一种具有启动子和编码信号肽功能的DNA片段及其在生产β-甘露聚糖酶中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域和分子生物学技术领域，涉及一种DNA片段，具体说，涉及一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能和编码信号肽功能的DNA片段及其在生产β-甘露聚糖酶中的应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌是一种重要的原核表达宿主，其遗传背景清晰，遗传操作简单，具有较强的蛋白分泌能力，不具有致病性，发酵工艺成熟。广泛用于生产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等工业用酶。

启动子是直接影响基因表达水平的重要的基因组调控元件，在细菌中，RNA聚合酶和相关的sigma因子识别启动子，并通过调节蛋白与启动子内特定位点的结合而被招募。迄今为止，已有三种启动子用于枯草杆菌异源蛋白的高水平表达：组成性启动子、诱导特异性启动子和自诱导启动子。组成型启动子，如P43启动子，会影响菌体生长，不适合生产对宿主有毒的物质。诱导型启动子(如Pspac和Pxyl)是使用最广泛的类型，但是诱导物如IPTG和木糖一般价格昂贵，会增加工业生产成本。自诱导启动子是大规模蛋白质生产的理想选择。这样的启动子可以诱导目标基因从对数晚期到稳定期的表达，而不需要诱导物，这有助于以较低的成本高效生产异源蛋白，然而，低活性是该类启动子目前广泛应用的一个障碍。因此有必要找到更高效、适合于工业培养基生产表达的启动子。除启动子外，核糖体结合位点(RBS)、SD序列和信号肽等元件也会影响蛋白的表达。通常根据转录组测序结果，可以筛选到转录水平较高的启动子，然而进行蛋白表达时还需要对上述元件进行进一步的优化。

β-甘露聚糖酶是一类能够水解β-1，4-D甘露糖苷键连接的甘露聚糖、葡苷聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡苷聚糖等的半纤维素酶，广泛应用于饲料行业、食品行业和造纸行业等。微生物是其最主要的生产来源，而细菌产的β-甘露聚糖酶比真菌来源的温度稳定性更好，尤其是以芽孢杆菌来源的甘露聚糖酶。但检索发现，利用在枯草芽孢杆菌胞外蛋白质组信息，克隆胞外含量较高蛋白的启动子和信号肽编码区的DNA片段并使用该启动子及其信号肽编码构建蛋白分泌表达载体应用于β-甘露聚糖酶的分泌表达，实现高效生产β-甘露聚糖酶的文献或专利还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能和编码信号肽功能的DNA片段及其在生产β-甘露聚糖酶中的应用。

本发明所述枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段，其特征在于：该DNA片段命名为启动子P2454，其核苷酸序列为如下任一序列：

(1)如序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

(2)与序列表中SEQ ID No.1所示的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列；

(3)对上述(1)或(2)所示DNA序列进行一个或多个碱基的取代、缺失和/或添加且具有相同启动子功能的DNA序列。

上述枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段，优选的实施方式是：所述DNA片段命名为启动子P2454，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌高效分泌表达蛋白的信号肽，其特征在于：所述信号肽命名为信号肽SP2454，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

编码上述枯草芽孢杆菌信号肽的基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了一种重组载体，其特征在于：所述重组载体命名为pN-P2454-SP2454，是将上述启动子P2454核苷酸序列与上述编码信号肽SP2454的基因核苷酸序列连接到载体pNW33N上获得；其中所述编码信号肽SP2454的基因核苷酸序列连接在启动子P2454下游，在P254介导下表达。

本发明还提供了一种β-甘露聚糖酶分泌表达载体，其特征在于：所述分泌表达载体命名为pN-gmuG，是将编码β-甘露聚糖酶的基因gmuG连接到重组载体pN-P2454-SP2454的SP2454编码基因下游得到；其中所述编码β-甘露聚糖酶的基因核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了一种产β-甘露聚糖酶的重组工程菌，其特征在于：是利用β-甘露聚糖酶分泌表达载体pN-gmuG转化宿主细胞得到。

上述的重组工程菌中：所述宿主细胞优选草芽孢杆菌7-3-3，所述表达载体pN-gmuG转化宿主细胞得到的重组工程菌命名为BS-OEgmuG。

含上述枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段和上述枯草芽孢杆菌高效分泌表达蛋白的信号肽的重组载体或重组工程菌在生产β-甘露聚糖酶中的应用。

申请人通过对一株在麸皮玉米粉组成廉价培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌的发酵液上清进行了蛋白质组分析，筛选到了一个在发酵液中含量较高的蛋白，克隆了其启动子和信号肽编码序列。使用该启动子及其信号肽编码构建蛋白分泌表达载体，并成功应用于β-甘露聚糖酶的分泌表达，实现了高效生产。该启动子特征揭示它在工业生产中的应用具有重要价值。本发明的突出效果体现在：在当前枯草芽孢杆菌缺少可工业化应用的启动子背景下，本发明提供的具有启动子和信号肽功能的DNA片段，不需要添加诱导物的条件下即能实现蛋白基因的分泌表达，将其运用于β-甘露聚糖酶的表达，为枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白提供了有效的手段，具有很好的开发前景。

附图说明

图1.含有启动子和信号肽编码序列的DNA片段PCR扩增产物的电泳图，其中：M为DNA分子量Marker，泳道1为DNA片段。

图2.重组载体pN-P2454-SP2454构建示意图。

图3.重组载体pN-gmuG构建示意图。

图4.SDS-PAGE检测β-甘露聚糖酶表达，其中：M为蛋白分子量Marker，泳道1为菌株BS-OEgumG发酵液上清，泳道2为BS-pN发酵液上清。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。实施例中所描述的方法内容若无特殊说明，均为常规实验方法。

实验条件：

1.菌株与载体

枯草芽孢杆菌7-3-3(Bacillus subtilis 7-3-3)分离自山东大学校园土壤，并保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO.M200038；大肠杆菌感受态细胞Trans5α(购自北京全式金生物技术有限公司)；大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pNW33N(GenBank:AY237122.1，购自Bacillus Genetic Stock Center，USA)。

2.酶类及其他生化试剂

FastPfu DNA聚合酶、Basic Seamless Cloning and Assembly Kit无缝克隆试剂盒，T4 DNA连接酶均购自全式金公司，细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Omega Bio-Tek公司，FastDigest限制性内切酶购自ThermoFisher公司，所述试剂使用方法参照其说明书。LBG(Locust bean gum fromCeratonia siliqua seeds)购自Sigma-Aldrich，其他普通分析纯化学试剂购自国药集团。

3.培养基

LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化钠10.0，pH 7.0，固体LB培养基额外添加1.6％琼脂粉。

种子培养基(g/L)：葡萄糖10.0，蛋白胨5.0，酵母提取物5.0，氯化钠5，磷酸氢二钾10，硫酸镁0.5。

发酵培养基(g/L)：麸皮5.0、玉米粉4.2,硫酸铵0.3，磷酸氢二钾0.1，硫酸镁0.2，使用前添加单独灭菌的碳酸钠0.1。

实施例1枯草芽孢杆菌7-3-3胞外分泌蛋白的获得及蛋白质组鉴定

将枯草芽孢杆菌7-3-3(保藏编号CCTCC NO.M200038)从-80℃甘油管取出划线于LB固体平板上，37℃培养12h，挑取单菌落于5mL LB液体培养基，37℃，200rpm培养12h；按体积比3％接种量转接于种子培养基中，37℃，200rpm培养4h；按体积比10％接种量接种于发酵培养基，使用500mL三角瓶，发酵培养基装液量为100mL，37℃，200rpm进行摇瓶发酵培养。

于55h对发酵液进行取样1mL，于4℃，8000g离心后获得上清液。使用含10％三氯乙酸的丙酮溶液，-20℃预冷后，3mL丙酮溶液与500μL发酵液上清混合，-20℃放置过夜。4℃，8000g离心20min，弃上清，用预冷的丙酮洗涤沉淀2次，空气中干燥沉淀15min，即得到枯草芽孢杆菌7-3-3胞外分泌蛋白。

蛋白质组测序委托华大科技股份有限公司。利用LTQ-Orbitrap高分辨质谱仪对得到的枯草芽孢杆菌7-3-3胞外分泌蛋白进行无标记质谱定量分析，样品处理方法参照公司说明。

实施例2筛选并克隆启动子及信号肽编码序列

采用信号强度法对枯草芽孢杆菌7-3-3胞外分泌蛋白定量信息进行提取，采用肽段定量值与全部肽段定量值之和的比值作为蛋白丰度比，对数据进行处理，筛选在蛋白质谱中丰度较高的蛋白基因。使用SignalP 5.0在线预测服务(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对丰度较高的蛋白预测信号肽，“Organism group”选择“Gram-positive”，输入蛋白质氨基酸序列进行预测。根据预测结果，进一步筛选具有信号肽的蛋白，最终筛选到一个蛋白表达量较高且具有信号肽的蛋白基因2454，其启动子命名为P2454，长300bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；信号肽命名为SP2454，含有25个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码信号肽SP2454的基因序列长75bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

使用细菌基因组提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌7-3-3总DNA，提取方法参照说明书。根据所述DNA设计如下引物：

上游引物：5'

下游引物：5'

下划线表示酶切位点和保护碱基序列，以便后续克隆。

以枯草芽孢杆菌7-3-3总DNA为模板，使用FastPfu DNA聚合酶扩增375bp大小的DNA片段，即具有启动子功能和编码信号肽功能的DNA片段，PCR反应条件为，94℃变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸3min，扩增产物大小与预期相符(见图1)。

实施例3分泌表达载体pN-P2454-SP2454的构建

以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pNW33N为骨架，用限制性内切酶KpnI和BamHI将质粒进行酶切，酶切产物经过DNA胶回收试剂盒进行纯化。实施例2中扩增的DNA片段经过同样的酶切和纯化操作。使用T4 DNA连接酶连接纯化后的DNA片段和质粒pNW33N，连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性转化子并委托北京擎科新业生物技术有限公司进行测序验证，得到正确的重组载体，该分泌表达重组载体命名为pN-P2454-SP2454，如图2所示，启动子P2454核苷酸序列与编码信号肽SP2454的基因连接到载体pNW33N的KpnI和BamHI酶切位点之间，编码信号肽SP2454的基因核苷酸序列连接在启动子P2454下游，在P254介导下表达。

实施例4β-甘露聚糖酶表达载体的构建

使用限制酶BamH I和Sal I双酶切重组载体pN-P2454-SP2454，酶切产物经过DNA胶回收试剂盒进行纯化。

根据SignalP 5.0在线预测网站预测信号肽结果，β-甘露聚糖酶基因gmuG前93bp为信号肽编码区，以枯草芽孢杆菌7-3-3总DNA为模板，扩增无信号肽编码区的gmuG基因即编码β-甘露聚糖酶的基因核苷酸序列(核苷酸序列如SEQ ID No.4所示)。使用引物对：

上游引物：5'aacagcagtactaccaatagtCATACTGTGTCGCCTGTGAATCC 3'

下游引物：5'aagcttgcatgcctgcag TCATTCAACGATTGGCGTTAAAGAAT3'

扩增出1011bp的DNA片段，PCR反应条件为，94℃变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸3min，回收扩增产物并纯化。使用Basic SeamlessCloning and Assembly Kit无缝克隆试剂盒对纯化后的DNA片段和载体进行连接，挑选阳性转化子并测序验证，得到β-甘露聚糖酶分泌表达载体，命名为pN-gmuG。该分泌表达载体pN-gmuG是将编码β-甘露聚糖酶的基因连接到重组载体pN-P2454-SP2454的SP 2454编码基因下游得到(见图3)；其中所述编码β-甘露聚糖酶的基因核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

实施例5β-甘露聚糖酶表达重组工程菌的构建

枯草芽孢杆菌7-3-3电击转化：挑取新鲜单菌落于5mL LB培养基，37℃，200rpm培养过夜；按体积比1％接种量转接至50mL GM培养基(LB培养基添加0.5M山梨醇)中，37℃，200rpm培养3-4小时至OD

实施例6β-甘露聚糖酶的发酵生产及表达水平检测

将得到的工程菌株BS-OEgmuG和BS-pN按照实施例1的方法进行发酵培养，并添加额外的5μ/mL氯霉素，菌株7-3-3作为对照，于24h，48h，72h，96h分别取样1mL，在8000g条件下离心取上清得到粗酶液，进行下一步分析。

SDS-PAGE：将菌株BS-OEgmuG和BS-pN的72h粗酶液进行SDS-PAGE蛋白电泳，加入5×上样缓冲液对样品进行沸水浴处理10分钟，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％，上样量为20μL。蛋白胶图显示在38kDa附近有明显的条带与β-甘露聚糖酶预期大小一致，对照在此大小范围条带较弱，实验结果说明甘露聚糖酶得到了表达(见图4)。

酶活测定方法：参考GB/T 36861-2018《饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的测定分光光度法》，稍作修改。将底物0.5％LBG溶解在pH为5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，将60μL底物和20μL适当稀释的酶液混和，37℃水浴30分钟。加入120μLDNS终止反应，用沸水煮沸10分钟，然后将混合物在冰上冷却5分钟，加入800μL水稀释，然后在540nm处测量吸收峰，β-甘露聚糖酶活性单位定义为：在37℃，pH为5.5条件下，每分钟从浓度为3mg/mL的甘露聚糖溶液中释放1μmol还原糖(以D-甘露糖计)所需要的酶量为一个β-甘露聚糖酶活力单位(U)。

重组枯草芽孢杆菌的胞外β-甘露聚糖酶酶活测定结果，摇瓶发酵72h酶活最高，菌株BS-OEgmuG酶活达到1788U/mL，菌株BS-pN酶活为15.4U/mL。

序列表

<110>山东大学

<120>一种具有启动子和编码信号肽功能的DNA片段及其在生产β-甘露聚糖酶中的应用

<141>2020-12-31

<160>8

<210>1

<211>300

<212> DNA

<213>枯草芽孢杆菌7-3-3

<221>启动子P2454的核苷酸序列

<222>（1）…（300）

<400> 1

catataagtg tcctgctcgt tttttccgag gtacttccat gtgaggagat cgccgtttaa 60

agcaatctct tccggaagcc agaactgctt cacgttttgg ttatagaaca tttgggtaaa 120

atcgtcttca tgctttgacc agtttgctgc agtatacagc ttgttttcgt tgagttgtga 180

caaaaatgtg acctcctaaa tattttttcc tccctcacca cctgtaaaaa gaagggaata 240

ttttataaat gttgtaaatt ttataatgca acatattcac tattaaggga ggaataaaaa 300

<210> 2

<211> 25

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌7-3-3

<221>信号肽SP2454的氨基酸序列

<222>（1）…（25）

<400> 2

Met Lys Lys Lys Phe Ile Ala Gly Ala Leu Val Leu Gly Leu Ile Pro

1 5 10 15

Thr Ile Gly Ser Thr Ala Val Ser Ala

20 25

<210> 3

<211> 75

<212> DNA

<213>枯草芽孢杆菌7-3-3

<221>编码信号肽SP2454的基因核苷酸序列

<222>（1）…（75）

<400> 3

atgaaaaaga aatttattgc tggtgcttta gttttaggtc taatacctac tattggtagt 60

actgctgttt cagca 75

<210> 4

<211> 1011

<212> DNA

<213>枯草芽孢杆菌7-3-3

<221>β-甘露聚糖酶核苷酸编码序列

<222>（1）…（1011）

<400> 4

catactgtgt cgcctgtgaa tcctaatgcc cagcagacaa caaaaacagt gatgaactgg 60

cttgcgcacc tgccgaaccg aacggaaaac agagtccttt ccggagcgtt cggaggttac 120

agtcatgaca cattttctat ggctgaggct gatagaatcc gaagcgccac cgggcaatcg 180

cctgctattt atggctgcga ttatgccaga ggatggcttg aaacagcaaa tattgaagat 240

tcaatagatg taagctgcaa cggcgattta atgtcgtatt ggaaaaatgg cggaattccg 300

caaatcagtt tgcacctggc gaaccctgct tttcagtcag ggcattttaa aacaccgatt 360

acaaatgatc agtataaaaa aatactagat tcttcaacag cagaaggaaa gcggctaaat 420

gccatgctca gcaaaattgc tgacggactt caagagctgg agaaccaagg tgtgcctgtt 480

ctgttcaggc cgctgcatga aatgaacggt gaatggtttt ggtggggact tacatcatat 540

aatcaaaagg ataatgaaag aatctcttta tataaacagc tctacaagaa aatctatcat 600

tatatgaccg acacaagagg acttgatcat ttgatttggg tttactctcc cgacgccaac 660

cgagatttta aaactgattt ttacccgggc gcgtcttacg tggatattgt cggattagat 720

gcgtattttc aagatgccta ctcgatcaat ggatacgatc agctaacagc gcttaataaa 780

ccatttgctt ttacagaagt tggcccgcaa acagcaaacg gcagcttcga ttacagcctg 840

ttcatcaatg caataaaaca aaaatatcct aaaaccattt acttcctcgc atggaatgat 900

gaatggagcc cagcagtaaa caagggtgct tcagctttat atcatgacag ctggacactc 960

aataagggag aaatatggaa tggcgattct ttaacgccaa tcgttgaatg a 1011

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213>人工序列

<221> 扩增启动子和信号肽编码区上游引物

<222>（1）…（32）

<400> 5

ggggtaccca tataagtgtc ctgctcgttt tt 32

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213>人工序列

<221>扩增启动子和信号肽编码区下游引物

<222>（1）…（34）

<400> 6

cgggatcctg ctgaaacagc agtactacca atag 34

<210>7

<211> 44

<212> DNA

<213>人工序列

<221> 扩增β-甘露聚糖酶编码序列上游引物

<222>（1）…（44）

<400> 7

aacagcagta ctaccaatag tcatactgtg tcgcctgtga atcc 44

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213>人工序列

<221>扩增β-甘露聚糖酶编码序列下游引物

<222>（1）…（44）

<400>8

aagcttgcat gcctgcagtc attcaacgat tggcgttaaa gaat 44