

在2014年发现了这种结合中的关键步骤。精子表面抗原IZUMO1与雌性对应的JUNO蛋白结合，该蛋白以前被称为叶酸受体4(Nature.508:483–487；Nature.2016,534(7608):566)。已经发现这个生化事件对于两个配子的融合至关重要。

本公开涉及一种用于定量精子功能的生物传感器，所述生物传感器包含基底和JUNO蛋白或其片段，其中所述JUNO蛋白或其片段被固定在基底上。事实上，通过使精细胞与包含JUNO蛋白的生物传感器结合来检测精子功能可作为可行策略，并且可以最终实现对雄性不育的诊断，这样克服了对人或动物卵母细胞或其部分的需求。

在一些实施方案中，提供了本公开的生物传感器，其中所述精子功能由精子的至少一部分与已经固定在传感器上的蛋白或其片段的结合来测定，其中所述蛋白是JUNO蛋白、ZP1、ZP2、ZP3和/或抗IZUMO抗体，或其片段。在一些实施方案中，所述精子的至少一部分包含IZUMO1表面抗原。

本公开的一方面提供了一种用于检测和/或定量精子功能的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a.提供来自受试者的精液样品，其中所述精液样品包含一个或多个精细胞，

b.使精液样品与前述权利要求中任一项所述的生物传感器接触，

c.测定精细胞与固定在传感器上的蛋白的结合，

从而检测和/或定量所述样品的精子功能。

本公开的进一步方面提供了一种诊断雄性不育的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a.提供来自受试者的精液样品，

b.使精液样品与本公开的生物传感器接触，

c.根据本公开的方法定量所述样品的精子功能，

d.使用精子功能来诊断受试者是否不育。

本公开的另一方面提供了一种诊断雄性不育的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a.提供来自受试者的精子样品，

b.使精子样品与本公开的生物传感器接触，

c.根据本公开的方法定量所述样品的精子功能，

d.使用精子功能来诊断受试者是否不育。

如本文所用，术语“精子功能”是指精子的健康度，其是精子获能(capacitate)和使卵子受精的能力。精子功能检测是诊断或研究精细胞的生化或分子特征的方法。以下参考文献具有精子功能检测的一些示例：Talwar和Hayatnagarkar 2015.J Hum ReprodSci.8(2):61–69。本公开涉及精子功能检测，其也被称为精子-卵母细胞相互作用检测，其中所述检测不使用卵母细胞，而是通过使用一个或多个参与精子-卵母细胞融合的关键蛋白受体，来模拟精子-卵母细胞相互作用的条件。

在本公开的方法的一个实施方案中，所述精液样品包含或怀疑包含一个或多个精细胞。

在本公开的方法的一个实施方案中，通过测定精细胞与固定在传感器上的蛋白的结合来检测所述样品的精子功能，其中所述蛋白选自由以下组成的组：JUNO蛋白、ZP1、ZP2、ZP3和/或抗IZUMO抗体，或其片段，且其中通过显微镜分析、电化学检测和/或表面等离子体共振来检测所述结合。

在本公开的方法的一个实施方案中，通过测定精细胞与固定在传感器上的蛋白的结合来定量所述样品的精子功能，其中所述蛋白选自由以下组成的组：JUNO蛋白、ZP1、ZP2、ZP3和/或抗IZUMO抗体，或其片段，且其中通过显微镜分析、电化学检测和/或表面等离子体共振来检测所述结合。

在本公开的方法的一个实施方案中，在步骤c)中通过由显微镜分析测定结合的精细胞相对于未结合的精细胞的百分比，来定量精子功能。

在本公开的方法的一个实施方案中，在步骤c)中通过由电化学检测测定结合的精细胞相对于未结合的精细胞的百分比，来定量精子功能。

在本公开的方法的一个实施方案中，在步骤c)中通过由表面等离子体共振测定结合的精细胞相对于未结合的精细胞的百分比来定量精子功能。

在本公开的方法的一个实施方案中，在步骤c)中通过由显微镜分析测定精液样品和/或精子样品中精细胞的顶体状态来定量精子功能。

在本公开的方法的一个实施方案中，在步骤c)中通过由电化学检测测定精液样品和/或精子样品中精细胞的顶体状态来定量精子功能。

在本公开的方法的一个实施方案中，在步骤c)中通过由表面等离子体共振测定精液样品和/或精子样品中精细胞的顶体状态来定量精子功能。

在本公开的方法的一个实施方案中，所述方法进一步包括将结合的精细胞相对于未结合的精细胞的百分比和/或精细胞的顶体状态与各自的参考值进行比较，其中所述参考值可以是阳性参考值(代表功能性精子)和/或阴性参考值(代表无功能性精子)。所述参考值可以通过检测对照精液样品和/或对照精子样品来获得。所述参考值也可以从科学文献中可得的数据中获得。

在本公开的方法的一个实施方案中，在步骤b前对样品进行处理。例如，精液样品处理可以包括精子的液化。精液样品处理可任选地包括获能。精子样品处理可以包括精子的液化。精子样品处理可任选地包括获能。

本文公开的生物传感器可以用于测定各种水平的精子功能。

例如，公开的生物传感器可用于测定精液样品和/或精子样品中的精细胞与透明带蛋白ZP1、ZP2和/或ZP3结合的能力。

公开的生物传感器可用于测定精液样品和/或精子样品中的精细胞进行顶体反应的能力。

与透明带蛋白ZP1、ZP2和/或ZP3结合是精细胞进行顶体反应的必要步骤。因此，不能与透明带蛋白ZP1、ZP2和/或ZP3结合的精细胞不会发生顶体反应。

测定精细胞是否能够与透明带蛋白ZP1、ZP2和/或ZP3结合并进行顶体反应对于确定可以使用哪些辅助生殖技术是重要的。具体地，不能与透明带蛋白ZP1、ZP2和/或ZP3结合和/或不发生顶体反应的精细胞可以适用于IVF，前提是已经从卵子去除了透明带外被。

公开的生物传感器可以用于测定精液样品和/或精子样品中的精细胞与JUNO蛋白结合的能力。

即使精细胞不能与透明带蛋白ZP1、ZP2和/或ZP3结合和/或不进行顶体反应，该精细胞也能够与JUNO蛋白结合。这是因为精细胞可能被诱导而获能并暴露出与卵母细胞细胞膜结合所必需的表面抗原。

在一些实施方案中，精子功能通过精子与固定的JUNO蛋白或其片段结合的能力而测定。所述结合可以通过例如位于精子上的IZUMO1蛋白或其片段而发生。所述结合可以通过例如精子表达的IZUMO1蛋白或其片段而发生。

事实上，已经经过获能的精子可以在其表面上呈现IZUMO1蛋白或其片段，并且所述IZUMO1蛋白或其片段能够结合其卵受体对应物，例如JUNO蛋白或其片段或抗IZUMO抗体或其片段。

在一些实施方案中，通过IZUMO1蛋白或其片段与固定的JUNO蛋白或其片段的结合，来测定精子功能。

在一个具体实施方案中，本公开的方法进一步包括治疗所述雄性不育的步骤。

在本公开的方法的一个具体实施方案中，所述治疗包括以施用治疗有效量的药物和/或通过人工生殖技术(ART)。例如，被诊断为精子功能降低的受试者可以借助ART进行生殖，ART例如子宫内授精(IUI)、体外受精(IVF)或利用胞质内精子注射(ICSI)的IVF。

例如，被诊断为精子功能降低的受试者，尤其是其精细胞的特征在于：

-与透明带蛋白ZP1、ZP2和/或ZP3结合的能力降低，

-进行顶体反应的能力降低；

-与JUNO蛋白结合的能力正常，

则可借助IVF进行生殖。

例如，被诊断为精子功能降低的受试者，尤其是其精细胞的特征在于：

-与透明带蛋白ZP1、ZP2和/或ZP3结合的能力降低，

-进行顶体反应的能力降低；

-与JUNO蛋白结合的能力降低，

则可借助利用ICSI的IVF进行生殖。

如本文所用，术语“能力降低”和“能力正常”是相对于参考值的，参考值可以是阳性对照。参考值可以通过计算可育受试者的精液样品的平均值来获得。参考值可以通过计算可育受试者的精子样品的平均值来获得。参考值也可以从科学报告中获得。因此，为了诊断出具有精子功能降低和/或雄性不育的受试者，将取自所述受试者的精液样品和/或精子样品的精细胞与透明带蛋白ZP1、ZP2和ZP3结合和/或进行顶体反应的能力与至少一个参考值进行比较，参考值例如阳性对照和/或阴性对照。

可以使用本领域技术人员已知的针对雄性不育的任何治疗。

在一些实施方案中，本公开的生物传感器被配置为用于检测和/或定量精子功能。

在本公开的方法的一个实施方案中，在步骤c)中通过测定精液样品和/或精子样品中精细胞的顶体状态来定量精子功能，从而将顶体反应性程度转换为精子功能量度。在一个具体实施方案中，向样品中添加荧光团，然后通过SPR或显微镜术分析所述样品以确定精细胞的顶体状态(即，精细胞是否是“顶体反应的”)。在一些实施方案中，仅在使所述样品与基底接触之后，才将荧光团在生物传感器进口添加到样品中。在一些实施方案中，仅在顶体反应发生之后，才将荧光团在生物传感器进口添加到样品中。荧光团的存在可有助于测定精细胞的顶体状态的步骤。例如，荧光标记的凝集素，例如豌豆(Pisum sativum)(豌豆凝集素)或花生(Arachis hypogaea)(花生凝集素)，或抗顶体抗原CD46的单克隆抗体，可用于评估精细胞的顶体状态。检测顶体反应的方法可以在Examination and processing ofhuman semen,WHO,第5版,2010,ISBN 978 92 4 154778 9(尤其参见第4章)的WHO实验室手册中找到。

在本公开的方法的一些实施方案中，在步骤c)中通过测定精液样品和/或精子样品中精细胞的顶体状态来定量精子功能，从而将顶体反应性程度转换为精子功能量度，其中将精液样品和/或精子样品中的顶体反应性与收集自可育雄性个体的精子的平均顶体反应性进行比较，且其中功能性精子的顶体反应性可等于或高于收集自可育雄性个体的精子的平均顶体反应性。有关收集自可育雄性个体的精子的平均顶体反应性的数据可在科学文献和临床报告中找到。

在本公开的方法的一些实施方案中，在步骤c)中通过将顶体反应性程度转换为精子功能量度来定量精子功能，其中15％或更高的顶体反应性可以指示功能性精子。

在本公开的方法的一些实施方案中，在步骤c)中通过将顶体反应性程度转换为精子功能量度来定量精子功能，其中10％或更低的顶体反应性可以指示无功能性精子。

在本公开的方法的一些实施方案中，在步骤c)中通过将顶体反应性程度转换为精子功能量度来定量精子功能，其中10％至15％之间的顶体反应性可以指示异常的精子功能。

在受精过程中，精子必须先与质膜融合，然后穿透雌性卵子才能使其受精。在穿透卵子的硬壳或细胞外基质之前，精细胞会经历一个称为顶体反应的过程。顶体反应是在精子与透明带结合后发生的胞吐过程，且必须发生在精子能够穿透卵母细胞外衣(oocytevestment)并与卵母细胞融合之前。顶体是精子头部前半部的帽状结构。当精子接近卵子的透明带(这是引发顶体反应所必需的)时，顶体周围的膜与精子头部的质膜融合，露出顶体的内容物。内容物包括与卵子细胞膜结合所必需的表面抗原以及许多酶，这些酶负责穿透卵子的坚硬外被并允许受精的发生。例如，顶体的内容物可以包含IZUMO1蛋白或其片段。

本公开的一方面提供了一种用于定量精子功能的生物传感器，所述生物传感器包含基底和JUNO蛋白或其片段，其中所述JUNO蛋白或其片段被固定在所述基底上。

本公开的另一方面提供了一种用于检测精子功能的生物传感器，所述生物传感器包括基底和JUNO蛋白或其片段，其中所述JUNO蛋白或其片段固定在所述基底上。

在一个实施方案中，本公开的生物传感器是传感器。本公开的传感器或生物传感器被配置为用于检测和/或定量精子功能。

如本文所用，“生物传感器”有时被称为“传感器”。已知有多种用于检测配体/受体相互作用的装置。这些中最基础的是纯化学/酶分析，其中通过测量或定量可检测的反应产物来检测分析物的存在或量。配体/受体相互作用也可以通过放射性标记测定来检测和定量。

这种类型的定量结合测定包含两个单独的组件：反应基底，例如固相测试条、皿(dish)、芯片或电极，以及单独的读取器或检测器设备，例如闪烁计数器、分光光度计、显微镜或本领域已知的任何其他检测器。基底通常不适用于多种测定(multiple assays)或小型化(miniaturization)对少量体液样品进行多种分析物测定。

相比之下，在生物传感器中，测定基底和检测器表面可以整合成单个设备。一通用类型的生物传感器采用了电极表面并组合有电流或阻抗测量元件，以检测响应于配体-受体结合事件的存在而产生的电流或阻抗的变化。另一类型的生物传感器可以采用芯片(例如玻璃芯片)并组合有光学检测器(例如组合有表面等离子体共振)。另一类型的生物传感器可以采用皿并组合有显微镜。另一类型的生物传感器可以采用微珠并组合有光学或电学检测器，例如适用于乳胶凝集检测的。另一类型的生物传感器可以采用聚合物基底(例如纤维素或硝酸纤维素纸)并组合有例如光学或电学检测器，例如适合于侧向流动检测的。

如本文所用，术语“皿”可以指由玻璃、陶瓷、塑料、纤维素、硝酸纤维素或任何其他材料制成的容器或载片，并且可以用作微观或宏观光学检测和选择的基底。示例包括载玻片、微量滴定板、多孔板、Petri皿、表面皿等。所述皿可以由可改性(例如涂覆有金层)的材料制成。

如本文所用，术语“微珠”是指直径为1mm或更小的颗粒。微珠可以由天然或合成的聚合物材料制成。微珠可以由以具有可改性的表面为特征的材料制成，例如它们可以具有可以与纳米颗粒(例如金纳米颗粒)和/或分子(例如肽)结合的表面。

生物传感器是指包含生物元件的传感器。生物传感器实际上是传统分析技术的替代品，这些传统技术可能冗长、昂贵、复杂以及不适用于原位监测。生物传感器可以是将生物元件与变换器(transducer)整合到一起的化学分析装置。它在变换器内或在与变换器紧密接触处固定有生物元件，从而产生与单个分析物成比例的信号，该信号被进一步传送到检测器。在一些实施方案中，可以通过显微镜术来显现来自分析物的结合的信号输出。在一些实施方案中，可以通过光学检测器来显现来自分析物的结合的信号输出。

生物传感器包含三个基本组件，分别是生物受体(生物元件)、变换器和电子电路。生物受体或生物元件是嵌有变换器的生物分子，例如酶、DNA、蛋白、全细胞、抗体等。在本申请中，生物受体可以是JUNO蛋白。在本公开的一些实施方案中，生物传感器包括超过一种类型的生物受体，例如一种类型的生物受体可以是JUNO蛋白或其片段，且另一种类型的生物受体可以选自由以下组成的组：ZP1、ZP2、ZP3和抗IZUMO抗体。

本公开的方法涵盖的检测器是光学检测器，例如表面等离子体共振检测器、电化学检测器和测量电路。电子电路包含将电信号转换为可处理信号的信号处理生物传感器。在一些实施方案中，检测器可以是显微镜。

基于表面等离振子共振(SPR)效应的生物传感器利用由于SPR界面处的扰动(例如结合事件)而发生的SPR表面反射角的变化。最后，生物传感器还可以利用生物传感器表面的光学性质变化。

电化学生物传感器通常基于产生或消耗电子(氧化还原酶)的反应的酶催化作用。传感器基底通常含有三个电极：参考电极、工作电极和反电极。目标分析物参与在活性电极表面上发生的反应，并且该反应可以导致电子转移跨过双层(产生电流)或能够有助于双层电势(产生电压)。可以测量电流，其中电子的流速与固定电势下的分析物浓度成正比，或者可以在零电流下测量电势，其具有对数响应。另外，使用生物功能化的离子敏感场效应晶体管，通过其固有电荷，可以对小肽和蛋白进行无标记的直接电检测。

在零电流下产生电势的电位式生物传感器(potentiometric biosensor)，产生具有高动态范围的对数响应。这样的生物传感器通常通过以下制成：将电极图案丝网印刷在涂覆有导电聚合物的塑料基底上，然后附着上一些蛋白(酶或抗体)。它们仅有两个电极，并且极其灵敏和稳健。它们能够以之前只能通过HPLC和LC/MS实现的水平来检测分析物，并且无需进行严格的样品制备。由于生物传感组件对于相关分析物具有高度选择性，因此所有生物传感器都通常只需要最少的样品制备。信号是由于传感器表面发生变化而在导电聚合物层中发生电化学和物理学变化而产生的。这些变化可归因于离子强度、pH、水合作用和氧化还原反应。其中的栅极区已用酶或抗体改性的场效应晶体管(FET)也可以检测极低浓度的各种分析物，这是由于分析物与FET栅极区的结合会导致漏源电流的变化。

与传统结合测定法相比，生物传感器具有许多潜在优势。其中一个重要的优势是能够使用微芯片制造方法制造小规模但高度可重复的生物传感器单元。

各种类型的生物传感器具有许多潜在的应用。生物传感器方法在研究和商业应用中变得有价值的主要条件是对靶标分子的识别，存在合适的生物识别元件，以及一次性便携式检测生物传感器在一些情况下为灵敏的基于实验室的技术所优选的潜力。

在一个实施方案中，本公开的生物传感器进一步包含透明带蛋白1(ZP1)、透明带蛋白2(ZP2)、透明带蛋白3(ZP3)和/或抗IZUMO抗体或其片段，其中所述ZP1、ZP2、ZP3和/或抗IZUMO抗体或其片段被固定在基底上。

在一个实施方案中，本公开的生物传感器包含蛋白JUNO和ZP3，其中所述蛋白被固定在基底上。

在一个实施方案中，本公开的生物传感器包含蛋白JUNO和ZP2，其中所述蛋白被固定在基底上。

在一个实施方案中，本公开的生物传感器包含蛋白JUNO和ZP1，其中所述蛋白被固定在基底上。

在一个实施方案中，本公开的生物传感器包含蛋白JUNO和抗IZUMO抗体，其中所述蛋白被固定在基底上。

在一个实施方案中，本公开的生物传感器包含蛋白JUNO、ZP2和ZP3，其中所述蛋白被固定在基底上。

JUNO与ZP1、ZP2、ZP3和抗IZUMO抗体中的一个或多个的组合的存在可以改善生物传感器的特异性，并且可以更精确地测定所分析精液样品和/或所分析精子样品的精子功能。例如，JUNO与ZP1、ZP2、ZP3和抗IZUMO抗体中的一个或多个的组合的存在可以更精确地测定精子与透明带蛋白结合、进行顶体反应以及与卵母细胞结合的能力。

在一个实施方案中，可被固定在基底上的蛋白JUNO、ZP1、ZP2和ZP3是哺乳动物蛋白。例如，蛋白JUNO、ZP1、ZP2和ZP3可以是人蛋白或其片段。例如，蛋白JUNO、ZP1、ZP2和ZP3可以是马蛋白或其片段。例如，蛋白JUNO、ZP1、ZP2和ZP3可以是犬蛋白或其片段。例如，蛋白JUNO、ZP1、ZP2和ZP3可以是牛科蛋白或其片段。

在进一步的实施方案中，本公开的生物传感器包含JUNO蛋白，所述JUNO蛋白包含多肽或由其组成，所述多肽与SEQ ID NO：1或其直系同源物或所述蛋白的片段具有至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，例如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如至少99％的序列同一性实体，例如约100％的序列同一性。

在一个实施方案中，提供了本公开的生物传感器，其中所述ZP1包含多肽或由其组成，所述多肽与SEQ ID NO：2或其直系同源物或所述蛋白的片段具有至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，例如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如至少99％的序列同一性实体，例如约100％的序列同一性。

在进一步的实施方案中，提供了本公开的生物传感器，其中所述ZP2包含多肽或由其组成，所述多肽与SEQ ID NO：3或其直系同源物或所述蛋白的片段具有至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，例如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如至少99％的序列同一性实体，例如约100％的序列同一性。

在进一步的实施方案中，提供了本公开的生物传感器，其中所述ZP3包含多肽或由其组成，所述多肽与SEQ ID NO：4或其直系同源物或所述蛋白的片段具有至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，例如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如至少99％的序列同一性实体，例如约100％的序列同一性。

在一些实施方案中，JUNO蛋白、ZP1、ZP2、ZP3和抗IZUMO抗体中的至少一个与其他部分结合。例如，所述其他部分可以是肽或标记。例如，JUNO蛋白、ZP1、ZP2、ZP3和抗IZUMO抗体中的至少一个与多组氨酸标签结合。

在一些实施方案中，提供了本公开的生物传感器，其中所述基底是微珠、皿、芯片或电极。

在一个实施方案中，基底是聚合物微珠。例如，基底可以是琼脂糖、纤维素、硝酸纤维素或乳胶微珠。在一些实施方案中，微珠经配置使得其可以偶联显微镜、光学变换器或测量电路。

在一个实施方案中，基底是皿，例如塑料皿、陶瓷皿或玻璃皿。在进一步的实施方案中，所述皿经配置使得其可以偶联显微镜或光学变换器。

在一些实施方案中，芯片是玻璃芯片。

如本文所用，术语“玻璃”等价于石英或二氧化硅，其在连续框架中包含硅和氧原子，整体化学式为SiO

在具体实施方案中，电极是碳、金或铂电极。在一个实施方案中，电极是丝网印刷电极(screen printed electrode)。

在一些实施方案中，基底具有改性的(modified)表面。在一个实施方案中，基底的至少一个表面涂覆有金层。在一些实施方案中，用纳米颗粒将基底的至少一个表面改性，所述纳米颗粒选自由以下组成的组：金、银、氧化铜、石墨烯、氧化铁及其组合。

在具体实施方案中，本公开的生物传感器经配置使得基底可以偶联显微镜、电化学工作站、表面等离子体共振检测器、测量电路或光学变换器。

在一个实施方案中，基底是电极，并且经配置使得其可以偶联电化学工作站或测量电路。

在一个实施方案中，基底是芯片，并且经配置使得其可以偶联表面等离子体共振检测器。

本公开涉及一种生物传感器。

为了检测和定量精子功能，所述生物传感器包含基底和固定在所述基底上的蛋白JUNO或其片段。

将生物元件例如目标蛋白固定在(金属、聚合物或玻璃)传感器表面是传感器的设计中必不可少且至关重要的步骤。根据所采用的基底而存在不同的固定技术，这些技术是本领域技术人员已知的。

在一些实施方案中，提供了本公开的生物传感器，其中JUNO蛋白、ZP1、ZP2、ZP3和抗IZUMO抗体中的至少一个与其他部分结合。在一些实施方案中，所述其他部分是肽。在一个实施方案中，所述其他部分是标记。

在一些实施方案中，其他部分是肽，例如聚组氨酸标签(His-tag)。

在一些实施方案中，其他部分是标记，也称为荧光标签或探针。

聚组氨酸标签可成功用于将蛋白固定在表面上，例如金属表面，例如金、镍或钴涂覆的微量滴定板或蛋白阵列。

在一些实施方案中，提供了本公开的生物传感器，其中所述JUNO蛋白、ZP1、ZP2、ZP3和/或抗IZUMO抗体被固定在基底上。

在一些实施方案中，提供了本公开的生物传感器，其中所述JUNO蛋白、ZP1、ZP2、ZP3和/或抗IZUMO抗体通过纳米颗粒(例如通过金纳米颗粒)被固定在基底上。基底和蛋白之间的纳米颗粒的存在的益处在于，它防止了蛋白的去折叠并帮助蛋白保持正确的构象。

本公开的一方面提供了一种用于制造包含JUNO蛋白的生物传感器，例如本文公开的生物传感器的方法，所述方法包括：

a.提供基底，

b.提供JUNO蛋白，

c.将JUNO蛋白固定在基底上，

从而制造包含JUNO蛋白的生物传感器。

在一些实施方案中，用于制造生物传感器的方法进一步包括将ZP1、ZP2、ZP3和抗IZUMO抗体中的一个或多个固定在基底上。

本公开的进一步方面提供了一种选择精子的方法，所述方法包括：

a.提供来自受试者的精液样品，

b.使精液样品与本公开的生物传感器接触，

c.通过显微镜术显现与生物传感器结合的精子，和

d.选择与生物传感器结合的精子。

本公开的进一步方面提供了一种选择精子的方法，所述方法包括：

a.提供来自受试者的精子样品，

b.使精子样品与本公开的生物传感器接触，

c.通过显微镜术显现与生物传感器结合的精子，和

d.选择与生物传感器结合的精子。

在本公开的方法的一个实施方案中，精液样品包含或怀疑包含一个或多个精细胞。

本公开的另一方面提供了一种用于检测和/或定量精子功能的手持设备，所述设备包含：

a.样品进口；

b.包含JUNO蛋白或其片段的生物传感器，其中所述JUNO蛋白被固定在生物传感器上，并且其中所述进口经配置而使所述样品与传感器接触；

c.检测器，经配置而接收来自传感器的信号并将其转换为用户可读的格式；

d.任选地，用于从样品中分离细胞组分的手段。

在具体实施方案中，本公开的手持设备包含如本公开的任何实施方案中所定义的生物传感器。

本公开的一方面提供了本公开的方法，其中所述受试者是人受试者。在具体实施方案中，人受试者是儿童或成人。

在本公开的方法的进一步实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在本公开的方法的进一步实施方案中，所述受试者是马、牛(cow)、水牛(buffalo)、绵羊、猪、山羊、猫或狗。

在本公开的一些实施方案中，所述受试者是马，并且所述生物传感器包含固定在基底上的JUNO蛋白或其片段，其中所述JUNO蛋白具有与SEQ ID NO：6的马JUNO蛋白具有至少95％序列同一性的序列，例如与SEQ ID NO：6的马JUNO蛋白具有例如至少96％的序列同一性，例如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如至少99％的序列同一性，例如约100％的序列同一性。

在本公开的一些实施方案中，所述受试者是狗，并且所述生物传感器包含固定在基底上的JUNO蛋白或其片段，其中所述JUNO蛋白是犬JUNO蛋白。

在本公开的一些实施方案中，所述受试者是牛，并且所述生物传感器包含固定在基底上的JUNO蛋白或其片段，其中所述JUNO蛋白是牛科JUNO蛋白。

在本公开的方法的具体实施方案中，样品是精液样品，任选地其中样品在分析之前已经经过处理。

在本公开的方法的具体实施方案中，样品是精子样品，任选地其中样品在分析之前已经经过处理。

在本公开的方法的一个实施方案中，精液样品和/或精子样品包含或怀疑包含一个或多个精细胞。

在一些实施方案中，在分析之前处理精液样品，且所述处理包括精子的液化。

精液样品在本文中可以与精子样品和精液互换使用。精液样品和/或精子样品在本文中定义为可含有精子的精液样品。在本公开的具体实施方案中，可以通过使用适合于处理(例如稀释)精液/精子样品的溶剂、介质、缓冲液和/或流体来进一步处理(例如稀释)精液样品。

精液由雄性或两性动物的性腺和其他性器官分泌，并能使雌性卵细胞受精。在人类中，精液除了精子外还含有其他几种组分：蛋白水解酶和其他酶以及果糖作为精液的成分，促进精子的存活，并为精子提供运动或“游动”的介质。精液产生自并源自位于骨盆中的精囊。

本文使用的术语“精子”是指雄性生殖细胞，并且是“精细胞”的同义词。能动的单鞭毛精细胞被称为精子，而不能动的精细胞被称为不动精子(spermatium)。在本公开中，术语“精子”，即sperm和spermatozoa两者可互换使用。

在本公开的方法的一些实施方案中，使用表面等离子体共振(SPR)来检测精子功能。在具体实施方案中，表面等离振子共振读数用于测定一种或多种甲状腺激素的浓度。

表面等离子体共振是位于负介电常数材料和正介电常数材料之间的界面处的传导电子在入射光激发下的共振振荡。SPR是测量材料在平面金属(例如金或银)表面或金属纳米颗粒表面上的吸附的许多标准工具的基础。这是许多基于颜色的生物传感器应用、不同传感器和硅藻光合作用背后的基本原理。SPR可用于检测生物分子结合相互作用。在SPR中，一个分子配偶体例如蛋白被固定在金属膜上。光激发金属中的表面等离子体；当结合配偶体与被固定的分子结合时，这会引起表面等离子体信号的可检测的变化。

在本公开的方法的一些实施方案中，通过电化学转导来检测或定量精子功能。

电化学生物传感器，也称为利用电化学转导的生物传感器，其由于生物事件到电子信号的直接转换而提供了一种分析生物样品含量的有吸引力的手段。电化学生物传感中最常见的技术包括基于循环伏安、计时电流、计时电位、阻抗谱和场效应晶体管的方法，以及基于纳米线或磁性纳米颗粒的生物传感技术。可与电化学检测组合使用的其他测量技术还可包括表面等离子体共振、光波导光模光谱、椭圆测量术、石英晶体微天平和扫描探针显微镜术的电化学形式。

雄性不育是指雄性没有能力使雌性怀孕。在人类中，它占不育的40％至50％。它影响了全部男性的约7％。雄性不育通常是由于精液缺陷造成的，且精液质量被用作雄性生育力(fecundity)的替代量度。

雄性不育定义为雄性个体没有能力使可育雌性个体怀孕。雄性不育的原因之一可以是无功能精子的产生。

雄性不育的诊断可以基于一系列功能检测，例如基于本文公开的任何一种精子功能检测。可以根据本领域技术人员已知的指南对所述检测进行评估，指南例如在针对Examination and processing of human semen,WHO,第5版,2010,ISBN 978 92 4 1547789(尤其参见第4章)的WHO实验室手册描述的。

序列

SEQ ID NO:1：JUNO_人精子-卵子融合蛋白Juno

MACWWPLLLELWTVMPTWAGDELLNICMNAKHHKRVPSPEDKLYEECIPWKDNACCTLTTSWEAHLDVSPLYNFSLFHCGLLMPGCRKHFIQAICFYECSPNLGPWIQPVGSLGWEVAPSGQGERVVNVPLCQEDCEEWWEDCRMSYTCKSNWRGGWDWSQGKNRCPKGAQCLPFSHYFPTPADLCEKTWSNSFKASPERRNSGRCLQKWFEPAQGNPNVAVARLFASSAPSWELSYTIMVCSLFLPFLS

SEQ ID NO:2：ZP1_人透明带精子结合蛋白1

MAGGSATTWGYPVALLLLVATLGLGRWLQPDPGLPGLRHSYDCGIKGMQLLVFPRPGQTLRFKVVDEFGNRFDVNNCSICYHWVTSRPQEPAVFSADYRGCHVLEKDGRFHLRVFMEAVLPNGRVDVAQDATLICPKPDPSRTLDSQLAPPAMFSVSTPQTLSFLPTSGHTSQGSGHAFPSPLDPGHSSVHPTPALPSPGPGPTLATLAQPHWGTLEHWDVNKRDYIGTHLSQEQCQVASGHLPCIVRRTSKEACQQAGCCYDNTREVPCYYGNTATVQCFRDGYFVLVVSQEMALTHRITLANIHLAYAPTSCSPTQHTEAFVVFYFPLTHCGTTMQVAGDQLIYENWLVSGIHIQKGPQGSITRDSTFQLHVRCVFNASDFLPIQASIFPPPSPAPMTQPGPLRLELRIAKDETFSSYYGEDDYPIVRLLREPVHVEVRLLQRTDPNLVLLLHQCWGAPSANPFQQPQWPILSDGCPFKGDSYRTQMVALDGATPFQSHYQRFTVATFALLDSGSQRALRGLVYLFCSTSACHTSGLETCSTACSTGTTRQRRSSGHRNDTARPQDIVSSPGPVGFEDSYGQEPTLGPTDSNGNSSLRPLLWAVLLLPAVALVLGFGVFVGLSQTWAQKLWESNRQ

SEQ ID NO:3：ZP2_人透明带精子结合蛋白2

MACRQRGGSWSPSGWFNAGWSTYRSISLFFALVTSGNSIDVSQLVNPAFPGTVTCDEREITVEFPSSPGTKKWHASVVDPLGLDMPNCTYILDPEKLTLRATYDNCTRRVHGGHQMTIRVMNNSAALRHGAVMYQFFCPAMQVEETQGLSASTICQKDFMSFSLPRVFSGLADDSKGTKVQMGWSIEVGDGARAKTLTLPEAMKEGFSLLIDNHRMTFHVPFNATGVTHYVQGNSHLYMVSLKLTFISPGQKVIFSSQAICAPDPVTCNATHMTLTIPEFPGKLKSVSFENQNIDVSQLHDNGIDLEATNGMKLHFSKTLLKTKLSEKCLLHQFYLASLKLTFLLRPETVSMVIYPECLCESPVSIVTGELCTQDGFMDVEVYSYQTQPALDLGTLRVGNSSCQPVFEAQSQGLVRFHIPLNGCGTRYKFEDDKVVYENEIHALWTDFPPSKISRDSEFRMTVKCSYSRNDMLLNINVESLTPPVASVKLGPFTLILQSYPDNSYQQPYGENEYPLVRFLRQPIYMEVRVLNRDDPNIKLVLDDCWATSTMDPDSFPQWNVVVDGCAYDLDNYQTTFHPVGSSVTHPDHYQRFDMKAFAFVSEAHVLSSLVYFHCSALICNRLSPDSPLCSVTCPVSSRHRRATGATEAEKMTVSLPGPILLLSDDSSFRGVGSSDLKASGSSGEKSRSETGEEVGSRGAMDTKGHKTAGDVGSKAVAAVAAFAGVVATLGFIYYLYEKRTVSNH

SEQ ID NO:4：ZP3_人透明带精子结合蛋白3

MELSYRLFICLLLWGSTELCYPQPLWLLQGGASHPETSVQPVLVECQEATLMVMVSKDLFGTGKLIRAADLTLGPEACEPLVSMDTEDVVRFEVGLHECGNSMQVTDDALVYSTFLLHDPRPVGNLSIVRTNRAEIPIECRYPRQGNVSSQAILPTWLPFRTTVFSEEKLTFSLRLMEENWNAEKRSPTFHLGDAAHLQAEIHTGSHVPLRLFVDHCVATPTPDQNASPYHTIVDFHGCLVDGLTDASSAFKVPRPGPDTLQFTVDVFHFANDSRNMIYITCHLKVTLAEQDPDELNKACSFSKPSNSWFPVEGSADICQCCNKGDCGTPSHSRRQPHVMSQWSRSASRNRRHVTEEADVTVGPLIFLDRRGDHEVEQWALPSDTSVVLLGVGLAVVVSLTLTAVILVLTRRCRTASHPVSASE

SEQ ID NO:5：IZUMO1_人Izumo精子-卵子融合蛋白1

MGPHFTLLCAALAGCLLPAEGCVICDPSVVLALKSLEKDYLPGHLDAKHHKAMMERVENAVKDFQELSLNEDAYMGVVDEATLQKGSWSLLKDLKRITDSDVKGDLFVKELFWMLHLQKETFATYVARFQKEAYCPNKCGVMLQTLIWCKNCKKEVHACRKSYDCGERNVEVPQMEDMILDCELNWHQASEGLTDYSFYRVWGNNTETLVSKGKEATLTKPMVGPEDAGSYRCELGSVNSSPATIINFHVTVLPKMIKEEKPSPNIVTPGEATTESSISLQPLQPEKMLASRLLGLLICGSLALITGLTFAIFRRRKVIDFIKSSLFGLGSGAAEQTQVPKEKATDSRQQ

实施例

在丝网印刷金电极上制造生物传感器。简而言之，将10μL的2mg/mL半胱胺盐酸盐添加到金电极上，并在室温下于黑暗中干燥。用去离子水洗涤电极，然后用10μL柠檬酸盐封端(citrate-capped)的金纳米颗粒对其进行改性。干燥并用去离子水洗涤后，添加10μL的50mM次氮基三乙酸，并在室温下孵育过夜。随后用含1％牛血清白蛋白的pH 7.4的0.01M磷酸盐缓冲液封闭。添加10μL的10mM硫酸镍，并在室温下孵育2小时。用pH 7.4的0.01M磷酸盐缓冲液洗涤电极后，将0.5μg含有多组氨酸标签的JUNO或ZP3固定在生物传感器上。

将精液样品按照标准程序液化并在精液制备介质(#1070/1069,OrigioA/SDenmark,https://origio.marketport.net/MarketingZone/MZDirect/Source/510e96f4-075b-4684-9a99-d472c1e3d31b)中稀释至不同稀释度。将生物传感器连接到电化学工作站，将稀释的精液样品添加到生物传感器上，并记录在被固定的蛋白和精液样品中存在的精子之间的相互作用的循环伏安响应。

结果如图1至图3所示，其中图1显示了a)仅添加缓冲液(实线)后和在添加以1.67x10

图2显示了添加3个不同稀释度(1.56x10

图3显示了添加三个不同稀释度(1.56x10

如图1所示，精子不与未固定有JUNO或ZP3的生物传感器结合。从循环伏安曲线中明显的还原和/或氧化峰可以看出，当存在JUNO或ZP3时，精子与生物传感器相互作用。另外，可以使用循环伏安法定量所述结合。分别如图2和图3所示，对于ZP3-精子和JUNO-精子相互作用，还原和氧化峰的移动趋势与可与ZP3和JUNO结合的精子数量相一致。此外，由于用于阴性对照(即不存在结合蛋白(图1))的信号在精子浓度为空和非零之间保持不变，故所检测的相互作用是蛋白特异的。

通过10μl的2mg/ml半胱胺盐酸盐(CyHCl)对丝网印刷金电极进行官能化，并在室温下于黑暗中孵育2-4h。用去离子水洗涤电极后，将5μl Asn-AuNP添加到官能化电极上。将电极在室温下孵育5h，然后用去离子水洗涤。进一步添加5μl含160μg/ml JUNO和160μg/mlZP3的5μl PB(10mM，pH 7.4)，并在4℃下孵育过夜。最后，在4℃下用含1％BSA的10μl PBS将电极封闭5h。

将改性的电极连接到电化学工作站。

将5-50μL预处理的精液样品添加到工作电极上，或将电极浸入样品瓶中。使精细胞与改性的电极结合1-10分钟，然后用去离子水洗涤。在合适浓度的氧化还原介体存在下，通过电阻抗光谱对所述结合进行分析。

使用仅JUNO，ZP2以及ZP2、ZP3、JUNO的组合进行了类似的实验。

对于这个实施例以及所有以下实施例，在分析之前，按照以下步骤对精液样品进行预处理(液化)：

-将在实验室或诊所收集的精液样品在室温下或在37℃的培养箱中液化15-60分钟。可以通过轻柔旋转或搅拌来防止精液样品异质液化。

-可以将这个液化的精液样品进行洗涤，重构(reconstitution)或用合适的精液制备介质稀释。

包含用JUNO或JUNO与ZP2和ZP3中任何一个的组合或其组合进行官能化和改性的丝网印刷金电极的传感器，可用于通过电化学工作站检测和定量精子功能。

通过10μl的2mg/ml半胱胺盐酸盐(CyHCl)将丝网印刷金电极官能化，并在室温下于黑暗中孵育2-4h。用去离子水洗涤电极后，将5μl Asn-AuNP添加到官能化电极上。然后将电极在室温下孵育5小时，然后用去离子水洗涤。进一步添加5μl含160μg/ml JUNO和160μg/ml ZP3的5μl PB(10mM，pH 7.4)，并在4℃下孵育过夜。最后，在4℃下用含1％BSA的10μlPBS将电极封闭5h。

将改性的电极连接到电化学工作站。

将5-50μL预处理的精液样品添加到工作电极上，或将电极浸入样品瓶中。使精细胞与改性的电极结合，同时通过电阻抗光谱或电流分析法对所述结合进行电化学分析。

使用ZP2以及JUNO、ZP3、ZP2的组合进行了类似的实验。

包含用JUNO或JUNO与ZP2和ZP3中任何一个的组合或其组合进行官能化和改性的丝网印刷金电极的传感器，可用于通过电化学工作站检测和定量精子功能。

用ZP2、ZP3和JUNO中的任何一个或其组合对SPR芯片进行化学官能化和改性。然后用去离子水洗涤芯片，并用牛血清白蛋白(BSA)封闭未涂覆的区域。这些芯片与SPR检测器结合使用。使预处理的精液样品流过芯片表面。从结合动力学和亲和力的质量变化来分析涂覆蛋白和精细胞之间的相互作用。由此检测并定量精子功能。

包含利用ZP2、ZP3和JUNO中的任何一个或其组合进行化学官能化和改性的SPR芯片的传感器，可用于通过SPR检测器来检测和定量精子功能。

首先用AuNP，然后再用ZP2、ZP3和JUNO中的任何一个或其组合，对整个或部分玻璃皿进行化学官能化和改性。用去离子水洗涤皿，并用BSA封闭未涂覆的区域。将预处理的精液样品滴添加到涂覆区域，并在光学传感器例如明视野或暗视野显微镜下观察结合。由此检测并定量精子功能。

包含结合至AuNP或AuNP改性的玻璃皿或塑料皿的ZP2和ZP3中的任何一个或其组合的传感器，可用于通过光学传感器检测和定量精子功能。

将预处理的精液样品与在之前已结合AuNP的ZP2和ZP3中的任何一个或其组合进行孵育。使精子与所述蛋白相互作用5-60分钟，然后通过离心洗涤。然后用标记有异硫氰酸荧光素(FITC)的豌豆(Pisum sativum)凝集素(PSA)(PSA–FITC)对精子进行顶体反应的染色，然后在光学变换器例如荧光显微镜或流式细胞仪下观察(参见http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/44261/9789241547789_eng.pdf；js essionid＝2EF9F9030760BB60B84C83708999AF64？sequence＝1中4.4.1节)。由此检测并定量精子功能。

或者，将预处理的精液样品与先前已结合AuNP改性的玻璃皿或塑料皿的ZP2和ZP3中的任何一个或其组合孵育5-60分钟。从表面去除精子，然后用PSA–FITC进行顶体反应的染色，然后在光学变换器例如荧光显微镜或流式细胞仪下观察。由此检测并定量精子功能。

或者，将预处理的精液样品与先前已结合AuNP改性的玻璃皿或塑料皿的ZP2和ZP3中的任何一个或其组合孵育5-60分钟。然后将精子用抗CD46抗体原位标记或从基底中去除后标记，以检测已发生顶体反应的精子。通过光学变换器例如荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。由此检测并定量精子功能。

包含结合AuNP或AuNP改性的玻璃皿或塑料皿的ZP2、ZP3和JUNO中的任何一个或其组合的传感器，可用于通过光学变换器来检测和定量精子功能。

序列表

<110> 斯珀莫塞斯公司（Spermosens AB）

<120> 用于雄性不育的生物传感器

<130> P4957PC00

<150> EP 18190720.5

<151> 2018-08-24

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 250

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Ala Cys Trp Trp Pro Leu Leu Leu Glu Leu Trp Thr Val Met Pro

1 5 10 15

Thr Trp Ala Gly Asp Glu Leu Leu Asn Ile Cys Met Asn Ala Lys His

20 25 30

His Lys Arg Val Pro Ser Pro Glu Asp Lys Leu Tyr Glu Glu Cys Ile

35 40 45

Pro Trp Lys Asp Asn Ala Cys Cys Thr Leu Thr Thr Ser Trp Glu Ala

50 55 60

His Leu Asp Val Ser Pro Leu Tyr Asn Phe Ser Leu Phe His Cys Gly

65 70 75 80

Leu Leu Met Pro Gly Cys Arg Lys His Phe Ile Gln Ala Ile Cys Phe

85 90 95

Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Pro Val Gly Ser

100 105 110

Leu Gly Trp Glu Val Ala Pro Ser Gly Gln Gly Glu Arg Val Val Asn

115 120 125

Val Pro Leu Cys Gln Glu Asp Cys Glu Glu Trp Trp Glu Asp Cys Arg

130 135 140

Met Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp Arg Gly Gly Trp Asp Trp Ser

145 150 155 160

Gln Gly Lys Asn Arg Cys Pro Lys Gly Ala Gln Cys Leu Pro Phe Ser

165 170 175

His Tyr Phe Pro Thr Pro Ala Asp Leu Cys Glu Lys Thr Trp Ser Asn

180 185 190

Ser Phe Lys Ala Ser Pro Glu Arg Arg Asn Ser Gly Arg Cys Leu Gln

195 200 205

Lys Trp Phe Glu Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Val Ala Val Ala Arg

210 215 220

Leu Phe Ala Ser Ser Ala Pro Ser Trp Glu Leu Ser Tyr Thr Ile Met

225 230 235 240

Val Cys Ser Leu Phe Leu Pro Phe Leu Ser

245 250

<210> 2

<211> 638

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Ala Gly Gly Ser Ala Thr Thr Trp Gly Tyr Pro Val Ala Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Val Ala Thr Leu Gly Leu Gly Arg Trp Leu Gln Pro Asp Pro

20 25 30

Gly Leu Pro Gly Leu Arg His Ser Tyr Asp Cys Gly Ile Lys Gly Met

35 40 45

Gln Leu Leu Val Phe Pro Arg Pro Gly Gln Thr Leu Arg Phe Lys Val

50 55 60

Val Asp Glu Phe Gly Asn Arg Phe Asp Val Asn Asn Cys Ser Ile Cys

65 70 75 80

Tyr His Trp Val Thr Ser Arg Pro Gln Glu Pro Ala Val Phe Ser Ala

85 90 95

Asp Tyr Arg Gly Cys His Val Leu Glu Lys Asp Gly Arg Phe His Leu

100 105 110

Arg Val Phe Met Glu Ala Val Leu Pro Asn Gly Arg Val Asp Val Ala

115 120 125

Gln Asp Ala Thr Leu Ile Cys Pro Lys Pro Asp Pro Ser Arg Thr Leu

130 135 140

Asp Ser Gln Leu Ala Pro Pro Ala Met Phe Ser Val Ser Thr Pro Gln

145 150 155 160

Thr Leu Ser Phe Leu Pro Thr Ser Gly His Thr Ser Gln Gly Ser Gly

165 170 175

His Ala Phe Pro Ser Pro Leu Asp Pro Gly His Ser Ser Val His Pro

180 185 190

Thr Pro Ala Leu Pro Ser Pro Gly Pro Gly Pro Thr Leu Ala Thr Leu

195 200 205

Ala Gln Pro His Trp Gly Thr Leu Glu His Trp Asp Val Asn Lys Arg

210 215 220

Asp Tyr Ile Gly Thr His Leu Ser Gln Glu Gln Cys Gln Val Ala Ser

225 230 235 240

Gly His Leu Pro Cys Ile Val Arg Arg Thr Ser Lys Glu Ala Cys Gln

245 250 255

Gln Ala Gly Cys Cys Tyr Asp Asn Thr Arg Glu Val Pro Cys Tyr Tyr

260 265 270

Gly Asn Thr Ala Thr Val Gln Cys Phe Arg Asp Gly Tyr Phe Val Leu

275 280 285

Val Val Ser Gln Glu Met Ala Leu Thr His Arg Ile Thr Leu Ala Asn

290 295 300

Ile His Leu Ala Tyr Ala Pro Thr Ser Cys Ser Pro Thr Gln His Thr

305 310 315 320

Glu Ala Phe Val Val Phe Tyr Phe Pro Leu Thr His Cys Gly Thr Thr

325 330 335

Met Gln Val Ala Gly Asp Gln Leu Ile Tyr Glu Asn Trp Leu Val Ser

340 345 350

Gly Ile His Ile Gln Lys Gly Pro Gln Gly Ser Ile Thr Arg Asp Ser

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