蛋白酪氨酸激酶6(PTK6)降解/破坏化合物和使用方法

对相关申请的交叉引用

本申请要求2018年7月5日提交的美国临时申请系列号62/694,118的权益。前述文献的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及降解和/或破坏蛋白酪氨酸激酶6(PTK6，也称为乳腺肿瘤激酶或Brk)的二价化合物(例如，双功能小分子化合物)、包含一种或多种所述二价化合物的组合物，并且涉及其用于在有需要的受试者中治疗PTK6介导的疾病的使用方法。本公开还涉及用于设计此类二价化合物的方法。

背景技术

PTK6，一种与Src激酶远源相关(distantly related)的非受体酪氨酸激酶的独特家族的成员，在乳腺癌和多种其它癌症类型中表达(Brauer和Tyner，2010；Derry等人，2003；Mitchell等人，1994；Ostrander等人，2010；Schmandt等人，2006)。PTK6经由激酶活性依赖性机理和/或非依赖性机理促进致癌表型，包括增强的增殖、增强的失巢凋亡抗性(anoikis resistance)、自噬的调节、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition)、和迁移/侵袭(Brauer和Tyner,2010；Castro和Lange,2010；Harvey和Crompton,2003；Harvey等人，2009；Ito等人，2016；Ostrander等人，2010；Park等人，2015；Zheng等人，2013)。与远源相关的src激酶不同，PTK6缺少十四烷基化序列(myristylationsequence)。因此，PTK6显示可以影响其活性的更广泛范围的细胞定位；已经在细胞的细胞核、细胞质和膜中检测到PTK6蛋白(Derry等人，2003)。

PTK6在包括前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌、肝癌和宫颈癌的多种癌症类型中起作用。具体地，据报道，胰腺癌细胞和肝癌细胞中PTK6表达的下调(经由siRNA/shRNA)削弱它们的活力(Chen等人，2016；Ono等人，2014)。除了在癌细胞存活调节中的作用以外，PTK6还促进上皮-间质转化(EMT)，其为通常被癌细胞利用以促进侵袭/迁移、化学疗法抗性和转移的发育过程。发明人证实了PTK6通过调节Snail(一种转录因子)的稳定性来促进三阴性乳腺癌细胞的EMT和增强它们侵袭和转移的能力(Ito等人，2016)。shRNA介导的PTK6表达的下调抑制三阴性乳腺癌细胞的3D生长、迁移和转移(Ito等人，2016)。

PTK6蛋白水平的降低不太可能对宿主/患者具有重大副作用。基因工程化PTK6基因敲除小鼠可存活、达到成熟并且正常繁殖。迄今为止观察到的唯一的表型是小肠中细胞的过度增殖，这与PTK6在肠上皮细胞分化中的作用一致(Haegebarth等人，2006)。这些PTK6-/-小鼠与发生乳腺肿瘤的ErbB2(Her2)转基因小鼠的杂交导致减少的肺转移，再次证实了PTK6蛋白在癌症转移中的关键作用(Peng等人，2015)。

已知有几种PTK6抑制剂，包括化合物21d(Zeng等人，2011)、化合物4f(Mahmoud等人，2014)、化合物1(Yamamoto、2016)、XMU-MP-2(Jiang等人，2017)、和化合物3s(Cardenas等人，2018)。最近化合物21d得以验证(Ito等人，2017；Ito等人，2016)。关于TNBC细胞的EMT调节，化合物21d处理表型模拟(phenocopied)PTK6 shRNA的作用。然而，关于3D生长，使用化合物21d的处理无法一致地表型模拟shRNA对所评价的所有细胞系的作用。实际上，已经报道了PTK6的非激酶依赖性致癌活性(Harvey和Crompton，2003)并且PTK6的非激酶依赖性致癌活性可以解释这些差异并且会限制激酶抑制作为治疗策略的普遍用途。因此，降低PTK6蛋白水平的PTK6降解剂将经由RNA干扰更一致地表型模拟PTK6敲低的作用并且克服PTK6的非激酶依赖性活性。

发明内容

与抑制PTK6的激酶活性的PTK6抑制剂不同，本文中公开的PTK6降解/破坏化合物(“PTK6降解剂”)结合并且诱导PTK6的降解，因此除了消除PTK6的激酶活性以外还消除PTK6的任何支架功能(scaffolding function)。本文中公开的PTK6降解剂为包含经由连接基团缀合至降解/破坏标签的PTK6配体的二价化合物。

本文中公开的PTK6降解剂提供用于治疗PTK6介导的疾病的新机理。特别地，与仅抑制PTK6的激酶活性相反，该PTK6降解剂具有靶向PTK6以降解的能力。

在一方面，本公开提供治疗PTK6介导的疾病的方法，该方法包括对患有PTK6介导的疾病的受试者给予一种或多种PTK6降解剂，PTK6降解剂为包含经由连接基团缀合至降解/破坏标签的PTK6配体的二价化合物。PTK6介导的疾病可以为由PTK6表达导致的疾病。PTK6介导的疾病相对于相同物种和组织类型的野生型组织可以具有提高的PTK6表达。PTK6介导的疾病的非限制性实例包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌、肝癌、和宫颈癌。

PTK6介导的癌症可以包括例如复发性癌症。PTK6介导的癌症可以例如对于一种或多种在先治疗是难治性的。

本公开总体上涉及降解和/或破坏PTK6的二价化合物(例如，双功能小分子化合物)，并且涉及用于治疗PTK6介导的癌症(即，依赖于PTK6蛋白的癌症；或者相对于相同物种和组织类型的野生型组织具有升高的PTK6水平、或PTK6活性的癌症)的方法。由于PTK6降解剂/破坏剂具有双重功能(激酶活性抑制加蛋白降解/破坏)，因此本公开的二价化合物会是比抑制PTK6的激酶活性但是不影响PTK6蛋白水平的现有的PTK6抑制剂显著更有效的治疗剂。本公开进一步提供用于鉴定如本文中所述的PTK6降解剂/破坏剂的方法。

更具体地，本公开提供包含经由连接基团缀合至降解/破坏标签的PTK6配体的二价化合物。

在一些方面，PTK6降解剂/破坏剂具有如下所示的形式“PI-连接基团-EL”：

其中PI(“目标蛋白”(即，要降解的蛋白)的配体)包含PTK6配体(例如，PTK6激酶抑制剂)，并且EL(例如，E3连接酶的配体)包含降解/破坏标签(例如，E3连接酶配体)。以下说明示例性PTK6配体(PI)、示例性降解/破坏标签(EL)和示例性连接基团(Linker)：

PTK6配体包括但不限于：

其中

R选自H、卤素、或者未取代的或任选取代的C

R

R

R

R

R

R

R

R

X选自CH或N。

在式1的一些方面，R选自H、卤素、任选取代的C

在式1的一些方面，R选自H、F、CH

在式1的一些方面，R选自CH

在式1的一些方面，R选自CH

在式1的一些方面，R为c-Pr。

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，X为N。

PTK6配体还包括但不限于：

其中

X、Y和Z独立地选自空、CR

R

A选自空或-R

R

R

R

B和D独立地选自CR

R

R

R

R

R

m和n独立地选自0、1、2、3和4。

Ar选自芳基和杂芳基，所述芳基和杂芳基任选被独立地选自以下取代基中的一个或多个取代基取代：氢、卤素、氧代基、CN、NO

R

R

在式2的一些方面，X、Y和Z独立地选自CH、CF和N。

在式2的一些方面，X为N；Y和Z独立地选自CH、CF和N。

在式2的一些方面，X为N；Y和Z为CH。

在式2的一些方面，A为空或者选自任选取代的3元至8元碳环基、任选取代的4元至8元杂环基、任选取代的6元芳基、任选取代的5元至6元杂芳基、稠环、桥环、和螺环。

在式2的一些方面，A为空、苯基、4元至8元杂环基、和5元至6元杂芳基，所述苯基、4元至8元杂环基、和5元至6元杂芳基任选被以下基团取代：F、OH、CN、NO

在式2的一些方面，A为空、苯基、4元至8元杂环基、和5元至6元杂芳基，所述苯基、4元至8元杂环基、和5元至6元杂芳基任选被以下基团取代：F、OH、CN、NO

在式2的一些方面，A为

在式2的一些方面，B和D独立地选自CH

在式2的一些方面，B为O。

在式2的一些方面，D为CH

在式2的一些方面，R

在式2的一些方面，R

在式2的一些方面，R

在式2的一些方面，R

在式2的一些方面，R

在式2的一些方面，m和n独立地选自0、1和2。

在式2的一些方面，m和n为1。

在式2的一些方面，Ar选自芳基和杂芳基，所述芳基和杂芳基任选被独立地选自以下取代基中的一个或多个取代基取代：H、F、＝O、CN、NO

在式2的一些方面，Ar为苯基，其任选被独立地选自以下取代基中的一个或多个取代基取代：H、F、＝O、CN、NO

在式2的一些方面，Ar为4-OCF

在一些方面，PTK6配体可以为以下化合物的衍生物：

在一些方面，PTK6配体可以为例如：

PTK6配体可以结合至PTK6和/或PTK6突变蛋白。

降解/破坏标签(EL)包括但不限于：

其中

V、W和X独立地选自CR

Y选自CO、CR

Z选自空、CO、CR

R

R

R

其中

V、W和X独立地为CR

Y为CO或CH

Z为CH

R

R

其中

U、V、W和X独立地选自CR

Y选自CR

Z选自空、CO、CR

R

R

R

其中

R

R

其中

R

R

R

R

R

Ar选自芳基和杂芳基，其各自任选被独立地选自以下取代基中的一个或多个取代基取代：F、Cl、CN、NO

R

R

其中

R

V、W、X和Z独立地为CR

和

其中

R

R

R

R

在一些方面，降解/破坏标签可以为例如泊马度胺(Fischer等人，2014)、沙利度胺(Fischer等人，2014)、来那度胺(Fischer等人，2014)、VH032(Galdeano等人，2014；Maniaci等人，2017)、金刚烷(Xie等人，2014)、1-((4,4,5,5,5-五氟戊基)亚磺酰基)壬烷(E.Wakeling、1995)、nutlin-3a(Vassilev等人，2004)、RG7112(Vu等人，2013)、RG7338、AMG232(Sun等人，2014)、AA-115(Aguilar等人，2017)、贝他定(Hiroyuki Suda等人，1976)、MV1(Varfolomeev等人，2007)、LCL161(Weisberg等人，2010)、FK506(Liu等人，1991)、雷帕霉素(Fan等人，2017；Rodrik-Outmezguine等人，2016)和/或其类似物。

在一些方面，降解/破坏标签可以为例如以下结构中的一者：

在一些方面，降解/破坏标签可以结合至泛素连接酶(例如，E3连接酶如cereblonE3连接酶、VHL E3连接酶、MDM2连接酶、TRIM21连接酶、TRIM24连接酶、KEAP1连接酶和/或IAP连接酶)和/或用作导致PTK6蛋白错误折叠的疏水性基团或标签基团。

在所有上述化合物中，PTK6配体通过连接基团缀合至降解/破坏标签。连接基团可以包括，例如，具有不同长度的、含有非环状或环状饱和或不饱和碳、乙二醇、酰胺、氨基、醚、脲、氨基甲酸酯、芳香族、杂芳族、杂环和/或羰基的基团。

在一些方面，连接基团可以为如下的部分：

其中

A、W和B在每次出现时独立地选自空、或者二价部分，所述二价部分选自：R’-R”、R’COR”、R’CO

R’和R”独立地选自空、任选取代的R

R

R

R’和R”、R

m为0至15。

其中

R

R

A、W和B在每次出现时独立地选自空、或者二价部分，所述二价部分选自：R’-R”、R’COR”、R’CO

R’和R”独立地选自空、任选取代的R

R

R

R’和R”、R

m为0至15；

n在每次出现时为0至15；和

o为0至15。

其中

R

R

A和B在每次出现时独立地选自空、或者二价部分，所述二价部分选自：R’-R”、R’COR”、R’CO

R’和R”独立地选自空、任选取代的R

R

R

R’和R”、R

m在每次出现时为0至15；和

n为0至15。

其中

X选自O、NH、和NR

R

A和B独立地选自空、或者二价部分，所述二价部分选自：R’-R”、R’COR”、R’CO

R’和R”独立地选自空、任选取代的R

R

R

R’和R”、R

m在每次出现时为0至15；

n在每次出现时为0至15；

o为0至15；和

p为0至15。

在式7、7A、7B和7C的一些方面，连接基团部分包括选自由3元至13元环、3元至13元稠环、3元至13元桥环和3元至13元螺环组成的组中的环。

在式7、7A、7B和7C的一些方面，连接基团部分包括选自由式C1、C2、C3、C4和C5组成的组中的环：

在一些方面，连接基团也可以为如下的部分：

其中X为C＝O或CH

Y为C＝O或CH

n为0-15；

其中X为C＝O或CH

Y为C＝O或CH

m为0-15，

n为0-6，和

o为0-15；或者

其中

X为C＝O或CH

Y为C＝O或CH

R为–CH

m为0-15，和

n为0-15。

在式C的一些方面，R为3元至13元环、3元至13元稠环、3元至13元桥环、和/或3元至13元螺环，其中的一个或多个可以包含一个或多个杂原子。

在式C的一些方面，R具有如下的结构：

在一些方面，如下表1中所鉴定的，二价化合物为选自以下化合物中的化合物：YX39-86、YX39-89、YX39-90、YX39-91、YX39-92、YX39-93、YX39-94、YX39-96、YX39-97、YX39-98、YX39-99、YX39-100、YX39-101、YX39-102、YX39-103、YX39-104、YX39-105、YX39-106、YX39-107、YX39-127、YX39-128、YX39-129、YX44-158、YX44-172、YX44-184、YX49-7-2、YX49-8、YX49-9、YX49-10、YX49-11、YX49-24、YX49-99、YX49-100、YX49-101、YX49-102、YX59-122、YX69-5、YX69-157、YX69-158、YX69-159、YX69-182、YX69-183、YX69-184、YX79-3、YX79-4、YX79-5、YX79-6、YX79-10、YX79-11、YX79-12、YX79-13、YX79-14、YX79-15、YX79-16、YX79-17、YX79-18、YX79-19、YX79-20、YX79-21、YX79-22、YX79-23、YX79-24、YX79-25、YX79-29、YX79-30、YX79-34、YX79-35、YX79-36、YX79-37、YX79-38、YX79-39、YX79-40、YX79-41、YX79-42、YX79-43、YX79-56、YX79-57、YX79-58、YX79-59、YX79-60、YX79-61、YX79-62、YX79-63、YX79-64、YX79-65、YX79-66、YX79-67、YX79-68、YX79-69、YX79-70、YX79-86、YX79-87、YX79-88、YX79-89、YX79-90、YX79-91、YX79-92、YX79-93、YX79-94、YX79-95、YX79-967、YX79-97、YX79-131、YX79-132、YX79-133、YX79-134、YX79-135、YX79-136、YX79-137、YX79-138、YX79-139、YX79-140、YX79-141、YX79-142、YX79-143、YX79-144、YX79-145、YX79-146、YX79-147、YX79-148、YX79-149、YX79-150、YX79-151、YX79-152、YX79-153、YX79-154、YX79-155、YX79-156、YX79-157、YX79-158、YX79-159、YX79-160、YX79-161、YX79-162、YX79-164、YX79-165、JH077-29、JH077-30、JH077-31、JH077-32、JH077-33、JH077-34、JH077-35、JH077-35、JH077-36、JH077-37、JH077-38、JH077-39、JH077-40、JH077-41、JH077-47、JH077-48、JH077-49、JH077-51、JH077-52、JH077-53、JH077-54、JH077-55、JH077-56、JH077-57、JH077-58、JH077-65、JH077-66、JH077-67、JH077-68、JH077-69、JH077-70、JH077-71、JH077-72、JH077-73、JH077-74、JH077-75、JH077-76、JH077-76、JH077-77、JH077-78、JH077-79、JH077-80、JH077-81、JH077-82、JH077-83、JH077-84、JH077-85、JH077-86、JH077-87、JH077-88、JH077-89、JH077-90、JH077-91、JH077-92、JH077-93、实施例190-280、或其类似物。

在一些方面，本公开提供治疗PTK6介导的癌症的方法，该方法包括对有需要的受试者给予一种或多种包含经由连接基团缀合至降解/破坏标签的PTK6配体的二价化合物。PTK6介导的癌症可以为由(异常)PTK6激活导致的癌症。PTK6介导的癌症相对于相同物种和组织类型的野生型组织可以具有提高的PTK6表达。PTK6介导的疾病的非限制性实例包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌、肝癌、和宫颈癌。

PTK6介导的癌症可以为复发性癌症。PTK6介导的癌症可以对于借助不同疗法进行的一种或多种在先治疗是难治性的。

在任意上述方法中，二价化合物可以为YX39-86、YX39-89、YX39-90、YX39-91、YX39-92、YX39-93、YX39-94、YX39-96、YX39-97、YX39-98、YX39-99、YX39-100、YX39-101、YX39-102、YX39-103、YX39-104、YX39-105、YX39-106、YX39-107、YX39-127、YX39-128、YX39-129、YX44-158、YX44-172、YX44-184、YX49-7-2、YX49-8、YX49-9、YX49-10、YX49-11、YX49-24、YX49-99、YX49-100、YX49-101、YX49-102、YX59-122、YX69-5、YX69-157、YX69-158、YX69-159、YX69-182、YX69-183、YX69-184、YX79-3、YX79-4、YX79-5、YX79-6、YX79-10、YX79-11、YX79-12、YX79-13、YX79-14、YX79-15、YX79-16、YX79-17、YX79-18、YX79-19、YX79-20、YX79-21、YX79-22、YX79-23、YX79-24、YX79-25、YX79-29、YX79-30、YX79-34、YX79-35、YX79-36、YX79-37、YX79-38、YX79-39、YX79-40、YX79-41、YX79-42、YX79-43、YX79-56、YX79-57、YX79-58、YX79-59、YX79-60、YX79-61、YX79-62、YX79-63、YX79-64、YX79-65、YX79-66、YX79-67、YX79-68、YX79-69、YX79-70、YX79-86、YX79-87、YX79-88、YX79-89、YX79-90、YX79-91、YX79-92、YX79-93、YX79-94、YX79-95、YX79-967、YX79-97、YX79-131、YX79-132、YX79-133、YX79-134、YX79-135、YX79-136、YX79-137、YX79-138、YX79-139、YX79-140、YX79-141、YX79-142、YX79-143、YX79-144、YX79-145、YX79-146、YX79-147、YX79-148、YX79-149、YX79-150、YX79-151、YX79-152、YX79-153、YX79-154、YX79-155、YX79-156、YX79-157、YX79-158、YX79-159、YX79-160、YX79-161、YX79-162、YX79-164、YX79-165、JH077-29、JH077-30、JH077-31、JH077-32、JH077-33、JH077-34、JH077-35、JH077-35、JH077-36、JH077-37、JH077-38、JH077-39、JH077-40、JH077-41、JH077-47、JH077-48、JH077-49、JH077-51、JH077-52、JH077-53、JH077-54、JH077-55、JH077-56、JH077-57、JH077-58、JH077-65、JH077-66、JH077-67、JH077-68、JH077-69、JH077-70、JH077-71、JH077-72、JH077-73、JH077-74、JH077-75、JH077-76、JH077-76、JH077-77、JH077-78、JH077-79、JH077-80、JH077-81、JH077-82、JH077-83、JH077-84、JH077-85、JH077-86、JH077-87、JH077-88、JH077-89、JH077-90、JH077-91、JH077-92、JH077-93、实施例190-280、或其类似物。

在本文中公开的方法的一些方面，可以将二价化合物例如经口服、肠胃外、皮内、皮下、局部和/或直肠来给药。

任意上述方法可以进一步包括使用一种或多种另外的用于治疗癌症的治疗方案来治疗受试者。所述一种或多种另外的用于治疗癌症的治疗方案可以为例如手术、化学疗法、放射疗法、激素疗法或免疫疗法中的一种或多种。

本公开另外提供用于鉴定介导PTK6的降解/破坏的二价化合物的方法，该方法包括提供包含经由连接基团缀合至降解/破坏标签的PTK6配体的异端双功能(heterobifunctional)试验化合物、使异端双功能试验化合物与含有泛素连接酶和PTK6的细胞(例如，癌细胞如PTK6介导的癌细胞)接触。

如本文中所使用的，将术语“约(about)”和“大约(approximately)”定义为在给定值或状态的正负10％以内，优选在所述值或状态的正负5％以内。术语“二价(bivalent)”和“双功能(bi-functional)”在本文中可互换使用。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在本文中描述了用于本发明的方法和材料；另外，也可以使用本领域已知的合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在进行限制。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目、和其它参考文献以其整体通过参考并入本文。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将控制。

本发明的其它特征和优点将从以下详细的说明书和附图以及从权利要求中显而易见。

附图说明

图1.基于使用KMPlot.com的分析的、显示高的PTK6转录表达的预后意义的Kaplan-Meier曲线。PTK6较高的表达与患有卵巢癌(2期/3期)的患者较差的生存期相关。

图2-5.示例性化合物对于降低乳腺癌细胞中的PTK6蛋白水平的作用。将三阴性MDA-MB231细胞用500nM、2μM或2.5μM的试验化合物处理24小时并且裂解。将蛋白通过SDS/PAGE来分离并且用针对PTK6的抗体(Santa Cruz，Cell Signaling)或GAPDH上样对照(loading control)(Cell Signaling)来进行免疫印迹。

图6a.PTK6降解剂而不是激酶活性抑制剂抑制在3D培养物中的活力。将MDA-MB231三阴性乳腺癌细胞接种至3D基质胶培养物中(4×10

图7a.PTK6降解剂处理抑制ER+乳腺癌细胞的生长。将ER+乳腺癌细胞(MCF-7)用指定浓度的首选候选降解剂(top candidate degraders)、阴性对照化合物或PTK6激酶活性抑制剂处理24小时、裂解并且将蛋白通过SDS-PAGE来分离。通过Western分析来考察PTK6表达。图7b.将MCF-7细胞接种至3D基质胶培养物中并且用指定的PTK6降解剂或PTK6激酶抑制剂处理4天。使用3-D Cell Titer glo(Promega)来对活力进行定量。

图8.使用PTK6降解剂而不是激酶活性抑制剂的处理抑制耐受化学疗法的卵巢癌细胞(CP70)的活力。将细胞接种至3D基质胶培养物中并且用化合物(2μM)处理6天。使用3DCell Titre glo检测(Promega)来评估活力。

图9.PTK6降解剂以蛋白酶体依赖性方式抑制PTK6表达。将MDA-MB231细胞(左)或OV2008细胞(右)用DMSO或MG-132(10μM)预处理两小时，然后用DMSO或指定浓度的PTK6降解剂再处理4小时。

图10.PTK6激酶活性抑制剂预处理防止PTK6降解剂依赖性的PTK6表达抑制。将单层培养物中的MDA-MB231细胞用DMSO或PTK6激酶活性抑制剂(5μM)预处理，然后用PTK6降解剂(YX39-105)再处理24小时。将细胞裂解并且通过Western分析来评估PTK6的表达。

图11.PTK6降解剂抑制耐受内分泌疗法的ER+乳腺癌细胞(MCF/EDR)中的PTK6表达。将单层培养物中的MCF7EDR细胞用指定浓度的PTK6降解剂处理24小时。将细胞裂解并且评估PTK6的表达。

图12a.PTK6降解剂而不是激酶活性抑制剂抑制在3D培养物中的活力。在单层培养物中用1μM化合物进行24小时处理之后，评估用PTK6降解剂、阴性对照化合物或PTK6激酶活性抑制剂处理的细胞中PTK6的表达。将细胞裂解并且将蛋白分离和用抗PTK6抗体(CellSignaling)探测。图12b.将MDA-MB231三阴性乳腺癌细胞接种至3D基质胶培养物中(4×10

图13.PTK6降解剂抑制PTK6表达。在单层培养物中，将MDA-MB231细胞用化合物(500nM或1μM)处理24小时。将细胞裂解并且用抗PTK6抗体来探测裂解物。

具体实施方式

本公开部分地基于以下发现：降解PTK6和/或PTK6突变体的新型异端双功能小分子在PTK6介导的疾病、特别是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌、肝癌和宫颈癌的治疗中是有用的。

用于由双功能小分子诱导的靶蛋白的选择性降解/破坏的成功策略包括募集E3泛素连接酶和用疏水性标签模拟蛋白错误折叠(Buckley和Crews，2014)。双功能分子具有三个部分：一个与E3泛素连接酶结合的E3-结合物(binder)部分；一个与目标蛋白靶标结合的靶蛋白-结合物部分；和连接E3-结合物和靶蛋白-结合物部分的连接基团部分(Buckley和Crews，2014)。诱导的接近导致靶标的选择性泛素化，然后其在蛋白酶体处降解。已经鉴定/开发了数种类型的高亲和性小分子E3连接酶配体。它们包括(1)与cullin-RING泛素连接酶(CRL)复合物的组分cereblon(CRBN或CRL4CRBN)结合的例如沙利度胺和泊马度胺等免疫调节药物(IMiD)(Bondeson等人，2015；Chamberlain等人，2014；Fischer等人，2014；Ito等人，2010；Winter等人，2015)；(2)与另一CRL复合物的组分冯希佩尔-林道蛋白(van Hippel-Lindau protein)(VHL或CRL2VHL)结合的含有羟基脯氨酸的配体VHL-1(Bondeson等人，2015；Buckley等人，2012a；Buckley等人，2012b；Galdeano等人，2014；Zengerle等人，2015)；(3)选择性地结合CRL3复合物的组分KEAP1的化合物7(Davies等人，2016)；(4)选择性地结合异二聚体RING E3连接酶MDM2的AMG232(Sun等人，2014)；和(5)选择性地结合同型二聚体RING E3连接酶IAP的LCL161(Ohoka等人，2017；Okuhira等人，2011；Shibata等人，2017)。该技术已应用于数种蛋白靶标的降解(Bondeson等人，2015；Buckley等人，2015；Lai等人，2016；Lu等人，2015；Winter等人，2015；Zengerle等人，2015)，但是尚未应用于PTK6或PTK6突变蛋白的降解。此外，已经开发出利用大体积且疏水性的金刚烷基的疏水标记方法(hydrophobic tagging approach)来模拟蛋白错误折叠，导致借助蛋白酶体的靶蛋白的降解(Buckley和Crews，2014)。该方法已应用于假激酶Her3的选择性降解(Xie等人，2014)，但是尚未应用于PTK6或PTK6突变蛋白的降解。

如以下实例中所讨论的，本公开提供新型PTK6降解剂/破坏剂的具体实例，并且考察示例性降解剂/破坏剂在抑制/破坏PTK6功能、降低PTK6蛋白水平和抑制癌细胞增殖方面的作用。结果表明这些新型小分子在治疗人类疾病、尤其是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌、肝癌和宫颈癌方面会是有益的。

已经报道了许多选择性小分子PTK6激酶抑制剂，例如化合物21d(Zeng等人，2011)、化合物4f(Mahmoud等人，2014)、化合物1(Yamamoto、2016)、XMU-MP-2(Jiang等人，2017)、和化合物3s(Cardenas等人，2018)。

目前可获得的靶向PTK6的小分子聚焦于抑制PTK6的激酶活性。在本公开中，采取了不同的方法：开发不仅直接地且选择性地靶向PTK6的激酶活性还靶向其蛋白水平的化合物。用于诱导蛋白降解的策略包括募集E3泛素连接酶、用疏水性标签来模拟蛋白错误折叠、和抑制分子伴侣(chaperone)。例如，沙利度胺-JQ1二价化合物已用于劫持cereblon E3连接酶、在体外和体内诱导高选择性BET蛋白降解并且导致经证实的小鼠中白血病进展的延迟(Winter等人，2015)。类似地，还经由另一E3连接酶VHL诱导了BET蛋白降解(Zengerle等人，2015)。使用金刚烷改性的化合物诱导了Her3的部分降解(Xie等人，2014)。此类基于二价小分子化合物的使用的方法与例如基因敲除或shRNA(短发夹RNA)敲低等技术相比允许体外和体内蛋白水平的更灵活的调节。与基因敲除或shRNA敲低不同，小分子方法进一步提供通过改变相关小分子的给药浓度和频率来在疾病模型中研究剂量和时间依赖性的机会。

本公开包括本文中描绘的结构和命名的化合物的所有立体异构体、几何异构体、互变异构体和同位素。本公开还包括本文中所述的化合物，无论它们是如何制备的，例如，合成地、通过生物学过程(例如，代谢或酶转化)、或其组合。

本公开包括本文中描绘的结构和命名的化合物的药学上可接受的盐。

本文中呈现的化合物的一个或多个组成原子可以由原子的同位素以天然或非天然丰度替换或取代。在一些实施方案中，该化合物包含至少一个氘原子。在一些实施方案中，该化合物包含两个以上的氘原子。在一些实施方案中，该化合物包含1至2个、1至3个、1至4个、1至5个、或1至6个氘原子。在一些实施方案中，化合物中的所有氢原子均可以由氘原子替换或取代。在一些实施方案中，该化合物包含至少一个氟原子。在一些实施方案中，该化合物包含两个以上的氟原子。在一些实施方案中，该化合物包含1至2个、1至3个、1至4个、1至5个、或1至6个氟原子。在一些实施方案中，化合物中的所有氢原子均可以由氟原子替换或取代。

降解剂

在一些方面，本公开提供包含缀合至降解标签的PTK6配体(或靶向部分)的二价化合物(在本文中也称为降解剂)。PTK6配体与降解标签的连接可以是直接连接、或者经由连接基团间接连接。

如本文中所使用的，术语“蛋白酪氨酸激酶6配体”、“乳腺肿瘤激酶配体”、“PTK6配体”、“Brk配体”、或“PTK6靶向部分”应当广义地解释，并且涵盖与PTK6相关或者与PTK6结合的从小分子至大蛋白的多种多样的分子。PTK6配体或靶向部分可以为例如小分子化合物(即，分子量小于约1.5千道尔顿(kDa)的分子)、肽或多肽、核酸或寡核苷酸、例如寡糖等碳水化合物、或者抗体或其片段。

PTK6配体或靶向部分可以为能够抑制PTK6的激酶活性的PTK6激酶抑制剂(例如，化合物21d(Zeng等人，2011)、化合物4f(Mahmoud等人，2014)、化合物1(Yamamoto、2016)、XMU-MP-2(Jiang等人，2017)、和化合物3s(Cardenas等人，2018)、及其类似物)。如本文中所使用的，“PTK6激酶抑制剂”是指限制、延迟或者以其它方式引起生理、化学或酶作用或功能的抑制并且引起结合减少至少5％的药剂。抑制剂还可以或者可选地指防止或减少基因或蛋白的表达、转录或翻译的药物、化合物或药剂。抑制剂可以例如通过与另一蛋白或受体结合或者活化/钝化另一蛋白或受体来降低或阻止蛋白的功能。

示例性PTK6配体包括但不限于以下列出的化合物：

如本文中所使用的，术语“降解/破坏标签”是指与泛素连接酶相关或与泛素连接酶结合以将相应的泛素化机构(ubiquitination machinery)募集至PTK6、或者诱导PTK6蛋白错误折叠和随后的在蛋白酶体处的降解或功能的丧失的化合物。

在一些方面，本公开的降解/破坏标签包括例如泊马度胺(Fischer等人，2014)、沙利度胺(Fischer等人，2014)、来那度胺(Fischer等人，2014)、VH032(Galdeano等人，2014；Maniaci等人，2017)、金刚烷(Xie等人，2014)、1-((4,4,5,5,5-五氟戊基)亚磺酰基)壬烷(E.Wakeling、1995)、nutlin-3a(Vassilev等人，2004)、RG7112(Vu等人，2013)、RG7338、AMG232(Sun等人，2014)、AA-115(Aguilar等人，2017)、贝他定(Hiroyuki Suda等人，1976)、MV1(Varfolomeev等人，2007)、LCL161(Weisberg等人，2010)、FK506(Liu等人，1991)、雷帕霉素(Fan等人，2017；Rodrik-Outmezguine等人，2016)、和/或其类似物。

如本文中所使用的，“连接基团”是使两个分开的实体(entities)彼此结合的键、分子、或分子的组。连接基团提供两个实体的最佳间距。术语“连接基团”在一些方面是指将PTK6配体桥连至降解/破坏标签的任意试剂或分子。本领域普通技术人员认识到PTK6配体或降解/破坏标签上对于本公开的降解剂的功能不是必需的位点是用于附接连接基团的理想位点，条件是连接基团一旦附接至本公开的缀合物也不干扰PTK6配体的功能(即，其结合PTK6的能力)、或降解/破坏标签的功能(即，其募集泛素连接酶的能力)。

可以调整二价化合物的连接基团的长度以使破坏剂/降解剂的分子量最小并且避免PTK6配体或靶向部分与泛素连接酶的冲突或者同时通过疏水性标签来诱导PTK6错误折叠。

在一些方面，本公开的降解/破坏标签包括例如泊马度胺(Fischer等人，2014)、沙利度胺(Fischer等人，2014)、来那度胺(Fischer等人，2014)、VH032(Galdeano等人，2014；Maniaci等人，2017)、金刚烷(Xie等人，2014)、1-((4,4,5,5,5-五氟戊基)亚磺酰基)壬烷(E.Wakeling、1995)、nutlin-3a(Vassilev等人，2004)、RG7112(Vu等人，2013)、RG7338、AMG232(Sun等人，2014)、AA-115(Aguilar等人，2017)、贝他定(Hiroyuki Suda等人，1976)、MV1(Varfolomeev等人，2007)、LCL161(Weisberg等人，2010)、FK506(Liu等人，1991)、雷帕霉素(Fan等人，2017；Rodrik-Outmezguine等人，2016)、及其类似物。可以将降解/破坏标签用不同类型和长度的连接基团附接至PTK6配体或靶向部分(例如，化合物21d(Zeng等人，2011)、化合物4f(Mahmoud等人，2014)、化合物1(Yamamoto、2016)、XMU-MP-2(Jiang等人，2017)、和化合物3s(Cardenas等人，2018)、及其类似物)的结构中的各目标部分，从而生成有效的二价化合物。特别地，将泊马度胺或VHL-1附接至分子的任一部分可以将cereblon E3连接酶或VHL E3连接酶募集至PTK6。

与WT(野生型)细胞相比，本文中公开的二价化合物可以选择性地影响PTK6介导的疾病细胞(即，PTK6降解剂/破坏剂能够杀死PTK6介导的疾病细胞或抑制PTK6介导的疾病细胞的生长同时还具有相对低的裂解WT细胞或抑制WT细胞的生长的能力)，例如，对于一种或多种PTK6介导的疾病细胞的GI

可以使用本文中公开的原理和方法来开发另外的二价化合物(即，PTK6降解剂/破坏剂)。例如，可以合成和测试其它连接基团、降解/破坏标签和PTK6结合/抑制部分(不限于化合物21d(Zeng等人，2011)、化合物4f(Mahmoud等人，2014)、化合物1(Yamamoto、2016)、XMU-MP-2(Jiang等人，2017)、和化合物3s(Cardenas等人，2018)、及其类似物)。

在一些方面，PTK6降解剂/破坏剂具有如下所示的形式“PI-连接基团-EL”：

其中PI(“目标蛋白”(即，要降解的蛋白)的配体)包含PTK6配体(例如，PTK6激酶抑制剂)，并且EL(例如，E3连接酶的配体)包含降解/破坏标签(例如，E3连接酶配体)。示例性PTK6配体(PI)、示例性降解/破坏标签(EL)和示例性连接基团(Linker)如下所示：

PTK6配体包括但不限于：

其中

R选自H、卤素、或者未取代的或任选取代的C

R

R

R

R

R

R

R

R

X选自CH或N。

在式1的一些方面，R选自H、卤素、任选取代的C

在式1的一些方面，R选自H、F、CH

在式1的一些方面，R选自CH

在式1的一些方面，R选自CH

在式1的一些方面，R为c-Pr。

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，R

在式1的一些方面，X为N。

PTK6配体还可以为：

其中

X、Y和Z独立地选自空、CR

R

A选自空或-R

R

R

R

B和D独立地选自CR

R

R

R

R

R

m和n独立地选自0、1、2、3和4。

Ar选自芳基和杂芳基，所述芳基和杂芳基任选被独立地选自以下取代基中的一个或多个取代基取代：氢、卤素、氧代基、CN、NO

R

R

在式2的一些方面，X、Y和Z独立地选自CH、CF和N。

在式2的一些方面，X为N；Y和Z独立地选自CH、CF和N。

在式2的一些方面，X为N；Y和Z为CH。

在式2的一些方面，A为空或选自任选取代的3元至8元碳环基、任选取代的4元至8元杂环基、任选取代的6元芳基、任选取代的5元至6元杂芳基、稠环、桥环、和螺环。

在式2的一些方面，A为空、苯基、4元至8元杂环基、和5元至6元杂芳基，所述苯基、4元至8元杂环基、和5元至6元杂芳基任选被以下基团取代：F、OH、CN、NO

在式2的一些方面，A为空、苯基、4元至8元杂环基、和5元至6元杂芳基，所述苯基、4元至8元杂环基、和5元至6元杂芳基任选被以下基团取代：F、OH、CN、NO

在式2的一些方面，A为

在式2的一些方面，B和D独立地选自CH

在式2的一些方面，B为O。

在式2的一些方面，D为CH

在式2的一些方面，R

在式2的一些方面，R

在式2的一些方面，R

在式2的一些方面，R

在式2的一些方面，R

在式2的一些方面，m和n独立地选自0、1和2。

在式2的一些方面，m和n为1。

在式2的一些方面，Ar选自芳基和杂芳基，所述芳基和杂芳基任选被独立地选自以下取代基中的一个或多个取代基取代：H、F、＝O、CN、NO

在式2的一些方面，Ar为苯基，其任选被独立地选自以下取代基中的一个或多个取代基取代：H、F、＝O、CN、NO

在式2的一些方面，Ar为4-OCF

在一些方面，PTK6配体可以为以下化合物的衍生物：

在一些方面，PTK6配体可以为例如：

PTK6配体可以结合至PTK6和/或PTK6突变蛋白。

降解/破坏标签(EL)包括但不限于：

其中

V、W和X独立地选自CR

Y选自CO、CR

Z选自空、CO、CR

R

R

R

其中

V、W和X独立地为CR

Y为CO或CH

Z为CH

R

R

其中

U、V、W和X独立地选自CR

Y选自CR

Z选自空、CO、CR

R

R

R

其中

R

R

其中

R

R

R

R

R

Ar选自芳基和杂芳基，其各自任选被独立地选自以下取代基中的一个或多个取代基取代：F、Cl、CN、NO

R

R

其中

R

V、W、X和Z独立地为CR

和

其中

R

R

R

R

在一些方面，降解/破坏标签可以为例如泊马度胺(Fischer等人，2014)、沙利度胺(Fischer等人，2014)、来那度胺(Fischer等人，2014)、VH032(Galdeano等人，2014；Maniaci等人，2017)、金刚烷(Xie等人，2014)、1-((4,4,5,5,5-五氟戊基)亚磺酰基)壬烷(E.Wakeling、1995)、nutlin-3a(Vassilev等人，2004)、RG7112(Vu等人，2013)、RG7338、AMG232(Sun等人，2014)、AA-115(Aguilar等人，2017)、贝他定(Hiroyuki Suda等人，1976)、MV1(Varfolomeev等人，2007)、LCL161(Weisberg等人，2010)、FK506(Liu等人，1991)、雷帕霉素(Fan等人，2017；Rodrik-Outmezguine等人，2016)、和/或其类似物。

在一些方面，降解/破坏标签可以为例如以下结构中的一种：

在一些方面，降解/破坏标签可以结合至泛素连接酶(例如，E3连接酶如cereblonE3连接酶、VHL E3连接酶、MDM2连接酶、TRIM21连接酶、TRIM24连接酶、KEAP1 E3连接酶和/或IAP连接酶)和/或用作导致PTK6蛋白错误折叠的疏水性基团或标签。

在所有上述化合物中，PTK6配体通过连接基团缀合至降解/破坏标签。连接基团可以包括，例如，具有不同长度的、含有非环状或环状饱和或不饱和碳、乙二醇、酰胺、氨基、醚、脲、氨基甲酸酯、芳香族、杂芳族、杂环和/或羰基的基团。

在一些方面，连接基团可以为如下的部分：

其中

A、W和B在每次出现时独立地选自空、或者二价部分，所述二价部分选自：R’-R”、R’COR”、R’CO

R’和R”独立地选自空、任选取代的R

R

R

R’和R”、R

m为0至15。

其中

R

R

A、W和B在每次出现时独立地选自空、或者二价部分，所述二价部分选自：R’-R”、R’COR”、R’CO

R’和R”独立地选自空、任选取代的R

R

R

R’和R”、R

m为0至15；

n在每次出现时为0至15；和

o为0至15。

其中

R

R

A和B在每次出现时独立地选自空、或者二价部分，所述二价部分选自：R’-R”、R’COR”、R’CO

R’和R”独立地选自空、任选取代的R

R

R

R’和R”、R

m在每次出现时为0至15；和

n为0至15。

其中

X选自O、NH、和NR

R

A和B独立地选自空、或者二价部分，所述二价部分选自：R’-R”、R’COR”、R’CO

R’和R”独立地选自空、任选取代的R

R

R

R’和R”、R

m在每次出现时为0至15；

n在每次出现时为0至15；

o为0至15；和

p为0至15。

在式7、7A、7B和7C的一些方面，连接基团部分包括选自由3元至13元环、3元至13元稠环、3元至13元桥环和3元至13元螺环组成的组中的环。

在式7、7A、7B和7C的一些方面，连接基团部分包括选自由式C1、C2、C3、C4和C5组成的组中的环：

在一些方面，连接基团还可以为如下的部分：

其中X为C＝O或CH

Y为C＝O或CH

n为0-15；

其中X为C＝O或CH

Y为C＝O或CH

m为0-15，

n为0-6，和

o为0-15；或者

其中

X为C＝O或CH

Y为C＝O或CH

R为–CH

m为0-15，和

n为0-15。

在式C的一些方面，R为3元至13元环、3元至13元稠环、3元至13元桥环、和/或3元至13元螺环，其中的一个或多个可以包含一个或多个杂原子。

在式C的一些方面，R具有如下的结构：

二价化合物的合成和测试

可以使用本领域已知的标准生物物理学检测(例如，等温滴定量热法(ITC)、表面等离子体共振(SPR))来评估新合成的二价化合物(即，PTK6降解剂/破坏剂)的结合亲和力。然后可以使用细胞检测来评估二价化合物诱导PTK6降解和抑制癌细胞增殖的能力。除了评价二价化合物诱导的PTK6或PTK6突变蛋白的蛋白表达的变化以外，还可以评估酶活性。适合用于任何或所有这些步骤的检测是本领域已知的，并且包括例如蛋白质印迹法、定量质谱(MS)分析、流式细胞术、酶抑制、ITC、SPR、细胞生长抑制以及异种移植模型和PDX模型。用于任何或所有这些步骤的合适的细胞系是本领域已知的并且包括如下癌细胞系：1)乳腺癌细胞系(MDA-MB231、MCF7、UACC893、HCC1954、T47D、BT474、ZR751)；2)卵巢癌细胞系(DOV-13、HeyC2、OV2008、OvCAR5)；3)胰腺癌细胞系(PANC-1、BxP3、Capan1、Hs766T、MIAPaCa2)；4)前列腺癌细胞系(PC-3、DU145)。用于任何或所有这些步骤的合适的小鼠模型是本领域已知的并且包括三阴性乳腺癌的源自患者的异种移植模型。

借助非限制性实例，在针对具体示例性PTK6降解剂/破坏剂的实施例中描述详细的合成方案。

预期本文中公开的化合物的药学上可接受的同位素变体，并且可以使用本领域已知的常规方法或者对应于实施例中描述的那些方法的方法(用合适的试剂的合适的同位素变体来代替这些试剂)来合成。具体地，同位素变体为其中至少一个原子被具有相同的原子序数、但是原子质量与通常在自然界中发现的原子质量不同的原子替代的化合物。有用的同位素是本领域已知的并且包括例如氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素。因此，示例性同位素包括例如

同位素变体(例如，含有

预期本文中公开的化合物的药学上可接受的溶剂化物。可以例如通过用同位素变体代替用于使本文中公开的化合物结晶的溶剂(例如，D

预期本文中公开的化合物的药学上可接受的氟化变体，并且可以使用本领域已知的常规方法或者对应于实施例中描述的那些方法的方法(用合适的试剂的合适的氟化变体来代替这些试剂)来合成。具体地，氟化变体为其中至少一个氢原子被氟原子替代的化合物。氟化变体可以提供由较大的代谢稳定性引起的治疗优势，例如，增加的体内半衰期或降低的剂量要求。

预期本文中公开的化合物的药学上可接受的前药，并且可以使用本领域已知的常规方法或者对应于实施例中描述的那些方法的方法(例如，将羟基或羧酸基团转化为酯基)来合成。如本文中所使用的，“前药”是指可以经由一些化学或生理学过程(例如，酶促过程和代谢水解)转化为治疗剂的化合物。因此，术语“前药”也指药学上可接受的生物活性化合物的前体。前药在给予至受试者时可以是无活性的(即，酯)，但是例如通过水解为游离羧酸或游离羟基而在体内转化为活性化合物。前药化合物通常在生物体中提供溶解性、组织相容性或延迟释放的优点。术语“前药”还意在包括任何共价键合的载体，在将此类前药给予至受试者时，所述载体在体内释放活性化合物。可以通过以使改性物在常规操作中或在体内裂解为母体活性化合物的方式对存在于活性化合物中的官能团进行改性来制备活性化合物的前药。前药包括其中羟基、氨基或巯基键合至在将活性化合物的前药给予至受试者时分别裂解以形成游离羟基、游离氨基或游离巯基的任意基团的化合物。前药的实例包括但不限于活性化合物中的醇的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物或者胺官能团的乙酰胺、甲酰胺和苯甲酰胺衍生物等。

示例性PTK6降解剂/破坏剂的表征

在三阴性MDA-231乳腺癌细胞中表征具体的示例性PTK6降解剂/破坏剂(实施例83-85，图2-5)。发现双功能化合物YX39-101、YX39-102、YX39-103、YX39-104、YX39-105、YX39-106、和YX39-107在500nM下降低MDA-231细胞中的PTK6蛋白水平特别有效(图3)。此外，还发现YX69-159、YX79-10、YX79-11、YX79-12、YX79-15、YX79-36、YX79-37、YX79-40、YX79-41、YX79-42、YX79-59、和YX79-65在500nM下强效抑制MDA-MB231细胞中的PTK6表达(图4、5)。

与标准(2D)单层培养系统相比，在3D基质胶培养检测法中处理细胞通常提供对化合物在体内(小鼠)生物学模型中的活性更好的了解。用降低PTK6蛋白水平的PTK6降解剂处理三阴性乳腺癌细胞或ER+乳腺癌细胞抑制3D培养物中三阴性MDA-MB231乳腺癌细胞的活力和侵袭性分支(invasive branching)(图6、7)。使用3D Cell Titer Glo(Promega)，对PTK6降解剂处理对细胞活力的影响进行定量；使用PTK6降解剂进行的处理以浓度依赖性方式显著地损害活力，这与使用PTK6 shRNA载体观察到的效果相当(图6、7)。在可比较的浓度下，PTK6激酶抑制剂(P21d)对3D细胞培养物中细胞的活力仅有中等程度的影响(图6、7)，由此证实PTK6调节一些将被PTK6降解剂更好地靶向的PTK6+肿瘤的生长的非激酶依赖性功能。类似地，使用首选的PTK6降解剂而不是PTK6激酶活性抑制剂进行的处理抑制CP70细胞(一种耐受铂类化学疗法的卵巢癌细胞系)的3D培养物的活力(图8)。

从机理上讲，使用降解剂处理观察到的PTK6表达的抑制取决于蛋白酶体活性。使用蛋白酶体抑制剂MG-132预处理细胞防止PTK6表达的下调(图9)。此外，使用结合至与PTK6降解剂相同的结合位点的PTK6激酶活性抑制剂的预处理可恢复(rescue)经降解剂处理的细胞中的PTK6蛋白水平(图10)。

PTK6降解剂抑制耐受目前标准的护理疗法(care therapies)的细胞系中的PTK6表达。降解剂使耐受雌激素剥夺(estrogen deprivation)的ER+乳腺癌细胞中的表达下调(图11)，突出了PTK6降解剂靶向耐受治疗的疾病的潜在功效。

术语的定义

“烷基”是指不含有不饱和性、仅由碳原子和氢原子构成的直链或支链烃链基团。烷基可以包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、或16个碳原子。在某些实施方案中，烷基包含1至15个碳原子(例如，C

“烯基”是指含有至少一个双键、仅由碳原子和氢原子构成的直链或支链烃链基团。烯基可以包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、或16个碳原子。在某些实施方案中，烯基包含2至12个碳原子(例如，C

如本文中所使用的，术语“烯丙基”意指–CH

如本文中所使用的，术语“炔基”是指含有至少一个三键、仅由碳原子和氢原子构成的直链或支链烃链基团。炔基可以包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、或16个碳原子。在某些实施方案中，炔基包含2至12个碳原子(例如，C

如本文中所使用的，术语“烷氧基”意指经由氧原子连接至分子的其余部分的如本文中所定义的烷基。此类基团的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、和己氧基等。

如本文中所使用的，术语“芳基”是指通过从环碳原子除去氢原子而衍生自芳香族单环或多环烃环系统的基团。芳香族单环或多环烃环系统仅含有氢原子和碳原子。芳基可以包含6至18个碳原子，其中环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，根据休克尔理论(Hückel theory)，其含有环状的离域(4n+2)π电子体系。在某些实施方案中，芳基包含6至14个碳原子(C

术语“杂芳基”是指源自包含2至17个碳原子和1至6个选自氮、氧和硫的杂原子的3元至18元芳香族环基团的基团。如本文中所使用的，杂芳基基团可以为单环、二环、三环或四环系统，其中环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，根据休克尔理论，其含有环状的离域(4n+2)π电子体系。杂芳基包括稠合或桥连的环系统。在某些实施方案中，杂芳基是指源自3元至10元芳香族环基团的基团(3元至10元杂芳基)。在某些实施方案中，杂芳基是指源自5元至7元芳香族环的基团(5元至7元杂芳基)。杂芳基包括稠合的或桥连的环系统。杂芳基基团中的杂原子任选被氧化。一个或多个氮原子(如果存在)任选被季铵化。杂芳基通过环的任意原子连接至分子的其余部分。此类基团的实例包括但不限于吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基(cinnolinyl)、吲唑基、吲哚啉嗪基(indolizinyl)、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、喋啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、呋吖基(furazanyl)、苯并呋吖基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基、和呋喃并吡啶基(furopyridinyl)等。在某些实施方案中，杂芳基经由环碳原子连接至分子的其余部分。在某些实施方案中，杂芳基经由氮原子(N-连接的)或碳原子(C-连接的)连接至分子的其余部分。例如，源自吡咯的基团可以为吡咯-1-基(N-连接的)或吡咯-3-基(C-连接的)。此外，源自咪唑的基团可以为咪唑-1-基(N-连接的)或咪唑-3-基(C-连接的)。

如本文中所使用的，术语“杂环基”意指非芳香族的单环、二环、三环或四环基团，所述基团在其环系统中具有总计4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个原子并且含有3至12个碳原子和1至4个各自独立地选自O、S和N的杂原子，并且条件是所述基团的环不含有两个相邻的O原子或两个相邻的S原子。杂环基可以包括稠合的、桥连的或螺环的环系统。在某些实施方案中，杂环基包含3至10个环原子(3元至10元杂环基)。在某些实施方案中，杂环基包含3至8个环原子(3元至8元杂环基)。在某些实施方案中，杂环基包含4至8个环原子(4元至8元杂环基)。在某些实施方案中，杂环基包含3至6个环原子(3元至6元杂环基)。杂环基可以在将产生稳定的化合物的任何可用的原子上含有氧代基取代基。例如，此类基团可以在可用的碳原子或氮原子上含有氧代基原子。如果在化学上可行，此类基团可以含有多于一个的氧代基取代基。此外，应当理解的是，当此类杂环基含有硫原子时，所述硫原子可以被一个或两个氧原子氧化以得到亚砜或砜。4元杂环基的实例为氮杂环丁烷基(源自氮杂环丁烷)。5元环杂烷基的实例为吡咯烷基。6元环杂烷基的实例为哌啶基。9元环杂烷基的实例为吲哚啉基。10元环杂烷基的实例为4H-喹嗪基(4H-quinolizinyl)。此类杂环基的其它实例包括但不限于四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、噻烷基(thioxanyl)、哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环庚烷基(oxepanyl)、硫杂环庚烷基(thiepanyl)、氧氮杂

术语“环烷基”意指在其环系统中具有总计4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、或13个碳原子的饱和的单环、二环、三环或四环基团。环烷基可以是稠合的、桥连的或螺环的。在某些实施方案中，环烷基包含3至8个碳环原子(C

术语“亚环烷基”为通过从如上所定义的环烷基环中除去氢原子而获得的双齿基团(bidentate radical)。此类基团的实例包括但不限于亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环戊烯基、亚环己基、和亚环庚基等。

如本文中所使用的术语“螺环”具有其常规含义，即，含有两个以上的环、其中所述环中的两个具有一个共有的环碳的任何环系统。如本文中所定义的，螺环系统中的各环独立地包含3至20个环原子。优选地，它们具有3至10个环原子。螺环系统的非限制性实例包括螺[3.3]庚烷、螺[3.4]辛烷和螺[4.5]癸烷。

术语“氰基”是指-C≡N基团。

“醛”基团是指-C(O)H基团。

如本文中所定义的，“烷氧基”基团均指-O-烷基。

如本文中所定义的，“烷氧基羰基”是指-C(O)-烷氧基。

如本文中所定义的，“烷基氨基烷基”基团是指-烷基-NR-烷基。

如本文中所定义的，“烷基磺酰基”基团是指-SO

“氨基”基团是指任选取代的-NH

如本文中所定义的，“氨基烷基”基团是指-烷基-氨基基团。

如本文中所定义的，“氨基羰基”是指-C(O)-氨基。

“芳基烷基”基团是指-烷基芳基，其中烷基和芳基如本文中所定义。

如本文中所定义的，“芳氧基”基团是指–O-芳基和–O-杂芳基二者。

如本文中所定义的，“芳氧基羰基”是指-C(O)-芳氧基。

如本文中所定义的，“芳基磺酰基”基团是指-SO

如本文中所定义的，“羰基”基团是指-C(O)-基团。

“羧酸”基团是指–C(O)OH基团。

如本文中所定义的，“环烷氧基”是指–O-环烷基基团。

“卤代”或“卤素”基团是指氟、氯、溴或碘。

“卤代烷基”基团是指被一个或多个卤素原子取代的烷基。

“羟基”基团是指-OH基团。

“硝基”基团是指-NO

“氧代基(oxo)”基团是指＝O取代基。

“三卤代甲基”基团是指被三个卤素原子取代的甲基。

术语“取代的”意味着指定的基团或部分带有一个或多个取代基，所述取代基独立地选自C

术语“空”意指不存在原子或部分，并且在结构中的相邻原子之间存在键。

术语“任选取代的”意味着指定的基团可以是未取代的或者被一个或多个如本文中所定义的取代基取代。应当理解的是，在本发明的化合物中，当基团被称为是“未取代的”或者被比将填满化合物中所有原子的化合价的基团少的基团“取代”时，此类基团上剩余的化合价由氢填满。例如，如果C

如本文中所使用的，不同式中的相同符号可以具有不同的定义，例如，式1中的R1的定义是针对式1来定义的并且式6中的R1的定义是针对式6来定义的。

如本文中所使用的，当m(或n或o或p)由范围来定义时，例如，“m为0至15”或“m＝0-3”意指m为0至15的整数(即m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15)或者m为0至3的整数(即m为0、1、2或3)或者为所定义的范围内的任何整数。

“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐二者。本文中所述的二价化合物中的任一者的药学上可接受的盐旨在涵盖任何和所有药学上合适的盐形式。本文中所述的化合物的优选的药学上可接受的盐为药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐。

“药学上可接受的酸加成盐”是指保留游离碱的生物有效性和性质的那些盐，所述盐不是在生物学上或其它方面不期望的，并且是与例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢碘酸、氢氟酸、和亚磷酸等无机酸形成的盐。还包括与以下有机酸形成的盐：例如，脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的烷酸、羟基烷酸、烷二酸(alkanedioic acid)、芳香族酸、脂肪族磺酸和芳香族磺酸等，并且包括例如乙酸、三氟乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、和水杨酸等。因此，示例性的盐包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、和甲磺酸盐等。还预期氨基酸的盐，例如精氨酸盐、葡萄糖酸盐和半乳糖醛酸盐(参见，例如，Berge S.M.等人，“Pharmaceutical Salts”，Journal of PharmaceuticalScience，66:1-19(1997)，其以其整体通过参考引入本文)。可以根据本领域技术人员熟悉的方法和技术通过使游离碱形式与足量的所需酸接触以产生盐来制备碱性化合物的酸加成盐。

“药学上可接受的碱加成盐”是指保留游离酸的生物有效性和性质的那些盐，所述盐不是在生物学上或其它方面不期望的。由向游离酸中添加无机碱或有机碱来制备这些盐。可以与例如碱金属和碱土金属或有机胺等金属或胺形成药学上可接受的碱加成盐。源自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、和铝盐等。源自有机碱的盐包括但不限于以下物质的盐：伯胺、仲胺和叔胺，取代的胺，包括天然存在的取代胺，环胺和碱性离子交换树脂，例如，异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、N,N-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、亚乙基二苯胺、N-葡甲胺、葡萄糖胺、葡甲胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、和聚胺树脂等。参见前文中Berge等人。

如本文中所使用的，不同式中的相同符号可以具有不同的定义，例如，式1中的R

如本文中所使用的，当将m(或n或o或p)限定为例如“m为0至15”或“m＝0-5”时意味着m为0至15(或0至5)的整数。

药物组合物

在一些方面，本文中所述的组合物和方法包括包含一种或多种如本文中公开的二价化合物的药物组合物和药物的制造和用途。还包括药物组合物本身。

在一些方面，本文中公开的组合物可以包括用于癌症的治疗的其它化合物、药物或药剂。例如，在一些情况下，可以将本文中公开的药物组合物与一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、或小于十种)化合物组合。此类另外的化合物可以包括例如本领域已知的常规化学治疗剂。当共同给药时，本文中公开的PTK6降解剂/破坏剂可以与常规化学治疗剂共同起作用以产生机理上的加和或协同治疗效果。

在一些方面，本文中公开的组合物的pH可以用药学上可接受的酸、碱或缓冲剂来调整以提高PTK6降解剂/破坏剂或其递送形式的稳定性。

药物组合物通常包括药学上可接受的载体、佐剂或溶媒(vehicle)。如本文中所使用的，短语“药学上可接受的”是指在对人进行给药时通常被认为是生理学上可耐受的并且通常不产生过敏或例如胃部不适和头晕等类似的不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体、佐剂或溶媒为可以与本发明的化合物一起给予至患者并且在以足以递送治疗量的化合物的剂量给药时不破坏其药理活性且无毒的组合物。示例性常规无毒的药学上可接受的载体、佐剂和溶媒包括与药物给药相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、以及等渗剂和吸收延迟剂等。

特别地，可以用于本发明的药物组合物的药学上可接受的载体、佐剂和溶媒包括但不限于离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，自乳化药物递送系统(SEDDS)例如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯，用于药物剂型的表面活性剂例如吐温或者其它类似的聚合物递送基质，血清蛋白例如人血清白蛋白，缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，盐或电解质，例如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶体二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素系物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂。还可以有利地使用例如α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精等环糊精来增强本文中所述的各式的化合物的递送。

如本文中所使用的，将本文中公开的PTK6降解剂/破坏剂定义为包括其药学上可接受的衍生物或前药。“药学上可接受的衍生物”意指任何药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，例如，本文中公开的化合物或药剂的氨基甲酸酯、酯、磷酸酯、酯的盐或者其它衍生物，其在给予至接受者时能够(直接地或间接地)提供本文中所述的化合物、或者其活性代谢产物或残余物。特别有利的衍生物和前药是相对于母体物质、当将此类化合物给予至哺乳动物时增加本文中公开的化合物的生物利用度(例如，通过使口服给药的化合物更容易地被吸收至血液中)或者增强母体化合物向生物隔室(例如，脑或淋巴系统)的递送的衍生物和前药。优选的前药包括其中增强水溶性或通过肠膜的主动转运的基团附加至本文中所述的各式的结构的衍生物。本领域技术人员可以认识到此类衍生物而无需过度实验。尽管如此，仍然引用了Burger的Medicinal Chemistry and Drug Discovery，第5版，第1卷：Principles and Practice的教导，其通过参考引入本文至教导此类衍生物的程度。

本文中公开的PTK6降解剂/破坏剂包括其纯的对映异构体、对映异构体的混合物、纯的非对映异构体、非对映异构体的混合物、非对映异构外消旋体、非对映异构外消旋体和内消旋形式的混合物以及药学上可接受的盐、溶剂复合物、形态学形式或氘代衍生物。

特别地，本文中公开的PTK6降解剂/破坏剂的药学上可接受的盐包括例如源自药学上可接受的无机和有机酸和碱的那些。合适的酸盐的实例包括乙酸盐、己二酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、甲酸盐、富马酸盐、乙醇酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、棕榈酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三氟甲基磺酸盐、和十一烷酸盐。源自合适的碱的盐包括例如碱金属(例如钠)盐、碱土金属(例如镁)盐、铵盐和N-(烷基)4+盐。本发明还设想本文中公开的PTK6降解剂/破坏剂的任意碱性含氮基团的季铵化。可以通过此类季铵化来获得水溶性或油溶性或者可分散的产物。

在一些方面，本文中公开的药物组合物可以包含有效量的一种或多种PTK6降解剂/破坏剂。如本文中所使用的，术语“有效量”和“对于治疗有效”是指在其给药的情况下对于引起预期效果或生理学结果(例如，治疗或预防细胞生长、细胞增殖或癌症)有效的、在一段时间内(包括急性给药或长期给药以及周期性给药或连续给药)所使用的一种或多种本文中所述的化合物或药物组合物的量或浓度。在一些方面，药物组合物可以以对于引起预期效果或生理学结果(例如，治疗或预防细胞生长、细胞增殖或癌症)有效的量进一步包含一种或多种用于治疗癌症的另外的化合物、药物或药剂(例如，常规化学治疗剂)。

在一些方面，可以配制本文中公开的药物组合物以用于在美国销售、进口至美国、或者从美国出口。

药物组合物的给药

可以将本文中公开的药物组合物配制和调整以用于经由任意途径，例如，由食品和药物管理局(FDA)批准的任意途径给予至受试者。示例性方法记载于FDA数据标准手册(DSM)(在http://www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/FormsSubmissionRequirements/ElectronicSubmissions/DataStandardsManualmonographs可获得)。特别地，药物组合物可以配制用于经由口服递送、肠胃外递送或经皮递送来给药。如本文中所使用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、腹膜内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内、和颅内注射或输注技术。

例如，可以将本文中公开的药物组合物例如局部地、经直肠、经鼻(例如，通过吸入喷雾或雾化器)、经口腔、经阴道、真皮下(subdermally)(例如，通过注射或经由植入式贮药器(implanted reservoir))、或者经眼部给药。

例如，可以将本发明的药物组合物以任何口服可接受的剂型来口服给药，所述口服可接受的剂型包括但不限于胶囊剂、片剂、乳剂和水性混悬剂、分散体和溶液。在口服使用的片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加例如硬脂酸镁等润滑剂。对于胶囊形式的口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当将水性混悬剂或乳剂口服给药时，可以使活性成分悬浮或溶解于油相中并且与乳化剂或助悬剂组合。如果期望，可以添加某些甜味剂、调味剂、或着色剂。

例如，可以将本发明的药物组合物以栓剂的形式给药以用于直肠给药。这些组合物可以通过将本发明的化合物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述非刺激性赋形剂在室温下为固体但是在直肠温度下为液体，因此将在直肠中融化以释放活性组分。此类材料包括但不限于可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。

例如，可以将本发明的药物组合物通过鼻气雾剂或吸入剂来给药。此类组合物根据药物制剂领域公知的技术来制备，并且可以使用苯甲醇或其它合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物、或者本领域已知的其它增溶剂或分散剂制备为在盐水中的溶液。

例如，可以将本发明的药物组合物通过注射剂(例如，作为溶液或粉末)来给药。可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂(如，例如，吐温80)和助悬剂来配制此类组合物。无菌可注射制剂也可以为在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液剂或混悬剂，例如，作为在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的溶媒和溶剂为甘露醇、水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为了该目的，可以采用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸例如油酸及其甘油酯衍生物在注射剂的制备中是有用的，例如橄榄油或蓖麻油、尤其是它们的聚氧乙基化形式是天然的药学上可接受的油。这些油溶液剂或混悬剂还可以包含长链醇稀释剂或分散剂、或者通常用于例如乳剂和/或混悬剂等药学上可接受的剂型的配制的羧甲基纤维素或类似的分散剂。例如吐温、Spans等其它通常使用的表面活性剂、或者通常用于药学上可接受的固体剂型、液体剂型或其它剂型的制造的其它类似的乳化剂或生物利用度增强剂也可以用于配制的目的。

在一些方面，本发明的药物组合物的有效剂量可以包括但不限于例如，约0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2500、5000、或10000mg/kg/天，或者根据特定的药物组合物的要求。

当本文中公开的药物组合物包括本文中所述的各式的化合物(例如，PTK6降解剂/破坏剂)与一种或多种另外的化合物(例如，用于治疗癌症或任何其它病况或疾病、包括已知与癌症相关或由癌症引起的病况或疾病的一种或多种另外的化合物、药物或药剂)的组合时，化合物和另外的化合物二者应当以单一疗法方案中通常给予的剂量的约1％至100％之间、并且更优选约5％至95％之间的剂量水平存在。作为多剂量方案的一部分，另外的药剂可以与本发明的化合物分开给药。可选地，这些药剂可以为单一剂型的一部分，在单一组合物中与本发明的化合物混合在一起。

在一些方面，本文中公开的药物组合物可以与给药说明一起包括在容器、包装、或分配器中。

治疗方法

本文中公开的方法考虑给予有效量的化合物或组合物以达到期望的或声称的效果。通常，本发明的化合物或组合物将每天给药约1次至约6次，或者可选地或此外，以连续输注来给药。可以使用此类给药作为长期疗法或急性疗法。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主和特定的给药模式而变化。典型的制剂将含有约5％至约95％的活性化合物(w/w)。可选地，此类制剂可以含有约20％至约80％的活性化合物。

在一些方面，本公开提供使用包含PTK6降解剂/破坏剂的组合物的方法，所述组合物包括以下方法中的本文中公开的药物组合物(以下表示为‘X’)：

在一种或多种本文中公开的疾病或病况(例如，癌症，在以下实例中称为‘Y’)的治疗中用作药物的物质X。物质X用于制造用于治疗Y的药物的用途；和用于治疗Y的物质X。

在一些方面，所公开的方法包括对需要或者已经确定为需要此类治疗的受试者(例如，哺乳动物受试者，例如，人类受试者)给予治疗有效量的一种或多种本文中所述的化合物或组合物。在一些方面，所公开的方法包括选择受试者并且对受试者给予有效量的一种或多种本文中所述的化合物或组合物，并且根据预防或治疗癌症的需要任选重复给药。

在一些方面，受试者选择可以包括从受试者(例如，候选受试者)获得样品并且测试样品以指示受试者适用于该选择。在一些方面，可以例如由医疗保健专业人员确认或鉴定受试者曾经患有或正在患有病况或疾病。在一些方面，合适的受试者包括例如如下的受试者，所述受试者患有或曾经患有病况或疾病但是已解决该疾病或其一方面、呈现减轻的疾病症状(例如，相对于患有相同的病况或疾病的其它受试者(例如，大多数受试者))、或者例如在无症状状态下(例如，相对于患有相同的病况或疾病的其它受试者(例如，大多数受试者))，在患有病况或疾病的情况下长时间存活(例如，相对于患有相同的病况或疾病的其它受试者(例如，大多数受试者))。在一些方面，可以从患者记录、家族史、或者检测正免疫应答的指征来显示对病况或疾病的正免疫应答。在一些方面，在受试者选择中可以包括多方。例如，第一方可以从候选受试者获得样品并且第二方可以测试样品。在一些方面，可以由执业医师(例如，全科医师)选择或提及受试者。在一些方面，受试者选择可以包括从所选择的受试者获得样品并且贮存样品或者将其用于本文中公开的方法。样品可以包括例如细胞或细胞群。

在一些方面，治疗方法可以包括根据预防或治疗受试者患有的疾病或病况(例如，PTK6介导的疾病)的需要单次给予、多次给予和重复给予一种或多种本文中公开的化合物。在一些方面，治疗方法可以包括在治疗前、治疗期间、或治疗后评估受试者的疾病水平。在一些方面，治疗可以持续至检测到受试者的疾病水平的降低。

如本文中所使用的，术语“受试者”是指任何动物。在一些情况下，受试者为哺乳动物。在一些情况下，如本文中所使用的，术语“受试者”是指人类(例如，男性、女性、或儿童)。

如本文中所使用的，术语“给予/给药(administer)”、“给予/给药(administering)”或“给予/给药(administration)”是指植入、摄取、注射、吸入、或以其它方式吸收化合物或组合物，而无论其形式如何。例如，本文中公开的方法包括给予有效量的化合物或组合物以达到期望的或声称的效果。

如本文中所使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、或“治疗(treatment)”是指部分地或完全地减轻、抑制、改善或缓解受试者患有的疾病或病况。这意指疾病或病症(例如，癌症)的一种或多种症状得以改善或以其它方式有益地改变的任何方式。如本文中所使用的，特定的病症(例如，癌症)的症状的改善是指可以归因于借助本发明的组合物和方法的治疗或者与借助本发明的组合物和方法的治疗相关的任何减轻，无论是永久的还是暂时的、持久的还是瞬时的。在一些实施方案中，治疗可以促进或导致例如肿瘤细胞(例如，在受试者中)的数量相对于治疗前肿瘤细胞的数量的减少、肿瘤细胞(例如，在受试者中)的活力(例如，平均(average/mean)活力)相对于治疗前肿瘤细胞的活力的降低、肿瘤细胞的生长速率的降低、局部或远端肿瘤转移的速率的降低、或者与受试者中的一种或多种肿瘤相关的一种或多种症状相对于治疗前受试者的症状的减轻。

如本文中所使用的，术语“治疗癌症”意指在本文中所述的降解剂/破坏剂(例如，PTK6降解剂/破坏剂)的存在下引起肿瘤的生长速率、和/或肿瘤的大小、和/或局部或远端肿瘤转移的速率、和/或受试者中的总体肿瘤负荷的部分或完全下降，和/或肿瘤存活率的任意降低。

如本文中所使用的，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、和“预防(prevention)”应当指受试者中疾病发生的减少或者获得疾病或其相关症状的风险的降低。预防可以是完全的，例如，受试者中完全不存在疾病或病变细胞。预防也可以是部分的，以使受试者中疾病或病变细胞的出现少于、出现晚于、或者发展更慢于在没有本发明的情况下会出现的疾病或病变细胞。可以用PTK6降解剂/破坏剂治疗的示例性PTK6介导的疾病包括例如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌、肝癌和宫颈癌。

如本文中所使用的，术语在受试者中“预防疾病”(例如，预防癌症)意指例如在疾病的一种或多种症状出现或者例如由患者或患者的医生觉察到之前阻止受试者中的疾病的一种或多种症状的发展。优选地，疾病(例如，癌症)完全不发展，即，不能觉察到疾病的症状。然而，其也可以导致疾病的一种或多种症状的发展的延迟或延缓。可选地或此外，其可以导致一种或多种随后发展的症状的严重程度的降低。

用于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所采用的具体化合物的活性，年龄，体重，总体健康状况，性别，饮食，给药时间，排泄率，合并用药，疾病、病况或症状的严重程度和病程，患者对疾病、病况或症状的处置，以及治疗医师的判断。

有效量可以以一次或多次给药、应用或剂量来给药。治疗化合物的治疗有效量(即，有效剂量)取决于所选择的治疗化合物。此外，使用治疗有效量的本文中所述的化合物或组合物治疗受试者可以包括单次治疗或一系列治疗。例如，有效量可以给予至少一次。可以从每天一次或多次至每周一次或多次(包括每隔一天一次)给予组合物。本领域技术人员将理解某些因素可以影响有效地治疗受试者所需的剂量和时机，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、受试者的总体健康状况或年龄、以及存在的其它疾病。

给药后，可以对受试者进行评价以检测、评估或确定他们的疾病水平。在一些情况下，治疗可以持续至检测到受试者的疾病水平的变化(例如，降低)。在改善患者的病况(例如，受试者的疾病水平的变化(例如，降低))时，如果需要，可以给予维持剂量的本文中公开的化合物或组合物。随后，给药的剂量或频率或二者可以例如作为症状的函数降低至保持改善的病况的水平。然而，患者可能在任意疾病症状复发时需要长期的间歇性治疗。

还通过以下实施例描述和说明本公开。然而，在说明书中任何地方的这些和其它实施例的用途仅是说明性的并且绝不限制本发明或任何示例的术语的范围和含义。同样地，本发明不限于本文中所述的任何特定优选的实施方案或方面。实际上，在阅读本说明书后，许多修改和变化对于本领域技术人员会是显而易见的，并且可以在不偏离本发明的精神或范围的情况下做出此类变化。因此，本发明仅受到所附权利要求的术语以及那些权利要求所赋予的等同物的全部范围限制。

实施例

PTK6 PROTAC的中间体的合成过程

方案1.中间体1的合成

中间体1：2-(4-(4-氨基-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酸叔丁酯。向4-氨基-3-氟苯甲酸(613mg，3.9mmol)和2-(哌嗪-1-基)乙酸叔丁酯盐酸盐(908mg，3.3mmol)在THF(20mL)中的混合物中添加DIEA(2.3mL，13.2mmol)和EDCI(762mg，4.0mmol)。将所得溶液在室温(“rt”)下搅拌。在搅拌12小时(“h”)之后，用水来淬灭反应。减压浓缩后，将所得残余物通过反相色谱来纯化以得到作为棕色油状物的标题化合物(740mg，产率56％)。

方案2.中间体4的合成

中间体4：2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酸。向中间体1(298mg，0.88mmol)和中间体2(Zeng等人，2011)(170mg，0.39mmol)在DMF(6mL)中的溶液中添加NaH(39mg，0.98mmol)。将反应溶液在室温下搅拌3h，然后用水淬灭。减压浓缩后，将所得残余物通过反相色谱来纯化以得到作为棕色油状物的中间体3(160mg，产率59％)。将中间体3(160mg，0.23mmol)溶解于DCM/TFA(2:1，3mL)中。将所得溶液在室温下搅拌1h，然后减压浓缩以得到作为棕色油状物的标题化合物(170mg，0.23mmol)。

方案3.中间体5的合成

中间体5：4-(4-氨基-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯。向4-氨基-3-氟苯甲酸(182mg，1.1mmol)和哌嗪-1-羧酸叔丁酯(228mg，1.2mmol)在DCM(5mL)中的混合物中添加DIEA(0.26mL，1.5mmol)和EDCI(236mg，1.2mmol)。将所得溶液在室温下搅拌12h，然后用水淬灭。减压浓缩后，将所得残余物通过反相色谱来纯化以得到作为白色固体的标题化合物(306mg，产率81％)。

方案4.中间体7的合成

中间体7：(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯基)(哌嗪-1-基)甲酮。根据用于制备中间体4的过程来合成作为棕色油状物的中间体7。

方案5.中间体8的合成

中间体8：(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。向中间体7(10mg，0.018mmol)和(2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯(4.3mg，0.027mmol)在DCM(1mL)中的溶液中添加氰基硼氢化钠(5.9mg，0.1mmol)。在室温下搅拌12h之后，将溶液减压浓缩。将所得残余物通过HPLC来纯化以得到作为棕色油状物的标题化合物(5.5mg，52％)。

方案6.中间体9的合成

中间体9：7-(4-氨基-3-氟苯甲酰基)-2,7-二氮杂螺[3.5]壬烷-2-羧酸叔丁酯。根据用于制备中间体5的过程来合成作为白色固体的中间体9。

方案7.中间体11的合成

中间体11：(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯基)(2,7-二氮杂螺[3.5]壬烷-7-基)甲酮。根据用于制备中间体4的过程来合成中间体11。

方案8.中间体14的合成

中间体14：(S)-3-氨基-3-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)丙酸苄酯。根据已知的过程(Han等人，2019)从商购可得的中间体12,分2步(产率82％)来合成中间体14。

方案9.中间体17的合成

中间体17：(S)-3-((2S,4R)-1-((S)-2-(1-氟环丙烷-1-甲酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰氨基)-3-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)丙酸。根据已知的过程(Han等人，2019)来合成中间体17。

中间体18:(S)-3-((2S,4R)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-甲基异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯烷-2-甲酰氨基)-3-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)丙酸。根据用于制备中间体17的过程来合成中间体18。δ9.22–9.08(m,1H),7.62–7.39(m,4H),6.29–6.13(m,1H),5.47–5.31(m,1H),4.63–4.34(m,2H),3.93–3.84(m,1H),3.76(dd,J＝29.5,10.4Hz,1H),3.69–3.57(m,1H),3.08–2.83(m,2H),2.53(s,3H),2.47–2.36(m,1H),2.30–2.23(m,3H),2.23–2.13(m,1H),2.03–1.94(m,1H),1.11–1.02(m,3H),0.93–0.86(m,3H)。

方案10.中间体19的合成

中间体19：4-(4-碘-1H-咪唑-1-基)丁酸叔丁酯。向在0℃下的4-碘-1H-咪唑(1.5g，7.73mmol)在DMF(10mL)中的溶液中添加NaH(0.93g，23.19mmol)。在0℃下搅拌0.5h之后，添加4-溴丁酸叔丁酯(3.45g，15.46mmol)。将混合物加温至室温并且搅拌16h，然后在0℃下将水(100mL)倒入反应混合物中，并且用EtOAc(3×100mL)萃取。将合并的有机层经Na

方案11.中间体22的合成

中间体22：4-(4-(5-氨基甲酰基-6-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)吡啶-3-基)-1H-咪唑-1-基)丁酸。向中间体20(1.0g，2.06mmol)在DMF(5mL)和H

中间体23：5-(1-(4-氨基丁基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。根据用于制备中间体22的过程来合成中间体23。

用于合成连接基团的过程

方案12.连接基团1的合成

中间体10：(2S,4R)-1-((S)-2-(8-溴辛酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。向8-溴辛酸(24mg，0.11mmol)和VHL-1(48mg，0.11mmol)在THF(1mL)中的混合物中添加DIEA(0.05mL，0.29mmol)和EDCI(23.5mg，0.12mmol)。在室温下搅拌12h之后，将反应减压浓缩。将所得残余物通过HPLC来纯化以获得作为棕色油状物的标题化合物(32mg，产率50％)。

连接基团1：4-(8-(((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-8-氧代辛基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯。向中间体10(28mg，0.043mmol)和哌嗪-1-羧酸叔丁酯(17mg，0.092mmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加K

根据用于制备连接基团1的过程来合成连接基团2、连接基团3、连接基团4和连接基团5。

连接基团2：4-(9-(((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-9-氧代壬基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯。白色固体，产率67％。

连接基团3：4-(10-(((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-10-氧代癸基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯。白色固体，产率60％。

连接基团4：4-(11-(((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-11-氧代十一烷基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯。白色固体，产率62％。

连接基团5：4-(12-(((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-12-氧代十二烷基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯。白色固体，产率56％。

方案13.连接基团6的合成

中间体26：(3R,5S)-1-((S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酰基)-5-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-3-基乙酸酯。向Boc保护的VHL-1(600mg，1.1mmol)在DCM(6mL)中的溶液中添加Ac

连接基团6：(3R,5S)-1-((S)-2-(7-氨基庚酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-5-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-3-基乙酸酯。向中间体26(29mg，0.05mmol)在DMSO(0.5mL)中的溶液中添加Boc保护的氨基酸(12mg，0.05mmol)、TBTU(17mg，0.05mmol)和DIEA(0.1mL，0.57mmol)。将溶液在室温下搅拌1h。在用MeOH淬灭之后，将反应用DCM(2mL)和TFA(0.5mL)稀释。将所得溶液在0℃下搅拌30min然后浓缩。将所得残余物通过制备型HPLC来纯化以得到标题化合物(17mg，产率49％)。

连接基团7：(3R,5S)-1-((S)-2-(7-氨基庚酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-5-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-3-基异丁酸酯。根据用于制备连接基团6的过程以57％的产率合成连接基团7。

方案14.连接基团8的合成

连接基团8：(2S,4R)-1-((S)-2-(4-(4-氨基哌啶-1-基)-4-氧代丁酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。根据用于制备连接基团6的过程以86％的产率合成连接基团8。

连接基团9：(2S,4R)-1-((S)-2-(4-(4-氨基哌啶-1-基)-4-氧代丁酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。根据用于制备连接基团6的过程以73％的产率合成连接基团9。δ9.28(s,1H),7.51(dd,J＝10.2,5.7Hz,2H),7.46(d,J＝8.2Hz,2H),4.68–4.49(m,5H),4.41(dd,J＝15.6,2.1Hz,1H),4.10(d,J＝13.8Hz,1H),3.91(d,J＝11.0Hz,1H),3.81(dd,J＝11.0,3.8Hz,1H),3.39(t,J＝11.5Hz,1H),3.18(t,J＝13.3Hz,1H),2.79–2.60(m,4H),2.60–2.49(m,4H),2.26(dd,J＝13.1,7.7Hz,1H),2.17–2.00(m,3H),1.61(dt,J＝12.1,8.1Hz,1H),1.55–1.41(m,1H),1.05(s,9H)。

方案15.连接基团10的合成

中间体28：(2S,4R)-1-((S)-2-(5-叠氮基戊酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。根据用于制备连接基团6的过程以79％的产率合成中间体28。

连接基团10：(2S,4R)-1-((S)-2-(5-(1-(氨基甲基)-1H-1,2,3l4-三唑-3-基)戊酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。将中间体28(35mg，0.06mmol)溶解于t-BuOH和水(5:1，0.5mL)中，然后添加烯丙胺(3.4mg，0.06mmol)、CuSO

方案16.连接基团11的合成

连接基团11：根据用于制备连接基团6的过程以95％的产率合成连接基团11。

方案17.连接基团12的合成

连接基团12：N-(2-氨基乙基)-2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰胺。根据用于制备连接基团6的过程以80％的产率合成连接基团12。

根据用于制备连接基团12的过程来合成连接基团13-23。

连接基团13：N-(3-氨基丙基)-2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰胺。产率82％。

连接基团14：N-(4-氨基丁基)-2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰胺。产率86％。

连接基团15：N-(5-氨基戊基)-2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰胺。产率80％。

连接基团16：N-(6-氨基己基)-2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰胺。产率79％。

连接基团17：N-(7-氨基庚基)-2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰胺。产率83％。

连接基团18：N-(7-氨基庚基)-2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰胺。产率83％。

连接基团19：N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰胺。产率82％。

连接基团20：N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰胺。产率85％。

连接基团21：N-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰胺。产率84％。

连接基团22：N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)-2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰胺。产率81％。

连接基团23：N-(17-氨基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷基)-2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰胺。产率78％。

连接基团24：10-(((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-10-氧代癸酸。以报道的方法(Galdeano等人，2014；Maniaci等人，2017)来合成连接基团24。

连接基团25：7-(((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-7-氧代庚酸。以报道的方法(Galdeano等人，2014；Maniaci等人，2017)来合成连接基团25。

连接基团26：8-(((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-8-氧代辛酸。以报道的方法(Galdeano等人，2014；Maniaci等人，2017)来合成连接基团24。

连接基团27：(2S,4R)-1-((S)-2-(2-(2-氨基乙氧基)乙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。以报道的方法(Galdeano等人，2014；Maniaci等人，2017)来合成连接基团26。

连接基团28：12-(((S)-1-((2S,4R)-4-乙酰氧基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-12-氧代十二烷酸。以与连接基团6相同的过程来合成连接基团28。

方案18.连接基团29的合成

连接基团29：2-(3-(2-((R)-1-((S)-2-((S)-2-(((苄氧基)羰基)(甲基)氨基)丙酰氨基)-2-环己基乙酰基)吡咯烷-2-基)噻唑-4-羰基)苯氧基)乙酸。标题化合物可以根据以下过程来合成：向中间体30(1当量)在DMF中的溶液中添加K

方案19.连接基团30的合成

连接基团30：4-(4-(((S)-2-((3R,5R,6S)-3-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-5-(3-氯苯基)-6-(4-氯苯基)-3-甲基-2-氧代哌啶-1-基)-3,3-二甲基丁基)磺酰基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸。标题化合物可以根据以下过程来合成：向中间体31(1当量)在DMSO中的溶液中添加琥珀酸(5当量)，然后添加TBTU(1.1当量)和DIEA(1.5当量)。在室温下搅拌1h之后，将混合物浓缩。将所得残余物通过HPLC来纯化以得到标题化合物。

方案20.连接基团31的合成

连接基团31：(3-(N-(6-(3-丁氧基苯氧基)-1,3-二甲基-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-5-基)氨磺酰基)苯甲酰基)甘氨酸。标题化合物可以根据以下过程来合成：向中间体32(1当量)在DMSO中的溶液中添加甘氨酸(1.1当量)，然后添加TBTU(1.1当量)和DIEA(1.5当量)。在室温下搅拌1h之后，将混合物浓缩。将所得残余物通过HPLC来纯化以得到标题化合物。

方案21.连接基团32的合成

连接基团32：((S)-1-(((S)-2-((R)-2-(4-(3-(2-氨基乙氧基)苯甲酰基)噻唑-2-基)吡咯烷-1-基)-1-环己基-2-氧代乙基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯。标题化合物可以根据以下过程来合成：向中间体33(1.2当量)和中间体34(1当量)在DMF中的混合物中添加K

方案22.连接基团33的合成

连接基团33：2-((3R,5R,6S)-1-((S)-1-((4-(3-氨基丙酰基)哌嗪-1-基)磺酰基)-3,3-二甲基丁烷-2-基)-5-(3-氯苯基)-6-(4-氯苯基)-3-甲基-2-氧代哌啶-3-基)乙酸叔丁酯。标题化合物可以根据以下过程来合成：向中间体35(1当量)和中间体36(1.1当量)在DMSO中的混合物中添加TBTU(1.1当量)和DIEA(1.5当量)。在室温下搅拌1h之后，将溶液浓缩。将所得残余物用在二噁烷中的HCl(4N)稀释。将所得混合物在室温下搅拌2h，然后进行浓缩。将所得残余物通过HPLC来纯化以得到标题化合物。

方案23.连接基团34的合成

连接基团34：N-(2-氨基乙基)-3-(N-(6-(3-丁氧基苯氧基)-1,3-二甲基-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-5-基)氨磺酰基)苯甲酰胺。将根据用于合成连接基团33的过程来合成连接基团34。

连接基团35：(2S,4R)-N-(2-(2-氨基乙氧基)-4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)-1-((1-氟环丙烷-1-羰基)-L-缬氨酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰胺。将使用已知的方法(Farnaby等人，2019)来合成连接基团35。

用于实施例的合成的过程

方案24.实施例1的合成

实施例1：2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-N-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)乙酰胺。向中间体4(7mg，0.011mmol)和连接基团6(5mg，0.012mmol)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加DIEA(17μL，0.1mmol)和TBTU(6mg，0.02mmol)。在室温下搅拌12h之后，将混合物通过HPLC来纯化以得到作为棕色油状物的标题化合物(6mg，产率50％)。

根据用于制备实施例化合物1的过程来合成实施例化合物2-22、37-45、63、64、102-107和130-134。

实施例2：2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-N-(3-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)丙基)乙酰胺。产率55％。

实施例3：2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-N-(4-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)丁基)乙酰胺。产率48％。

实施例4：2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-N-(5-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)戊基)乙酰胺。产率60％。

实施例5：2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-N-(6-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)己基)乙酰胺。产率50％。

实施例6：2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-N-(7-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)庚基)乙酰胺。产率49％。

实施例7：2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-N-(8-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)辛基)乙酰胺。产率51％。

实施例8：2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-N-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙基)乙酰胺。产率65％。

实施例9：2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-N-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)乙酰胺。产率62％。

实施例10：2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)乙酰胺。产率59％。

实施例11：2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-N-(17-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷基)乙酰胺。产率51％。

实施例12：2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-N-(17-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷基)乙酰胺。产率56％。

实施例13：(2S,4R)-1-((S)-2-(5-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)戊酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率60％。

实施例14：(2S,4R)-1-((S)-2-(6-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)己酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率70％。

实施例15：(2S,4R)-1-((S)-2-(7-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)庚酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率55％。

实施例16：(2S,4R)-1-((S)-2-(8-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)辛酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率65％。

实施例17：(2S,4R)-1-((S)-2-(9-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)壬酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率54％。

实施例18：(2S,4R)-1-((S)-2-(10-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)癸酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率56％。

实施例19：(2S,4R)-1-((S)-2-(11-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)十一烷酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率59％。

实施例20：(2S,4R)-1-((S)-2-(2-(2-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)乙氧基)乙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率67％。

实施例21：(2S,4R)-1-((S)-2-(叔丁基)-14-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4,13-二氧代-6,9-二氧杂-3,12-二氮杂十四烷酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率65％。

实施例22：(2S,4R)-1-((S)-2-(叔丁基)-17-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4,16-二氧代-6,9,12-三氧杂-3,15-二氮杂十七烷酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率70％。

实施例37：(2S,4R)-1-((S)-2-(7-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)庚酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率65％。

实施例38：(2S,4R)-1-((S)-2-(9-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)壬酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率67％。

实施例39：(2S,4R)-1-((S)-2-(叔丁基)-17-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4,16-二氧代-6,9,12-三氧杂-3,15-二氮杂十七烷酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率50％。

实施例40：(2R,4S)-1-((S)-2-(7-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)庚酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率62％。

实施例41：(2R,4S)-1-((S)-2-(9-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)壬酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率67％。

实施例42：(2R,4S)-1-((S)-2-(叔丁基)-17-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4,16-二氧代-6,9,12-三氧杂-3,15-二氮杂十七烷酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率54％。

实施例43：(2S,4R)-1-((S)-2-(2-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)乙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率57％。

实施例44：(2S,4R)-1-((S)-2-(3-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)丙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率53％。

实施例45：(2S,4R)-1-((S)-2-(4-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)丁酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率51％。

实施例63：(2R,4S)-1-((S)-2-(7-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)庚酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率59％。

实施例64：(2R,4S)-1-((S)-2-(9-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)壬酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率61％。

实施例102：(2S,4R)-1-((S)-2-(4-(4-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)哌啶-1-基)-4-氧代丁酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率70％。

HRMS(ESI-TOF)m/z：C

实施例103：1'-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰基)-N-((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)-[1,4'-双哌啶]-4-甲酰胺。产率66％。

实施例104：N

实施例105：(2S,4R)-1-((R)-2-(5-(4-((2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)戊酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率71％。

实施例106：(3R,5S)-1-((R)-2-(7-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)庚酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-5-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-3-基乙酸酯。产率64％。

实施例107：(3R,5S)-1-((R)-2-(7-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)庚酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-5-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-3-基异丁酸酯。产率68％。

实施例130：(2S,4R)-1-((S)-2-(3-(2-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)乙氧基)丙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率60％。

实施例131：(2S,4R)-1-((S)-14-(叔丁基)-1-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-2,12-二氧代-6,9-二氧杂-3,13-二氮杂十五烷-15-酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率62％。

实施例132：(2S,4R)-1-((S)-17-(叔丁基)-1-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-2,15-二氧代-6,9,12-三氧杂-3,16-二氮杂十八烷-18-酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率61％。

实施例133：(2S,4R)-1-((S)-23-(叔丁基)-1-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-2,21-二氧代-6,9,12,15,18-五氧杂-3,22-二氮杂二十四烷-24-酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率60％。

实施例134：(2S,4R)-1-((S)-2-(叔丁基)-17-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4,16-二氧代-6,9,12-三氧杂-3,15-二氮杂十七烷酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率51％。

方案25.实施例23的合成

实施例23：(2S,4R)-1-((S)-2-(8-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)辛酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。将连接基团1(14mg,0.019mmol)在DCM/TFA(2:1，1mL)中的溶液在室温下搅拌2h。减压浓缩后，获得所得粗制中间体11而无需进一步纯化。向中间体11和中间体7(5.2mg，0.014mmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加DIEA(17μL，0.1mmol)和TBTU(7mg，0.02mmol)。在室温下搅拌12h之后，将混合物通过HPLC来纯化以得到作为棕色油状物的标题化合物(6mg，产率45％)。

根据用于制备实施例化合物23的过程来合成实施例化合物24-27。

实施例24：(2S,4R)-1-((S)-2-(9-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)壬酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率58％。

实施例25：(2S,4R)-1-((S)-2-(10-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)癸酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率67％。

实施例26：(2S,4R)-1-((S)-2-(11-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)十一烷酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率63％。

实施例27：(2S,4R)-1-((S)-2-(12-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)十二烷酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率62％。

方案26.实施例28的合成

实施例28：(2S,4R)-1-((S)-2-(10-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-10-氧代癸酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。向中间体7(12mg，0.021mmol)和连接基团7(11mg，0.018mmol)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加DIEA(17μL，0.1mmol)和TBTU(6mg，0.02mmol)。在室温下搅拌12h之后，将混合物通过HPLC来纯化以得到作为棕色油状物的标题化合物(11mg，59％)。

根据用于制备实施例28化合物的过程来合成实施例化合物29、30、32-36、46-62和65-74。

实施例29：(2S,4R)-1-((S)-2-(11-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-11-氧代十一烷酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率60％。

实施例30：(2S,4R)-1-((S)-2-(12-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-12-氧代十二烷酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率69％。

实施例32：(2S,4R)-1-((S)-2-(13-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-13-氧代十三烷酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率65％。

实施例33：(2S,4R)-1-((S)-2-(14-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-14-氧代十四烷酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率61％。

实施例34：(2S,4R)-1-((S)-2-(12-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-12-氧代十二烷酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率63％。

实施例35：(2S,4S)-1-((S)-2-(12-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-12-氧代十二烷酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率70％。

实施例36：(2R,4S)-1-((S)-2-(12-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-12-氧代十二烷酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率69％。

实施例46：(2S,4R)-1-((S)-2-(4-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率63％。

实施例47：(2S,4R)-1-((S)-2-(5-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率69％。

实施例48：(2S,4R)-1-((S)-2-(6-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-6-氧代己酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率68％。

实施例49：(2S,4R)-1-((S)-2-(7-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率61％。

实施例50：(2S,4R)-1-((S)-2-(8-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-8-氧代辛酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率55％。

实施例51：(2S,4R)-1-((S)-2-(9-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-9-氧代壬酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率59％。

实施例52：(2S,4R)-1-((S)-2-(3-(3-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-3-氧代丙氧基)丙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率66％。

实施例53：(2S,4R)-1-((S)-2-(3-(2-(3-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)丙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率64％。

实施例54：(2S,4R)-1-((S)-2-(叔丁基)-16-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4,16-二氧代-7,10,13-三氧杂-3-氮杂十六烷酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率56％。

实施例55：(2S,4R)-1-((S)-2-(叔丁基)-19-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4,19-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-3-氮杂十九烷酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率63％。

实施例56：(2S,4R)-1-((S)-2-(叔丁基)-22-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4,22-二氧代-7,10,13,16,19-五氧杂-3-氮杂二十二烷酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率51％。

实施例57：4-((2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮。产率70％。

实施例58：4-((3-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-3-氧代丙基)氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮。产率72％。

实施例59：4-((4-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁基)氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮。产率60％。

实施例60：4-((5-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊基)氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮。产率69％。

实施例61：4-((6-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-6-氧代己基)氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮。产率65％。

实施例62：4-((7-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚基)氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮。产率68％。

实施例65：4-((8-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-8-氧代辛基)氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮。产率62％。

实施例66：4-((2-(3-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮。产率69％。

实施例67：4-((2-(2-(3-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮。产率65％。

实施例68：4-((2-(2-(2-(3-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮。产率60％。

实施例69：4-((15-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮。产率59％。

实施例70：4-((18-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-18-氧代-3,6,9,12,15-五氧杂十八烷基)氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮。产率63％。

实施例71：(2S,4R)-1-((S)-2-(2-(2-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率60％。

实施例72：(2S,4R)-1-((S)-2-(2-(2-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率66％。

实施例73：(2S,4R)-1-((S)-2-(叔丁基)-14-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4,14-二氧代-6,9,12-三氧杂-3-氮杂十四烷酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率67％。

实施例74：(2S,4R)-1-((S)-2-(叔丁基)-20-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4,20-二氧代-6,9,12,15,18-五氧杂-3-氮杂二十烷酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率56％。

方案27.实施例31的合成

实施例31：N

根据用于制备实施例化合物28的过程来合成实施例化合物75-101。

实施例75：N

实施例76：N

实施例77：N

实施例78：N

实施例79：N

实施例80：N

实施例81：N

实施例82：(2S,4R)-1-((S)-2-(2-(2-((2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率66％。

实施例83：(2S,4R)-1-((S)-2-(3-(3-((2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙基)氨基)-3-氧代丙氧基)丙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率68％。

实施例84：(2S,4R)-1-((S)-2-(叔丁基)-14-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4,11-二氧代-6,9-二氧杂-3,12-二氮杂十四烷酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率61％。

实施例85：(2S,4R)-1-((S)-2-(叔丁基)-16-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4,13-二氧代-7,10-二氧杂-3,14-二氮杂十六烷酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率61％。

实施例86：(2S,4R)-1-((S)-2-(叔丁基)-17-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4,14-二氧代-6,9,12-三氧杂-3,15-二氮杂十七烷酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率67％。

实施例87：(2S,4R)-1-((S)-2-(叔丁基)-19-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4,16-二氧代-7,10,13-三氧杂-3,17-二氮杂十九烷酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率64％。

实施例88：N

实施例89：N

实施例90：N-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙酰胺。产率70％。

实施例91：N-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙基)-3-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)丙烯酰胺。产率71％。

实施例92：N-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙基)-4-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)丁酰胺。产率73％。

实施例93：N-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙基)-5-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)戊酰胺。产率69％。

实施例94：N-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙基)-6-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)己酰胺。产率64％。HRMS(ESI-TOF)m/z：C

实施例95：N-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙基)-7-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)庚酰胺。产率70％。

实施例96：N-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙基)-8-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)辛酰胺。产率71％。

实施例97：N-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙基)-3-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)丙烯酰胺。产率73％。HRMS(ESI-TOF)m/z：C

实施例98：N-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙基)-3-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)丙烯酰胺。产率70％。

实施例99：N-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙基)-3-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙烯酰胺。产率68％。

实施例100：N-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙基)-1-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺。产率66％。

实施例101：N-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙基)-1-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-3,6,9,12,15-五氧杂十八烷-18-酰胺。产率72％。

方案28.实施例108的合成

实施例108：(2S,4R)-N-((S)-3-((2-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)乙基)氨基)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-3-氧代丙基)-1-((S)-2-(1-氟环丙烷-1-甲酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰胺。根据用于制备实施例1的过程来合成实施例108。产率61％。

根据用于制备实施例化合物108的过程来合成实施例化合物109-129。

实施例109：(2S,4R)-N-((S)-3-((3-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)丙基)氨基)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-3-氧代丙基)-1-((S)-2-(1-氟环丙烷-1-甲酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰胺。产率68％。

实施例110：(2S,4R)-N-((S)-3-((4-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)丁基)氨基)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-3-氧代丙基)-1-((S)-2-(1-氟环丙烷-1-甲酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰胺。产率63％。

实施例111：(2S,4R)-N-((S)-3-((5-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)戊基)氨基)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-3-氧代丙基)-1-((S)-2-(1-氟环丙烷-1-甲酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰胺。产率59％。

实施例112：(2S,4R)-N-((S)-3-((6-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)己基)氨基)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-3-氧代丙基)-1-((S)-2-(1-氟环丙烷-1-甲酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰胺。产率70％。

实施例113：(2S,4R)-N-((S)-3-((7-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)庚基)氨基)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-3-氧代丙基)-1-((S)-2-(1-氟环丙烷-1-甲酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰胺。产率60％。

实施例114：(2S,4R)-N-((S)-3-((2-(2-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)乙氧基)乙基)氨基)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-3-氧代丙基)-1-((S)-2-(1-氟环丙烷-1-甲酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰胺。产率66％。

实施例115：(2S,4R)-N-((S)-1-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-15-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-2,13-二氧代-6,9-二氧杂-3,12-二氮杂十五烷-15-基)-1-((S)-2-(1-氟环丙烷-1-甲酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰胺。产率65％。

实施例116：(2S,4R)-N-((S)-1-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-18-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-2,16-二氧代-6,9,12-三氧杂-3,15-二氮杂十八烷-18-基)-1-((S)-2-(1-氟环丙烷-1-甲酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰胺。产率63％。

实施例117：(2S,4R)-N-((S)-1-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-21-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-2,19-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,18-二氮杂二十一烷-21-基)-1-((S)-2-(1-氟环丙烷-1-甲酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰胺。产率61％。

实施例118：(2S,4R)-N-((S)-1-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-24-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-2,22-二氧代-6,9,12,15,18-五氧杂-3,21-二氮杂二十四烷-24-基)-1-((S)-2-(1-氟环丙烷-1-甲酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰胺。产率60％。

实施例119：(2S,4R)-N-((S)-3-((2-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)乙基)氨基)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-3-氧代丙基)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-甲基异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率68％。

实施例120：(2S,4R)-N-((S)-3-((3-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)丙基)氨基)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-3-氧代丙基)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-甲基异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率60％。

实施例121：(2S,4R)-N-((S)-3-((4-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)丁基)氨基)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-3-氧代丙基)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-甲基异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率59％。

实施例122：(2S,4R)-N-((S)-3-((5-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)戊基)氨基)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-3-氧代丙基)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-甲基异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率70％。

实施例123：(2S,4R)-N-((S)-3-((6-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)己基)氨基)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-3-氧代丙基)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-甲基异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率73％。

实施例124：(2S,4R)-N-((S)-3-((7-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)庚基)氨基)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-3-氧代丙基)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-甲基异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率63％。

实施例125：(2S,4R)-N-((S)-3-((2-(2-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)乙氧基)乙基)氨基)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-3-氧代丙基)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-甲基异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率65％。

实施例126：(2S,4R)-N-((S)-1-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-15-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-2,13-二氧代-6,9-二氧杂-3,12-二氮杂十五烷-15-基)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-甲基异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率60％。HRMS(ESI-TOF)m/z：C

实施例127：(2S,4R)-N-((S)-1-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-18-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-2,16-二氧代-6,9,12-三氧杂-3,15-二氮杂十八烷-18-基)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-甲基异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率63％。

实施例128：(2S,4R)-N-((S)-1-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-21-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-2,19-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,18-二氮杂二十一烷-21-基)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-甲基异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率60％。

实施例129：(2S,4R)-N-((S)-1-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-24-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-2,22-二氧代-6,9,12,15,18-五氧杂-3,21-二氮杂二十四烷-24-基)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-甲基异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率67％。

方案29.实施例135的合成

实施例135：(2S,4R)-1-((S)-2-(8-(7-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)-2,7-二氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)-8-氧代辛酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。根据用于制备实施例1的过程来合成实施例135。产率63％。

根据用于制备实施例化合物135的过程来合成实施例化合物136。

实施例136：(2S,4R)-1-((S)-2-(9-(7-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)-2,7-二氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)-9-氧代壬酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺。产率66％。

方案30.实施例137的合成

实施例137：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-(4-((2-(2-(((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。向中间体22(10mg，0.017mmol)和连接基团27(9mg，0.017mmol)在DMSO(0.5mL)中的溶液中添加NMM(10μL，0.085mmol)、EDCI(5mg，0.026mmol)和HOAt(3.5mg，0.026mmol)。在室温下搅拌12h之后，将混合物浓缩并且通过HPLC来纯化以产生作为棕色油状物的标题化合物(6mg，产率32％)。

根据用于制备实施例化合物137的过程来合成实施例化合物138-189。

实施例138：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-(4-((2-(3-(((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。产率40％。

实施例139：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-((S)-3-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-羰基)-2,2-二甲基-5,14-二氧代-7,10-二氧杂-4,13-二氮杂十七烷-17-基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。产率33％。

实施例140：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-((S)-3-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-羰基)-2,2-二甲基-5,15-二氧代-8,11-二氧杂-4,14-二氮杂十八烷-18-基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。产率41％。

实施例141：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-((S)-3-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-羰基)-2,2-二甲基-5,17-二氧代-7,10,13-三氧杂-4,16-二氮杂二十烷-20-基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。产率31％。

实施例142：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-((S)-3-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-羰基)-2,2-二甲基-5,18-二氧代-8,11,14-三氧杂-4,17-二氮杂二十一烷-21-基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。产率35％。

实施例143：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-((S)-3-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-羰基)-2,2-二甲基-5,18-二氧代-8,11,14-三氧杂-4,17-二氮杂二十一烷-21-基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。产率45％。

实施例144：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-((S)-3-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-羰基)-2,2-二甲基-5,24-二氧代-8,11,14,17,20-五氧杂-4,23-二氮杂二十七烷-27-基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。产率34％。

实施例145：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-(4-((2-(((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。产率39％。

实施例146：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-(4-((3-(((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-3-氧代丙基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。产率37％。

实施例147：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-(4-((4-(((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-4-氧代丁基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。产率41％。

实施例148：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-(4-((5-(((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-5-氧代戊基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。产率33％。

实施例149：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-(4-((6-(((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-6-氧代己基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。产率39％。

实施例150：5-(1-(4-((2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率33％。

实施例151：5-(1-(4-((2-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率37％。

实施例152：5-(1-(1-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-13-氧代-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十六烷-16-基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率36％。

实施例153：5-(1-(1-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-19-氧代-3,6,9,12,15-五氧杂-18-氮杂二十二烷-22-基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率34％。

实施例154：5-(1-(4-((2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)苯甲酰胺。产率40％。

实施例155：5-(1-(4-((3-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)丙基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率33％。

实施例157：5-(1-(4-((5-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)戊基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率37％。

实施例158：5-(1-(4-((6-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)己基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率36％。

实施例159：5-(1-(4-((7-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)庚基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率34％。

实施例160：5-(1-(4-((8-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)辛基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率38％。

实施例161：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-(4-(2-(2-(((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙酰氨基)丁基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。产率35％。

实施例162：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-(4-(3-(3-(((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-3-氧代丙氧基)丙酰氨基)丁基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。产率31％。

实施例163：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-((S)-3-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-羰基)-2,2-二甲基-5,12-二氧代-7,10-二氧杂-4,13-二氮杂十七烷-17-基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。产率39％。

实施例164：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-((S)-3-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-羰基)-2,2-二甲基-5,14-二氧代-8,11-二氧杂-4,15-二氮杂十九烷-19-基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。产率38％。

实施例165：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-((S)-3-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-羰基)-2,2-二甲基-5,15-二氧代-7,10,13-三氧杂-4,16-二氮杂二十烷-20-基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。产率30％。

实施例166：2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)-5-(1-((S)-3-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-羰基)-2,2-二甲基-5,17-二氧代-8,11,14-三氧杂-4,18-二氮杂二十二烷-22-基)-1H-咪唑-4-基)烟酰胺。产率30％。

实施例167：N

实施例168：N

实施例169：N

实施例170：N

实施例171：N

实施例172：N

实施例173：N

实施例174：N

实施例175：N

实施例176：N

实施例177：N

实施例178：5-(1-(4-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙酰氨基)丁基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率35％。

实施例179：5-(1-(4-(3-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)丙酰氨基)丁基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率33％。

实施例180：5-(1-(4-(4-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)丁酰氨基)丁基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率34％。

实施例181：5-(1-(4-(5-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)戊酰氨基)丁基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率35％。

实施例182：5-(1-(4-(6-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)己酰氨基)丁基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率38％。

实施例183：5-(1-(4-(7-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)庚酰氨基)丁基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率39％。

实施例184：5-(1-(4-(8-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)辛酰氨基)丁基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率31％。

实施例186：5-(1-(4-(3-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)丙酰氨基)丁基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率40％。

实施例186：5-(1-(4-(3-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)丙酰氨基)丁基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率29％。

实施例187：5-(1-(1-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-12-氧代-3,6,9-三氧杂-13-氮杂十七烷-17-基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率36％。

实施例188：5-(1-(1-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂二十烷-20-基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率29％。

实施例189：5-(1-(1-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-18-氧代-3,6,9,12,15-五氧杂-19-氮杂二十三烷-23-基)-1H-咪唑-4-基)-2-(((3R,4R)-3-氟-1-(2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰基)哌啶-4-基)氧基)烟酰胺。产率30％。

方案31.实施例190的合成

实施例190：(3R,5S)-1-((S)-2-(12-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-12-氧代十二烷酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-5-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-3-基乙酸酯。标题化合物可以根据以下过程来合成：向中间体7(1当量)和连接基团28(1.1当量)在DMSO中的溶液中添加DIEA(7当量)和TBTU(1.1当量)。在室温下搅拌1h之后，将混合物通过HPLC来纯化以得到标题化合物。

将根据用于制备实施例化合物190的过程从中间体7和相应的连接基团来合成实施例化合物191和192。

方案32.实施例193的合成

实施例193：(S)-N-((S)-1-环己基-2-((S)-2-(4-(3-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙氧基)苯甲酰基)噻唑-2-基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-2-(甲基氨基)丙烯酰胺。标题化合物可以根据以下过程来合成：向中间体7(1当量)和连接基团29(1.1当量)在DMSO中的溶液中添加DIEA(7当量)和TBTU(1.1当量)。在室温下搅拌1h之后，将混合物通过HPLC来纯化。将经纯化的化合物溶解于MeOH，然后添加Pd/C(0.1当量)，并且在H

将根据用于制备实施例化合物193的过程从中间体7和相应的连接基团来合成实施例化合物194-208。

方案33.实施例209的合成

实施例209：2-((3R,5R,6S)-5-(3-氯苯基)-6-(4-氯苯基)-1-((S)-1-((4-(4-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酰基)哌嗪-1-基)磺酰基)-3,3-二甲基丁烷-2-基)-3-甲基-2-氧代哌啶-3-基)乙酸。标题化合物可以根据以下过程来合成：向中间体7(1当量)和连接基团30(1.1当量)在DMSO中的溶液中添加DIEA(7当量)和TBTU(1.1当量)。在室温下搅拌1h之后，将混合物用DCM和TFA稀释。将所得溶液在室温下再搅拌1h。浓缩后，将残余物通过HPLC来纯化以得到标题化合物。

将根据用于制备实施例化合物209的过程从中间体7和相应的连接基团来合成实施例化合物210-223。

方案34.实施例224的合成

实施例224：N-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)-3-(N-(1,3-二甲基-2-氧代-6-(3-丙氧基苯氧基)-2,3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-5-基)氨磺酰基)苯甲酰胺。标题化合物可以根据以下过程来合成：向中间体7(1当量)和连接基团31(1.1当量)在DMSO中的溶液中添加DIEA(7当量)和TBTU(1.1当量)。在室温下搅拌1h之后，将混合物通过HPLC来纯化以得到标题化合物。

将根据用于制备实施例化合物209的过程从中间体7和相应的连接基团来合成实施例化合物225-239。

方案35.实施例240的合成

实施例240：(S)-N-((S)-1-环己基-2-((S)-2-(4-(3-(2-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)乙氧基)苯甲酰基)噻唑-2-基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-2-(甲基氨基)丙烯酰胺。标题化合物可以根据以下过程来合成：向中间体4(1当量)和连接基团32(1.1当量)在DMSO中的溶液中添加DIEA(7当量)和TBTU(1.1当量)。在室温下搅拌1h之后，将混合物用DCM和TFA稀释。将所得溶液在室温下再搅拌1h。浓缩后，将残余物通过HPLC来纯化以得到标题化合物。

将根据用于制备实施例化合物240的过程从中间体4和相应的连接基团来合成实施例化合物241-250。

方案36.实施例251的合成

实施例251：2-((3R,5R,6S)-5-(3-氯苯基)-6-(4-氯苯基)-1-((S)-1-((4-(3-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)丙酰基)哌嗪-1-基)磺酰基)-3,3-二甲基丁烷-2-基)-3-甲基-2-氧代哌啶-3-基)乙酸。标题化合物可以根据以下过程来合成：向中间体4(1当量)和连接基团33(1.1当量)在DMSO中的溶液中添加DIEA(7当量)和TBTU(1.1当量)。在室温下搅拌1h之后，将混合物用DCM和TFA稀释。将所得溶液在室温下再搅拌1h。浓缩后，将残余物通过HPLC来纯化以得到标题化合物。

将根据用于制备实施例化合物251的过程从中间体4和相应的连接基团来合成实施例化合物252-259。

方案37.实施例260的合成

实施例260：3-(N-(6-(3-丁氧基苯氧基)-1,3-二甲基-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-5-基)氨磺酰基)-N-(2-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)乙基)苯甲酰胺。标题化合物可以根据以下过程来合成：向中间体4(1当量)和连接基团34(1.1当量)在DMSO中的溶液中添加DIEA(7当量)和TBTU(1.1当量)。在室温下搅拌1h之后，将混合物通过HPLC来纯化以得到标题化合物。

将根据用于制备实施例化合物260的过程从中间体4和相应的连接基团来合成实施例化合物261-269。

方案38.实施例270的合成

实施例270：(2S,4R)-N-(2-(2-(2-(4-(4-((6-环丙基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-3-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙酰氨基)乙氧基)-4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)-1-((S)-2-(1-氟环丙烷-1-甲酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰胺。向中间体4(1当量)和连接基团35(1.1当量)在DMSO中的溶液中添加DIEA(7当量)和TBTU(1.1当量)。在室温下搅拌1h之后，将混合物通过HPLC来纯化以得到标题化合物。

将根据用于制备实施例化合物270的过程从中间体4和相应的连接基团来合成实施例化合物271-280。

实施例化合物在下表1中示出。

表1

在表1中，PTK6破坏剂/降解剂的结构的左侧部分与PTK6结合(如，例如化合物21d(Zeng等人，2011)、化合物4f(Mahmoud等人，2014)、化合物1(Yamamoto、2016)、XMU-MP-2(Jiang等人，2017)、和化合物3s(Cardenas等人，2018)、及其类似物)，并且结构的右侧部分将泛素化机构募集至PTK6，这诱导PTK6在蛋白酶体处的聚泛素化和降解。

已经合成了对应于实施例1至189的化合物并且在表1中提供化合物代码。尚未合成表1中对应于实施例190至280的化合物并且未提供化合物代码。这些化合物可以根据上述方案来合成。

如本文中所使用的，在针对特定化合物所提供的结构与化学名称不符的情况下，结构将控制。

实施例281.评估所选择的化合物对于降低癌细胞中的PTK6蛋白水平的作用(图2-5)。

将MDA-MB231细胞用DMSO或者2.5μM、2μM或500nM指定的化合物处理24小时。蛋白质印迹结果显示多种化合物显著地降低PTK6蛋白水平。

实施例282.PTK6降解剂抑制三阴性MDA-MB231乳腺癌细胞在3-D培养物中的生长和侵袭性分支(图6)。

在3D培养物中，将MDA-MB231细胞用1μM指定的化合物处理3天。YX39-103和YX39-105显著地抑制这些细胞的生长和侵袭性分支，而阴性对照化合物和PTK6激酶活性抑制剂则没有。

实施例283.YX39-103和YX39-105抑制3-D培养物中的MCF7 ER+乳腺癌细胞的活力(图7)。

使用3D Cell Titer Glo(Promega)检测条件，将MCF7细胞用0μM、1μM、2μM和5μM的YX39-103、YX39-105和化合物21d处理4天。YX39-103和YX39-105以剂量依赖性方式显著地损害MCF7细胞的活力，而PTK6激酶抑制剂化合物21的作用较不明显。

实施例284.YX39-103和YX39-105抑制耐受化学疗法的卵巢癌细胞(CP70)的活力(图8)。

在3D培养物中将对铂类耐药的卵巢癌细胞CP70用PTK6降解剂或激酶抑制剂P21d(2μM)处理6天。6天后的活力通过3D Cell Titer glo来评估。

实施例285.MG132预处理防止MDA-MB231细胞中PTK6被YX39-105降解(图9)。

将MDA-MB231细胞用MG132(10μM)或DMSO预处理2小时，然后用PTK6降解剂YX39-105或DMSO再处理4小时。将细胞裂解并且通过Western分析来评估PTK6的表达。

实施例286.PTK6抑制剂预处理防止MDA-MB231细胞中PTK6被YX39-105降解(图10)。

将用DMSO或PTK6激酶活性抑制剂P21d(5μM)预处理2小时的MDA-MB231细胞随后用PTK6降解剂YX39-105处理24小时。通过Western分析来评估PTK6的表达。

实施例287.PTK6降解剂下调耐受内分泌疗法的ER+MCF7/EDR细胞中的PTK6(图11)。

将单层培养物中的MCF7/EDR细胞用指定浓度的PTK6降解剂处理24小时。将细胞裂解并且评估PTK6的表达。

实施例288.PTK6降解剂而不是激酶活性抑制剂抑制在3D培养物中的活力(图12)。

在单层培养物中用1μM化合物进行24小时处理之后，评估用PTK6降解剂、阴性对照化合物或PTK6激酶活性抑制剂处理的细胞中PTK6的表达(图12A)。将细胞裂解并且将蛋白分离和用抗PTK6抗体(Cell Signaling)探测。

将MDA-MB231三阴性乳腺癌细胞接种至3D基质胶培养物(4×10

实施例289.PTK6降解剂抑制MDA-MB231细胞中的PTK6蛋白水平(图13)。

在单层培养物中，将MDA-MB231细胞用化合物(500nM或1μM)处理24小时。将细胞裂解并且用抗PTK6抗体来探测裂解物。

通用化学方法：

所有化学药品和试剂均购自商业供应商并且在没有进行进一步纯化的情况下使用。使用具有DAD检测器的Agilent 1200系列系统来获得所有化合物的HPLC图谱。在2.1×150mm Zorbax 300SB-C18 5μm柱上使用含有0.1％甲酸的水作为溶剂A和使用含有0.1％甲酸的乙腈作为溶剂B以0.4ml/min的流速来进行色谱法。线性梯度如下：1％B(0-1min)、1-99％B(1-4min)和99％B(4-8min)。使用具有电喷雾电离(ESI)源的Agilent G1969A API-TOF以正离子模式获得高分辨率质谱(HRMS)数据。在Bruker DRX-600光谱仪上记录质子核磁共振(

抗体和试剂

购自Cell Signaling Technology的抗体为：GAPDH(14C10)、β-微管蛋白(9F3)、E-钙粘素(24E10)、和PTK6。从Santa Cruz Biotechnology获得的抗体为：BRK抗体(C-18和D-7)、山羊抗兔IgG-HRP和山羊抗小鼠IgG-HRP。PTK6抑制剂(吡嗪-21d，P21d)根据公开的描述来合成[24]。MDA231细胞、MCF7细胞、UACC893细胞和MCFA-10A细胞从ATCC获得。OV2008购自ThermoFisher Scientific。HeyC2购自Cellutions Biosystems,Inc。所有细胞系均按照ATCC推荐的培养基指南或单独的供应商说明书来培养。在补充有10％FBS的RPMI-1640中培养MDA-MB231细胞(ATCC)。根据公开的方案(Ito等人，2017；Ito等人，2016)来培养MCF7TamR细胞、EDR细胞、FulvR细胞和MMTV-myc细胞。

RNAi敲低

靶向PTK6的siRNA从GE Healthcare Dharmacon获得。使用Oligofectamine(LifeTechnologies)按照制造商的规程进行转染。靶向PTK6的短发夹-RNA购自Sigma-Aldrich。通过使用Lipofectamine 2000和Plus试剂(Life Technologies)用shRNA载体和包装质粒(Delta 8.9和pCMV-VSV-G)共转染293T细胞来产生慢病毒。收集上清液并且将其在储存-80℃下。用病毒上清液来感染细胞。

免疫印迹

如之前所述(Irie等人，2010)，使细胞在含有NaF、Na

3D细胞生长检测

将MDA-MB231细胞、MCF-7细胞、OV2008细胞和Hey C2细胞(3,000个细胞)添加至覆盖有50μl生长因子减少的Matrigel

细胞凋亡检测

将含有漂浮细胞的培养基转移至15ml锥形管。通过在相同的管中在37℃下进行胰蛋白酶消化来收集附壁的细胞，然后以360×g旋转3min。将细胞团块用冰冷的PBS洗涤一次并且重悬于含有5μl FITC-AnnexinV和PI的250μl 1×结合缓冲液(BD Biosciences，#556547)中。在黑暗中在室温下温育15min之后，添加250μl 1×结合缓冲液并且如前所述(Park等人，2015)来进行流式细胞术分析。

肿瘤异种移植研究

对六周龄雌性裸(nu/nu)小鼠(Charles River Laboratories)皮下注射感染有对照或PTK6 shRNA慢病毒的MCF-7细胞或UACC893R细胞。在皮下注射至裸鼠体内之前，在体外产生表达PTK6 shRNA或载体对照shRNA的癌细胞。将来自组合购买的笼子的小鼠随机分配来注射表达PTK6或对照shRNA的细胞。每周两次监测肿瘤生长，并且确定肿瘤体积[V＝1/2(L×W

肺定植(Lung colonization)检测

将MDA-MB231细胞或MMTV-myc细胞用PTK6 shRNA病毒转导72小时。对于PTK6抑制剂实验，将MMTV-myc细胞用PTK6抑制剂P21d体外处理48h。将shRNA感染的细胞或抑制剂处理的细胞用PBS洗涤三次。将在100μl PBS中的MDA-MB231细胞(每只小鼠2×10

其它实施方案

应当理解的是，虽然已经结合本发明的详细说明描述了本发明，但是前述说明旨在说明并且不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。

参考文献

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