包含IDS的融合蛋白及其用途
文献发布时间：2023-06-19 11:14:36
技术领域
本发明涉及包含艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)的融合蛋白及其用途，并且更具体地，涉及其中IDS酶和与胰岛素受体结合的抗体片段融合的融合蛋白及其用途。
背景技术
亨特综合征(Hunter syndrome)(黏多糖贮积症II)是中枢神经系统(CNS)中发生的疾病之一，并且是由艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)中的突变引起。IDS是糖胺聚糖(GAG)分解必不可少的酶。在IDS的活性降低或丧失的情况下，GAG在组织和细胞中累积，这引起疾病。当前，Hunterase和Elaprase被用作亨特综合征的治疗剂。然而，这些用于中枢神经系统疾病的治疗剂的问题在于，不能正确地实现将治疗剂递送至脑，因为其在注射到患者的静脉中之后无法通过血脑屏障(blood-brain-barrier，BBB)。
同时，脑血管细胞通过BBB来限制血液与脑之间物质的转移，从而保护脑。因此，难以将通过血管在体内循环的物质(例如抗体或酶)用作中枢神经系统(CNS)中发生的疾病的治疗剂，因为这样的物质通常不通过BBB，并且因此其向脑的转移受到限制。
随后发现，转铁蛋白或胰岛素可以通过脑血管细胞表面上表达的蛋白质(例如转铁蛋白受体(TfR)或胰岛素受体(IR))使用受体介导的转胞吞作用(RMT)机制递送至脑。该机制已被用于开发将治疗剂递送至脑的方法。近来，已经开发了可以使用可通过BBB的抗TfR抗体将多种物质(例如IDS治疗剂)递送至脑的技术(韩国专利公开号10-2016-0011198和10-2015-0039798)。
因此，需要开发对BBB受体具有高亲和力并且具有优异的BBB通过效率的IDS治疗剂。
发明内容
技术问题
因此，本发明人开发了能够通过BBB的IDS酶治疗剂。具体地，本发明的一个目的是提供其中与胰岛素受体结合的抗体片段、IDS酶和Fc区融合的不对称融合蛋白及其用途。
问题的解决方案
为了实现上述目的，本发明提供了：融合蛋白，其包含：包含与胰岛素受体结合的抗体片段的第一结构域，包含具有艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)活性的蛋白质的第二结构域，和Fc区；以及用于制备所述融合蛋白的方法。
另外，本发明提供了用于预防或治疗中枢神经系统疾病的药物组合物，其包含所述融合蛋白作为活性成分。
另外，本发明提供了用于制备融合蛋白的方法，其包括以下步骤：使与胰岛素受体结合的抗体片段与Fc区结合以制备第一单体；使艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)与异二聚体Fc区结合以制备第二单体；以及将第一单体与第二单体混合。
另外，本发明提供了所述融合蛋白用于预防或治疗中枢神经系统疾病的用途。
另外，本发明提供了所述融合蛋白用于制造用于预防或治疗中枢神经系统疾病的药物的用途。
另外，本发明提供了用于预防或治疗中枢神经系统疾病的方法，其包括向个体施用所述融合蛋白或包含所述融合蛋白的药物组合物的步骤。
发明的有益效果
根据本发明的融合蛋白可以有效地通过BBB，以使得IDS酶治疗剂被递送至脑。因此，包含所述融合蛋白作为活性成分的药物组合物可用作中枢神经系统疾病的治疗剂。特别地，预期药物组合物能够预防或治疗由溶酶体的累积引起的多种疾病。另外，从所述融合蛋白表现出与动物BBB受体和人BBB受体的优异的交叉反应性的观点出发，所述融合蛋白的优点是可以将已应用于多种疾病动物模型的融合蛋白直接应用于临床研究。
附图简述
图1示出了融合蛋白的结构和作用机制的示意图。
图2示出了与胰岛素受体结合的抗体(IR739)中的突变引入位点。
图3示出了与胰岛素受体结合的抗体变体(H031、HL009、L016、L113和H118)的CDR3序列。
图4示出了通过进行FACS分析以评估IR739在人、猴和小鼠中的交叉反应性而获得的结果。
图5示出了通过比较IR739和IR739的变体(H031、HL009、L016、L113和H118)与人胰岛素受体和小鼠胰岛素受体的结合亲和力而获得的结果。
图6示出了通过比较IR739和融合蛋白(IDS-IR739、IDS-HL009和IDS-H031)与人胰岛素受体和小鼠胰岛素受体的结合亲和力而获得的结果。
图7示出了通过比较根据IR739浓度的变化，胰岛素和IR739对胰岛素受体的相互作用而获得的结果。
图8示出了通过比较根据胰岛素浓度的变化，胰岛素和IR739对胰岛素受体的相互作用而获得的结果。
图9示出了IR739在小鼠血液中的半衰期。
图10示出了IDS和IDS-HL009在小鼠血液中的半衰期。
图11示出了IR739的脑摄取效率。
图12示出了通过比较IR739的变体(H031、HL009、L113和H118)的脑摄取效率而获得的结果。
图13示出了通过比较融合蛋白的脑摄取效率而获得的结果。
用于实施发明的最佳模式
在本发明的一个方面中，提供了融合蛋白，其包含：第一结构域，其包含与胰岛素受体结合的抗体片段；以及第二结构域，其包含具有艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)活性的蛋白质。
本文中使用的术语“胰岛素受体”是指在细胞上表达并且能够转运胰岛素的跨膜受体蛋白。在此，胰岛素受体可以充当血脑屏障(BBB)受体之一。血脑屏障受体包括胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体(IGF-R)、转铁蛋白受体、低密度脂蛋白(LDL)受体、葡萄糖转运蛋白1(Glut1)、肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)等；并且这些是能够穿过BBB转运分子或可用于转运所施用的外源分子的胞外跨膜受体蛋白。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白可以与人胰岛素受体的胞外结构域(ECD)结合并通过BBB，以使得融合的IDS可被递送至脑。
本文中使用的术语“抗体”是指与某种抗原发生免疫反应的免疫球蛋白(Ig)分子，该分子是发挥充当特异性识别抗原的受体的作用的蛋白质分子。抗体意指涵盖完整抗体及其片段(抗体片段)二者的概念。
本文中使用的术语“艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)”是指溶酶体糖胺聚糖(GAG)分解必不可少的酶。在IDS中发生突变的情况下或者在IDS活性降低或变得无活性的情况下，GAG在大多数组织和细胞中累积，这可引起疾病。在此，IDS可以具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白可以还包含Fc区，并且所述Fc区可以来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区(CH)。另外，Fc区可以是异二聚体；并且异二聚体Fc中的一个可以具有节(knob)结构，并且另一个可以具有孔(hole)结构。节或孔结构可以位于Fc区中的CH3处。
本文中使用的术语“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C端区域，其包含恒定区的一部分。Fc区通常包含抗体重链恒定区的CH2和CH3。另外，Fc区包括野生型Fc区和变体Fc区。
在本发明的一个实施方案中，第一结构域可以是与胰岛素受体结合的抗体的Fab或scFv区。本文中使用的术语“Fab”是指包含轻链的可变区和恒定区以及重链的可变区和CH1区的Fab。本文中使用的术语“scFv”是指包含抗体的重链可变区和轻链可变区，并且可以由“轻链可变区(VL)-接头-重链可变区(VH)”构成的scFv。接头是指具有一定长度的氨基酸序列，其功能是人工地连接重链可变区与轻链可变区。
第一结构域包含CDR，并且这些CDR赋予对某抗原的结合特异性，其中一组CDR(CDR1、CDR2、CDR3)可以提供抗原的结合位点。
在本发明的一个实施方案中，第一结构域可以包含：重链可变区(VH)，其包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的H-CDR1；具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的H-CDR2；以及具有选自SEQ ID NO：5、7和9的氨基酸序列中任一个的H-CDR3；以及轻链可变区(VL)，其包含具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的L-CDR1；具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的L-CDR2；以及具有选自SEQ ID NO：6、8、10和11的氨基酸序列中任一个的L-CDR3。优选地，第一结构域可以包含：重链可变区(VH)，其包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的H-CDR1；具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的H-CDR2；以及具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的H-CDR3；以及轻链可变区(VL)，其包含具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的L-CDR1；具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的L-CDR2；以及具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的L-CDR3。
在本发明的一个实施方案中，通过将第一结构域的C端与Fc区的N端结合而获得的第一单体可以具有：具有选自SEQ ID NO：12、14、16和17的氨基酸序列中任一个的重链；以及具有选自SEQ ID NO：13、15、18和19的氨基酸序列中任一个的轻链。
在本发明的一个实施方案中，第二结构域可以具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列。在本发明的一个实施方案中，融合蛋白可具有其中第二结构域的C端与Fc区的N端结合的结构；并且通过上述结合获得的第二单体可以具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列。
更具体地，第一结构域和Fc区可以通过接头彼此结合。另外，第二结构域和Fc区可以通过接头彼此结合。作为接头，可以使用由通过肽键连接在一起的5至20个氨基酸组成的单链肽接头。氨基酸可以是选自以下的一种或更多种：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。具体地，接头可以由甘氨酸和丝氨酸组成，并且可以是(G4S)n(其中n为1至5)的接头。在本发明的一个实施方案中，接头可以具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白可具有不对称结构，其中第一结构域的C端与二聚体Fc区中任一个的N端结合，并且第二结构域的C端与二聚体Fc区的另一个N端结合。由于融合蛋白具有不对称结构，因此可以防止二价抗体可能偏向降解途径的问题。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。术语“人抗体”是指具有可变区的完整抗体，该可变区的结构和CDR区来源于免疫球蛋白序列；术语“人源化抗体”是指包含最小的来源于非人抗体(例如小鼠抗体)免疫球蛋白的序列的嵌合抗体；并且术语“嵌合抗体”是指来源于不同哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、山羊或人)的组合的抗体。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白可以通过本领域中通常实践的方法来制备，例如，孔中节(knob-in-hole)方法(Ridgway等，Protein Engineering，617-621(1996))、噬菌体抗体文库方法(Clackson等，Nature，352：624-628(1991))、融合方法(Kohler和Milstein，European Journal of Immunology，6：511-519(1976))和重组DNA方法(美国专利号4,816,567)。
在本发明的一个实施方案中，使用噬菌体抗体文库方法和孔中节方法制备IDS融合的融合蛋白(IDS-IR739、IDS-HL009和IDS-H031)。融合蛋白可以与胰岛素受体结合，并通过受体介导的转胞吞作用(receptor mediated transcytosis，RMT)机制通过BBB，以使得IDS融合的融合伴侣位点可以作用于脑中的靶标(图1)。
对于通过RMT机制通过BBB的抗体，其对BBB受体的亲和力非常重要。具体地，在亲和力低于适当水平的情况下，存在其与BBB的结合效率降低的问题。在另一方面，在亲和力高于适当水平的情况下，治疗剂在通过BBB之后释放的速率降低，导致BBB通过效率降低。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白可以不抑制胰岛素与胰岛素受体的结合。
另外，在本发明的一个方面中，提供了用于预防或治疗中枢神经系统(CNS)疾病的药物组合物，其包含融合蛋白作为活性成分。
本文中使用的术语“中枢神经系统(CNS)”是指控制身体功能的神经组织的复合体，并且包括脑和脊髓。中枢神经系统疾病是指影响CNS和/或具有CNS病因学的疾病或病症。疾病的一些具体实例包括溶酶体贮积病(LSD)、亨廷顿病
药物组合物可以还包含可药用载体。对于经口施用，可以使用黏合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、着色剂、矫味剂等。对于注射，可以混合并使用缓冲剂、防腐剂、安抚剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。对于表面施用，可以使用基质、赋形剂、润滑剂、防腐剂等。
可以通过与上述可药用载体混合将药物组合物制备成多种制剂。对于注射，可以将药物组合物制备成单位剂量的安瓿或多种剂型。
另外，药物组合物可以包含能够增强其膜穿透性的表面活性剂。该表面活性剂包括但不限于来源于类固醇、阳离子脂质如N-[1-(2，3-二油酰基)丙基-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)或多种化合物如胆固醇半琥珀酸酯和磷脂酰甘油的那些。
对于药物组合物的施用途径和剂量，可以根据个体的状况以及存在或不存在不良作用来以多种方式和量进行施用，并且最佳的施用方法和剂量可以由本领域技术人员在合适的范围内选择。
具体地，对于肠胃外施用，药物组合物可以通过选自但不限于以下的任一种途径施用：静脉内、肌内、皮内、皮下、腹膜内、小动脉内、室内、病灶内、鞘内和表面施用，及其组合。另外，组合物的日剂量为约0.0001mg/kg至100mg/kg，并且优选0.001mg/kg至10mg/kg；并且剂量优选每天施用一次至多次。然而，剂量可以根据个体的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、施用时间、施用方法、排泄率和疾病严重程度而变化。
当肠胃外施用时，药物组合物可以以多种制剂施用；并且在被制备成制剂的情况下，可以使用常用的稀释剂或赋形剂，例如填充剂、增量剂、黏合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂来制备药物组合物。用于肠胃外施用的制剂可包括无菌水溶液剂、非水溶液剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。另外，对于非水溶液剂或混悬剂，可以使用植物油，例如丙二醇、聚乙二醇和橄榄油，可注射酯，例如油酸乙酯等。对于栓剂的基质，可以使用Witepsol、Macrogol、Tween 61、可可脂、月桂酸脂
本文中使用的术语“个体”是指患有可通过施用药物组合物来减轻、抑制或治疗的病症或疾病或者处于发生该病症或疾病的风险中的哺乳动物，优选人。
本文中使用的术语“预防”是指使用药物组合物阻断疾病或者抑制或延迟疾病症状的任何行为。
本文中使用的术语“治疗”是指使用药物组合物来改善或有益地改变疾病的任何行为。
另外，在本发明的一个方面中，提供了用于制备融合蛋白的方法，其包括以下步骤：使与胰岛素受体结合的抗体与Fc区结合以制备第一单体；使艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)与异二聚体Fc区结合以制备第二单体；以及将第一单体与第二单体混合。
在本发明的一个实施方案中，Fc区可来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区(CH)。
在本发明的一个实施方案中，抗体可以包含：重链可变区(VH)，其包含具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列的H-CDR1；具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的H-CDR2；以及具有选自SEQID NO：5、7和9的氨基酸序列中任一个的H-CDR3；以及轻链可变区(VL)，其包含具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列的L-CDR1；具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的L-CDR2；以及具有选自SEQID NO：6、8、10和11的氨基酸序列中任一个的L-CDR3。具体地，抗体片段可以包含：重链可变区(VH)，其包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的H-CDR1；具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的H-CDR2；以及具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的H-CDR3；以及轻链可变区(VL)，其包含具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的L-CDR1；具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的L-CDR2；以及具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的L-CDR3。
在本发明的一个实施方案中，在第一单体的Fc区中的CH3具有节结构的情况下，第二单体中的CH3可以具有孔结构；或者在第一单体的Fc区中的CH3具有孔结构的情况下，第二单体中的CH3可以具有节结构。
在本发明的一个实施方案中，IDS可以具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，第一单体可以包含具有选自SEQ ID NO：12、14、16和17的氨基酸序列中任一个的重链和具有选自SEQ ID NO：13、15、18和19的氨基酸序列中任一个的轻链；并且第二单体可以具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列。
更具体地，根据本发明的融合蛋白IDS-IR739可以包含：第一单体，其包含具有SEQID NO：12或16的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链；以及第二单体，其具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列。
根据本发明的融合蛋白IDS-HL009可以包含：第一单体，其包含具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链；以及第二单体，其具有SEQID NO：20的氨基酸序列。
根据本发明的融合蛋白IDS-H031可以包含：第一单体，其包含具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链；以及第二单体，其具有SEQID NO：20的氨基酸序列。
根据本发明的融合蛋白IDS-H118可以包含：第一单体，其包含具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链；以及第二单体，其具有SEQID NO：20的氨基酸序列。
根据本发明的融合蛋白IDS-L016可以包含：第一单体，其包含具有SEQ ID NO：12或16的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链；以及第二单体，其具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列。
根据本发明的融合蛋白IDS-L113可以包含：第一单体，其包含具有SEQ ID NO：12或16的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的轻链；以及第二单体，其具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列。
本发明提供了所述融合蛋白用于预防或治疗中枢神经系统疾病的用途。
另外，本发明提供了所述融合蛋白用于制造用于预防或治疗中枢神经系统疾病的药物的用途。
另外，本发明提供了用于预防或治疗中枢神经系统疾病的方法和/或用于增强治疗效果的方法，所述方法包括向个体施用所述融合蛋白或包含所述融合蛋白的药物组合物的步骤。
个体可以是患有中枢神经系统疾病的个体。另外，个体可以是哺乳动物，并且优选人。
对于融合蛋白或药物组合物的施用途径、剂量和施用频率，向对象的施用可以根据对象的状况以及存在或不存在不良作用来以多种方式和量进行，并且最佳的施用方法、剂量和施用频率可以由本领域技术人员在合适的范围内选择。另外，融合蛋白或药物组合物可以与对于待治疗的疾病，其治疗效果已知的其他药物或生理活性物质组合施用，或者可以配制成与其他药物的组合制剂的形式。
发明模式
在下文中，将通过以下实施例更详细地描述本发明。然而，以下实施例仅出于举例说明性的目的，并且本发明的范围不限于此。
使用人合成scFv文库(MIDAS，MOGAM)制备抗IR抗体。将MIDAS的噬菌体文库置于用5μg/ml浓度的人IR包被的管中，并在37℃下进行处理2小时。用添加了0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗涤4次。然后，在室温下用1％BSA/0.1M甘氨酸(pH 2.0)缓冲液进行处理10分钟，以洗脱与IR结合的噬菌体。将洗脱的噬菌体用70μl 2M Tris-HCl(pH 9.0)中和，并用于感染9ml预先培养的大肠杆菌(E.coli)(XL1-Blue)30分钟。向噬菌体感染的XL1-Blue添加超级肉汤(super broth，SB)培养基、四环素和羧苄青霉素，并在37℃下进行培养1小时。然后，向其中添加辅助噬菌体。再进行培养一小时。向其中添加培养基至100ml，并在37℃下进行培养过夜。
通过离心收获培养基，并用20％PEG溶液使噬菌体沉淀。在离心之后，用添加了1％BSA的PBS溶液收集噬菌体。使用其中收集有噬菌体的溶液，用小鼠IR包被的管和人IR包被的管交替地重复平移(panning)过程直至第四次。培养每个被三级噬菌体和四级噬菌体感染的XL1-Blue菌落，以获得各自含有噬菌体的培养液。使用培养液和IR包被的板，通过ELISA选择同时与人IR和小鼠IR结合的表达噬菌体的XL1-Blue克隆。对所选克隆的质粒进行测序以获得VH和VL序列。基于这些序列，制备了具有常规IgG形式的抗体。
通过以下实验例1中的交叉反应性评估，在通过筛选MIDAS人scFv文库获得的抗体中，选择了IR739，其为与人IR、猴IR和小鼠IR均结合的抗体。如上所述制备的IR739的蛋白质序列示于下表1中。
[表1]
使用随机诱变，将突变引入到LCDR3中的Asn-Asn序列和HCDR3中的Ser-Tyr-Gly-Thr-Val-Asn-His序列中(图2)。为了引入突变，使用通过将相应序列的密码子替换为NNK简并密码子(N＝A、T、G或C，并且K＝G或T)而获得的引物对IR739的基因进行PCR，以制备突变体scFv DNA片段。将连接有每种突变体scFv DNA片段的1μg pCIw载体(Promega)通过电穿孔转化到100μl XL1-Blue中。然后，将所得物置于10ml的超级肉汤(SB)培养基中，并在37℃下进行培养1小时。
向其中添加10ml的辅助噬菌体，并在37℃下进行培养1小时。然后，再向其中添加补充有四环素和羧苄青霉素的80ml培养基，并且进行培养过夜。通过离心收获引入了突变的XL1-Blue的培养液，并用20％PEG溶液使噬菌体沉淀。在离心之后，在室温下用1％BSA/0.1M甘氨酸(pH 2.0)缓冲液进行培养10分钟，以洗脱与IR结合的噬菌体。将洗脱的噬菌体用70μl 2M Tris-HCl(pH 9.0)中和，并用于感染9ml预先培养的大肠杆菌(XL1-Blue)30分钟。向噬菌体感染的XL1-Blue添加超级肉汤(SB)培养基、四环素和羧苄青霉素，并在37℃下进行培养1小时。然后，向其中添加辅助噬菌体。再进行培养一小时。向其中添加培养基至100ml，并在37℃下进行培养过夜。
通过离心收获培养基，并用20％PEG溶液使噬菌体沉淀。在离心之后，用添加了1％BSA的PBS溶液收集噬菌体。使用其中收集有噬菌体的溶液，用小鼠IR包被的管和人IR包被的管交替地重复平移过程直至第四次。培养每个被三级噬菌体和四级噬菌体感染的XL1-Blue菌落，以获得各自含有噬菌体的培养液。使用培养液和IR包被的板，通过ELISA选择具有比IR739更高或更小吸光度的克隆。对所选克隆进行测序以选择独特的序列(图3)，并进行克隆以制备H031、H118、HL009、L016和L113，其为具有常规IgG形式的变体。
为了制备其中一个Fab被替换为IDS的各IDS融合抗体(IDS-IR739、IDS-H031、IDS-HL009和IDS-8D3)，在免疫球蛋白的重链中引入了孔中节。在其中引入了节的重链中，Lys409被替换为Trp409；并且在其中引入了孔的重链中，Asp399和Phe405分别被替换为Val399和Thr405。通过克隆，IR739、HL009和8D3中的VH被替换为其中引入了孔的重链的VH，并且IDS的C端与其中引入了节的重链的CH2的N端融合。使用针对转铁蛋白受体的抗体8D3作为对照。
将表达轻链和其中引入了孔的重链的质粒以及表达其中引入了结并与IDS融合的CH2-CH3的质粒共转染到CHO细胞中。在37℃下进行培养10天。通过离心分离培养液。然后，用蛋白A柱纯化IDS-IR739、IDS-HL009、IDS-H031和IDS-8D3。使用1M L-精氨酸溶液(pH 4)从蛋白A柱上洗脱IDS融合抗体。如上所述制备的不对称融合抗体的结构在图1(左)中示出。
收获在其中人IR、猴IR和小鼠IR各自过表达的各Expi-293细胞，并以5×10
通过表面等离子共振(SPR)分析IR739与IR的结合亲和力。将1μg/ml的人IR或小鼠IR用乙酸盐(pH 4.0)固定在CM5传感器芯片上。使IR739以100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM或1.563nM的浓度流过固定有人IR或小鼠IR的CM5传感器芯片，同时测量其缔合和解离。对于测量条件，流量设置为30μl/分钟，并且缔合时间和解离时间分别设置为120秒和600秒。为了再生，使10mM甘氨酸-HCl(pH 1.5)流动30秒。IR739与人IR和小鼠IR的结合亲和力的结果示于下表2中。
[表2]
进行ELISA以比较IR739及其变体与IR的结合亲和力。将用5μg/ml浓度的IR包被的ELISA板用3％脱脂乳封闭1小时，并随后用多种浓度的IR739及其变体处理各孔。在37℃下进行处理1小时，并随后用0.05％Tween 20/PBS溶液进行洗涤3次。为了检测IR739及其变体，用过氧化物酶缀合的抗人Fc IgG进行处理，并在37℃下进行孵育1小时。然后，用0.05％Tween 20/PBS溶液进行洗涤3次。用四甲基联苯胺(TMB)ELISA溶液进行显色，并分析450nm处的吸光度。结果，H031和HL009对人IR和小鼠IR的结合亲和力比IR739高，并且L016和H118对人IR和小鼠IR的结合亲和力比IR739低。L113表现出与IR739相似的结合亲和力(图5)。
进行ELISA以鉴定IDS-HL009与IR的结合亲和力。将用5μg/ml浓度的IR包被的ELISA板用3％脱脂乳封闭1小时，并随后用多种浓度的IR739、IDS-IR739、IDS-HL009或IDS-H031处理各孔。在37℃下进行处理1小时，并随后用0.05％Tween 20/PBS溶液进行洗涤3次。为了检测IR-739、IDS-IR739、IDS-HL009和IDS-H031，用过氧化物酶缀合的抗人Fc IgG进行处理，并在37℃下进行孵育1小时。然后，用0.05％Tween20/PBS溶液进行洗涤3次。用TMBELISA溶液进行显色，并分析450nm处的吸光度。结果，IDS-IR739、IDS-H031和IDS-HL009对人IR和小鼠IR的结合亲和力比IR739低，因为在这样的抗体中，通过将一个Fab替换为IDS消除了亲合力作用(图6)。
为了鉴定IR739和胰岛素对IR的相互作用，进行了竞争性ELISA。将用5μg/ml浓度的IR包被的ELISA板用3％脱脂乳封闭1小时。然后，向各孔添加多种浓度的IR739与生物素化胰岛素的混合物。在37℃下进行孵育1小时，并随后用0.05％Tween 20/PBS溶液进行洗涤3次。用过氧化物酶缀合的抗人Fc IgG进行处理以检测IR739，并用过氧化物酶缀合的链霉亲和素进行处理以检测生物素化的胰岛素。
在37℃下进行孵育1小时。然后，用0.05％Tween 20/PBS溶液进行洗涤3次，并用TMB ELISA溶液进行显色。分析450nm处的吸光度。结果，IR739与IR的结合模式不受胰岛素浓度变化的影响。具体地，当胰岛素浓度从0.6nM变至150nM时，对于各浓度的IR739，在结合曲线中未观察到变化(图7)。此外，胰岛素与IR的结合模式也不受IR739浓度变化的影响；并且具体地，当IR739浓度从0.03nM变至7nM时，对于各胰岛素浓度，在结合曲线中未观察到变化(图8)。
为了分析IR739在小鼠血液中的稳定性，将5mg/kg的IR739或作为对照的8D3抗体(抗TfR抗体)施用于每只小鼠的尾静脉。施用之后，分别在30分钟、1小时、2小时、6小时和24小时时通过眼出血(eye-bleeding)收集50μl血液。将血液离心，并通过ELISA分析上清液中的抗体浓度。对于ELISA，将ELISA板用1μg/ml的抗人Fab IgG包被，用3％脱脂乳封闭，并随后用50μl的1/10稀释的上清液进行处理。在37℃下进行孵育1小时，并随后用0.05％Tween20/PBS溶液进行洗涤3次。用过氧化物酶缀合的抗人Fc IgG进行处理。在37℃下进行处理1小时。然后，用0.05％Tween 20/PBS溶液进行洗涤3次，并用TMB ELISA溶液进行检测。使用通过用10,000ng/ml至4.5ng/ml(10,000ng/ml、3,333ng/ml、1,111ng/ml、370ng/ml、123ng/ml、41.2ng/ml、13.7ng/ml、4.5ng/ml)的IR739以与上文相同的方式进行ELISA而获得的结果作为标准计算浓度。确定了IR739的半衰期为约24小时(图9)。
为了分析IDS-HL009在小鼠血液中的稳定性，将5mg/kg的IDS、IR739、IDS-HL009或IDS-8D3施用于每只小鼠的尾静脉。施用之后，分别在30分钟、1小时、2小时、6小时和24小时时通过眼出血收集50μl血液。将血液离心，并通过ELISA分析上清液中的抗体浓度。对于ELISA，将ELISA板用1μg/ml的抗人Fab IgG包被，用3％脱脂乳封闭，并随后用50μl的1/10稀释的上清液进行处理。
在37℃下进行孵育1小时，并随后用0.05％Tween 20/PBS溶液进行洗涤3次。用过氧化物酶缀合的抗人Fc IgG进行处理。在37℃下进行处理1小时。然后，用0.05％Tween 20/PBS溶液进行洗涤3次，并用TMB ELISA溶液进行检测。使用通过用10,000ng/ml至4.5ng/ml(10,000ng/ml、3,333ng/ml、1,111ng/ml、370ng/ml、123ng/ml、41.2ng/ml、13.7ng/ml、4.5ng/ml)的IR739、IDS-HL009和IDS-8D3以与上文相同的方式进行ELISA而获得的结果作为标准计算浓度。为了测量IDS浓度，使用生物素缀合的抗IDS和HRP缀合的链霉亲和素在包被有抗IDS IgG的ELISA板上进行ELISA。确定了IDS-HL009的半衰期为约14小时(图10)。
为了分析IR739的脑摄取效率，将5mg/kg的阴性对照IgG(抗间皮素(MSLN)IgG)、8D3或IR739注射到每只小鼠的尾静脉中。在此，抗间皮素IgG用作阴性对照，并且8D3用作阳性对照。在1小时和24小时之后，对于每种物质，对3只小鼠中的每只进行灌注，并随后从其中移出脑。每100mg脑添加1ml裂解缓冲液，并进行粉碎。然后，以13,000rpm进行离心。将ELISA板用1μg/ml的抗人Fab IgG包被，用3％脱脂乳封闭，并随后用50μl上清液处理。在37℃下进行孵育1小时，并随后用0.05％Tween 20/PBS溶液进行洗涤3次。用过氧化物酶缀合的抗人Fc IgG进行处理。在37℃下进行孵育1小时。然后，用0.05％Tween 20/PBS溶液进行洗涤3次，并用TMB ELISA溶液进行检测。使用通过用1,000ng/ml至0.45ng/ml(1,000ng/ml、333ng/ml、111ng/ml、37.0ng/ml、12.3ng/ml、4.12ng/ml、1.37ng/ml、0.45ng/ml)的抗MSLNIgG、8D3和IR739以与上文相同的方式进行ELISA而获得的结果作为标准计算浓度。IR739表现出比8D3低的脑摄取效率，同时表现出比抗MSLN IgG高的脑摄取效率(图11)。
为了分析IR739变体的脑摄取效率，将5mg/kg的抗-MSLN IgG、8D3、IR739、H031、HL009、L113或H118注射到每只小鼠的尾静脉中。在1小时和24小时之后，对于每种物质，对3只小鼠中的每只进行灌注，并随后从其中移出脑。每100mg脑添加1ml裂解缓冲液，并进行粉碎。然后，以13,000rpm进行离心。将ELISA板用1μg/ml的抗人Fab IgG包被，用3％脱脂乳封闭，并随后用50μl上清液处理。在37℃下进行孵育1小时，并随后用0.05％Tween 20/PBS溶液进行洗涤3次。用过氧化物酶缀合的抗人Fc IgG进行处理。在37℃下进行孵育1小时。然后，用0.05％Tween 20/PBS溶液进行洗涤3次，并用TMB ELISA溶液进行检测。使用通过用1,000ng/ml至0.45ng/ml(1,000ng/ml、333ng/ml、111ng/ml、37.0ng/ml、12.3ng/ml、4.12ng/ml、1.37ng/ml、0.45ng/ml)的抗MSLN IgG、8D3、IR739、H031、HL009、L113和H118以与上文相同的方式进行ELISA而获得的结果作为标准计算浓度。分析的结果是，在变体中，HL009表现出比IR739高的脑摄取效率，而H031、L113和H118表现出比IR739低的脑摄取效率(图12)。
为了分析IDS-HL009的脑摄取效率，将5mg/kg的IDS-HL009注射到每只小鼠的尾静脉中。在1小时和24小时之后，对于每种物质，对3只小鼠中的每只进行灌注，并随后从其中移出脑。每100mg脑添加1ml裂解缓冲液，并进行粉碎。然后，以13,000rpm进行离心。将ELISA板用1μg/ml的抗人Fab IgG包被，用3％脱脂乳封闭，并随后用50μl上清液处理。在37℃下进行孵育1小时，并随后用0.05％Tween 20/PBS溶液进行洗涤3次。用过氧化物酶缀合的抗人Fc IgG进行处理。在37℃下进行孵育1小时。然后，用0.05％Tween 20/PBS溶液进行洗涤3次，并用TMB ELISA溶液进行检测。使用通过用1,000ng/ml至0.45ng/ml(1,000ng/ml、333ng/ml、111ng/ml、37.0ng/ml、12.3ng/ml、4.12ng/ml、1.37ng/ml、0.45ng/ml)的IDS-HL009以与上文相同的方式进行ELISA而获得的结果作为标准计算浓度。IDS-HL009表现出比IDS、IDS-IR739和IDS-H031高的脑摄取效率(图13)。
为了分析IDS和IDS-HL009的特性，将10ng/ml IDS或10μl的IDS-HL009和20μl的100mM 4-甲基伞形酮基α-L-吡喃艾杜糖醛酸-2-硫酸盐/酯(4MU-α-IdopyraA-2)置于96孔板(黑色)中，并在37℃下进行孵育4小时。通过添加20μl的Pi/Ci溶液(pH 4.5)来终止反应，并向其中添加10μl的25μg/ml重组人α-L-艾杜糖醛酸酶(iduronidase)。在37℃下进行孵育24小时。然后，向其中添加200μl的0.25M碳酸钠/碳酸氢钠(pH 10.0)并测量荧光(吸收：355nm/发射：460nm)。使用4-甲基伞形酮作为标准物分析活性，并且结果示于下表3中。
[表3]
如表3中所示，IDS-HL009的IDS活性基于蛋白质的μg数表明IDS∶IDS-HL009＝51.4∶13.0nmol/分钟，并且基于蛋白质的摩尔数表明IDS∶IDS-HL009＝3,084∶2,105nmol/分钟。从以上结果可以确定，基于蛋白质摩尔数，IDS-HL009相对于IDS具有约70％的IDS活性。
<110> MOGAM INSTITUTE FOR BIOMEDICAL RESEARCH
<120> 包含IDS的融合蛋白及其用途
<130> PCB909076MOG
<150> KR 2018/0129201
<151> 2018-10-26
<160> 22
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的H-CDR1
<400> 1
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的L-CDR1
<400> 2
Gly Ala Ser Arg Asp Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的H-CDR2
<400> 3
Ala Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的L-CDR2
<400> 4
Asp Ala Asn Ile Leu Gln Ser
1 5
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的H-CDR3
<400> 5
His Pro Ser Tyr Gly Thr Val Asn His Ala Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的L-CDR3
<400> 6
Leu Glu Tyr Asn Asn Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的H-CDR3
<400> 7
His Pro Arg Tyr Gly Thr Val Asn His Ala Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的L-CDR3
<400> 8
Leu Glu Tyr Pro Asn Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的H-CDR3
<400> 9
His Pro Thr Tyr Gly Thr Val Asn His Ala Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的L-CDR3
<400> 10
Leu Glu Tyr Asn Val Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的L-CDR3
<400> 11
Leu Glu Tyr Asn Ser Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 12
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的重链
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Pro Ser Tyr Gly Thr Val Asn His Ala Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly
450
<210> 13
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的轻链
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Arg Asp Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Asn Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Tyr Asn Asn Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 14
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的重链
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Pro Arg Tyr Gly Thr Val Asn His Ala Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Arg Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Val Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly
450
<210> 15
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的轻链
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Arg Asp Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Asn Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Tyr Pro Asn Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 16
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的重链
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Pro Ser Tyr Gly Thr Val Asn His Ala Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Arg Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Val Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly
450
<210> 17
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的重链
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Pro Thr Tyr Gly Thr Val Asn His Ala Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Arg Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Val Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly
450
<210> 18
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的轻链
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Arg Asp Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Asn Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Tyr Asn Val Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 19
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的轻链
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Arg Asp Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Asn Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Tyr Asn Ser Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 20
<211> 776
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的IDS-Fc区
<400> 20
Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys
20 25 30
Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu
35 40 45
Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val
50 55 60
Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe
65 70 75 80
Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln
85 90 95
Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe
100 105 110
His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp
115 120 125
Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys
130 135 140
Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro
145 150 155 160
Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser
165 170 175
Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser
180 185 190
Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg
195 200 205
Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu
210 215 220
Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn
225 230 235 240
Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile
245 250 255
Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg
260 265 270
Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg
275 280 285
Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile
290 295 300
Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp
305 310 315 320
Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe
325 330 335
Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu
340 345 350
Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro
355 360 365
Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr
370 375 380
Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro
385 390 395 400
Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His
405 410 415
Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro
420 425 430
Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro
435 440 445
Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly
450 455 460
Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe
465 470 475 480
Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu
485 490 495
Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn
500 505 510
Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro Gly Gly Gly
515 520 525
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
530 535 540
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
545 550 555 560
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
565 570 575
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
580 585 590
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
595 600 605
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
610 615 620
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
625 630 635 640
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
645 650 655
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
660 665 670
Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
675 680 685
Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
690 695 700
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
705 710 715 720
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
725 730 735
Tyr Ser Trp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
740 745 750
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
755 760 765
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
770 775
<210> 21
<211> 525
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IDS
<400> 21
Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys
20 25 30
Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu
35 40 45
Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val
50 55 60
Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe
65 70 75 80
Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln
85 90 95
Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe
100 105 110
His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp
115 120 125
Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys
130 135 140
Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro
145 150 155 160
Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser
165 170 175
Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser
180 185 190
Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg
195 200 205
Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu
210 215 220
Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn
225 230 235 240
Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile
245 250 255
Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg
260 265 270
Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg
275 280 285
Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile
290 295 300
Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp
305 310 315 320
Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe
325 330 335
Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu
340 345 350
Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro
355 360 365
Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr
370 375 380
Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro
385 390 395 400
Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His
405 410 415
Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro
420 425 430
Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro
435 440 445
Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly
450 455 460
Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe
465 470 475 480
Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu
485 490 495
Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn
500 505 510
Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro
515 520 525
<210> 22
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
- 包含IDS的融合蛋白及其用途
- 包含IL-15/IL-15Ra Fc融合蛋白和PD-1抗原结合结构域的靶向PD-1的异源二聚体融合蛋白及其用途