工程化调节性T细胞

技术领域

本发明涉及工程化调节性T细胞以及这种细胞的治疗用途。特别地，本发明涉及对具有有限的IL-2可用性的微环境不太敏感的工程化调节性T细胞。

背景技术

调节性T细胞(Treg)是具有抑制功能的免疫细胞，其控制细胞病变免疫反应并且对维持免疫耐受至关重要。Treg的抑制特性可以用于治疗，例如以改善和/或预防炎症性疾病、自身免疫性疾病和移植中的免疫介导的器官损伤。Treg免疫疗法通常涉及Treg的分离、培养和扩增，然后输入患者体内。作为该过程的一部分，Treg可以与细胞因子、药物、其他细胞或抗原孵育，以提高Treg的生存能力和功能和/或赋予Treg针对特定抗原的增强的反应性。这些相同的目的可以通过基因工程Treg以靶向预定的抗原来实现，例如通过嵌合抗原受体(CAR)来实现。

生长因子白细胞介素-2(IL-2)对Treg的体内平衡(产生、增殖、存活)以及它们的抑制功能和表型稳定性至关重要。活化的常规T细胞(Tcon)是体内IL-2的主要来源。相比之下，Treg不能产生IL-2，并且依赖旁分泌获得微环境中存在的Tcon所产生的IL-2。

IL-2的可用性对体外扩增并转移到患者体内的Treg的治疗效果具有重要影响。这是由于以下原因造成：1)体外扩增方案通常需要高浓度的IL-2，这使得Treg高度依赖于这种细胞因子；2)由于免疫抑制药物的施用，患者体内的IL-2浓度通常会降低；以及3)在发炎的组织微环境中，获得IL-2通常是有限的。肝移植构成了一个特别具有挑战性的适应症，因为已知发炎的肝脏中的IL-2的水平会降低，而钙调神经磷酸酶抑制剂的常规使用会进一步加剧这种情况，因为钙调神经磷酸酶抑制剂会显著降低Tcon产生IL-2的能力。低剂量外源性IL-2的施用恢复由钙调神经磷酸酶抑制剂诱导的Treg功能障碍，并且促进Treg在肝脏中的积累。然而，低剂量Treg的治疗用途的一个问题是存在同时活化Tcon的风险，这可能会增强组织损伤。

WO 2017/218850描述了组成型表达STAT5的工程Treg，以便提供有效的IL-2信号。然而，使用这种方法可以预测几个挑战。组成型STAT5表达提供了下述风险，即，工程化Treg可能发挥非特异性的强大免疫抑制作用，并且由于工程化Treg的高增殖率，工程化Treg可能使内源性Treg库过度生长并降低其TCR库，这可能导致自身免疫。最后，考虑到已知STAT5的突变会促进T细胞幼淋巴细胞白血病，并且STAT5在许多癌症中是组成型活化的，这些工程化Treg可能会带来转化的风险。

因此，仍然需要用于生产对具有有限的IL-2可用性的微环境不太敏感的工程化Treg的方法，以及提高工程化Treg在已施用免疫抑制药物的受试者体内增殖和存活的有效性的方法。

发明内容

本发明人已经开发了一种工程化调节性T细胞(Treg)，其能够在Treg与预定抗原结合后提供有效的IL-2信号。因此，本发明的工程化Treg解决了与过继转移Treg的高IL-2依赖性相关的问题，而不需要施用外源性IL-2而是通过以抗原特异性方式提供有效的IL-2信号。

因此，第一方面，本发明提供一种用于诱导对移植物的耐受性、治疗和/或预防移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性或过敏性疾病、促进组织修复和/或组织再生或者改善继发于代谢紊乱的慢性炎症的包含嵌合抗原受体(CAR)的工程化Treg，其中，所述CAR包含胞内域，所述胞内域包含STAT5缔合基序和JAK1结合基序和/或JAK2结合基序。

另一方面，本发明提供一种用于诱导对移植物的耐受性、治疗和/或预防GvHD、自身免疫性或过敏性疾病、促进组织修复和/或组织再生或者改善继发于代谢紊乱的慢性炎症的药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明的第一方面的工程化Treg。

本发明还涉及一种诱导对移植物的耐受性、治疗和/或预防GvHD、自身免疫性或过敏性疾病、促进组织修复和/或组织再生或者改善继发于代谢紊乱的慢性炎症的方法，所述方法包括向受试者施用根据本发明的工程化Treg或药物组合物的步骤。

本发明还提供根据本发明的工程化Treg在制备用于诱导对移植物的耐受性、治疗和/或预防细胞和/或体液移植排斥、治疗和/或预防GvHD、自身免疫性或过敏性疾病、或者促进组织修复和/或组织再生或者改善继发于代谢紊乱的慢性炎症的药物中的用途。

合适地，所述受试者可以是移植受体，并且本发明涉及诱导对移植物(例如移植的器官)的耐受性。特别地，所述受试者可以是经受免疫抑制疗法的移植受体。

另一方面，本发明提供一种包含胞内域的CAR，所述胞内域包含STAT5缔合基序和JAK1结合基序和/或JAK2结合基序，但不包含STAT3缔合基序。

合适地，CAR胞内域不包含氨基酸序列YXXQ(SEQ ID NO:52)。合适地，所述CAR胞内域的IL2Rβ部分不包含氨基酸序列YXXQ(SEQ ID NO:52)。

另一方面，本发明提供一种包含胞内域的CAR，所述胞内域包含STAT5缔合基序、JAK1结合基序和/或JAK2结合基序以及JAK3结合基序。

本发明进一步提供编码本发明的CAR的多核苷酸和编码本发明的CAR的载体。

另一方面，本发明提供一种包含本发明的CAR的工程化Foxp3+Treg，并且所述包含本发明的CAR的工程化Foxp3+Treg用于治疗。

因此，本发明提供包含CAR的工程化Treg，该CAR仅在CAR与其同源抗原结合后才向Treg提供STAT5介导的促生存信号。特别地，在抗原识别后，本发明的CAR聚集，并且信号通过CAR的胞内信号传导域(胞内域)传递至工程化Treg。由于本发明的CAR包含胞内域，所述胞内域包含STAT5缔合基序和JAK1结合基序和/或JAK2结合基序，所以本发明的CAR的聚集导致STAT5和JAK1和/或JAK2的募集和活化；从而提供以抗原特异性方式增强工程化Treg的功能和存活的信号，而不依赖于微环境中IL-2的可用性。

与受试者的普通T细胞群相比，本发明的工程化Treg在抗原识别后为工程化CAR-Treg提供存活优势方面可能特别有效。特别地，在例如其中免疫抑制药物的使用降低了IL-2的可用性的移植的情况下，本发明的CAR-Treg的STAT5信号传导在不利的微环境中对本发明的细胞提供了额外的存活和功能作用。

附图说明

图1-示出了本发明的CAR构建体的图

图2-抗HLA.A2 IL2R CAR构建体的示例性设计

包括IL2R胞内域的不同组合的示例性抗HLA.A2 CAR构建体的示意图。(A)dCAR构建体：HLA.A2 scFv抗原识别域、CD28铰链域、CD28 TM以及eGFP。(B)CD28z构建体：HLA.A2scFv抗原识别域、CD28铰链域、CD28 TM、CD28信号传导域、CD3z信号传导域以及eGFP。(C)IL2R构建体1：HLA.A2 scFv抗原识别域、CD28铰链域、CD28 TM、CD28信号传导域、截短型IL2RB胞内域、CD3z信号传导域以及eGFP。(D)IL2R构建体1：HLA.A2 scFv抗原识别域、CD28铰链域、CD28 TM、CD28信号传导域、截短型IL2RG、截短型IL2RB胞内域、CD3z信号传导域以及eGFP。(E)IL2R构建体1：HLA.A2 scFv抗原识别域、CD28铰链域、CD28 TM、CD28信号传导域、截短型IL2RB胞内域、CD3z信号传导域、FP2A切割域以及eGFP。

图3–抗HLA.A2 IL2R CAR-Treg的产生

示意图示出了抗HLA.A2 IL2R CAR-Treg的产生和扩增。(A)分离出分离的CD4

图4–抗HLA.A2 IL2R构建体的转导效率随时间的定量

在细胞活化后的不同时间点，分析未转导的Treg和用CAR构建体转导的Treg的GFP表达。(A)转导后7天来自HLA-A2 IL2R CAR Treg的GFP表达的代表性等高线图。(B)转导后7天活CD4+细胞中GFP

图5–抗HLA.A2 IL2R CAR构建体在转导的Treg上的细胞表面表达的定量

通过PE缀合的HLA-A*0201/CINGVCWTV右旋体(dextramer)(Immudex，哥本哈根，丹麦)分析了未转导的和转导的Treg上的CAR构建体的膜表达。(A)转导后7天GFP+右旋体+CARTreg的代表性等高线图。(B)转导后的第7天GFP+Treg中的右旋体+细胞的定量。

图6-多克隆细胞扩增后CAR Treg的表型表征

在抗CD3/CD28激活珠和IL-2的存在下培养并扩增Treg15天。在培养的第15天，通过FACS对未转导的和转导的Treg上的Treg相关标志物FOXP3、HELIOS、CTLA4和TIGIT进行分析，以评估表型谱系的稳定性。

图7-抗HLA.A2 IL2R CAR Treg的抗原特异性评估

在不同刺激的存在下培养未转导的和转导的Treg18小时。分析CD69和CD137激活标志物以评估特异性和非特异性细胞活化。(A)代表性等高线图示出了CD69响应于HLA.A1或HLA.A2分子转导的K562细胞培养的表达。GFP信号用于选择转导的Treg。(B)在仅使用培养基(未刺激)、抗CD3/CD28珠(非特异性刺激)、K562-HLA.A1和K562-HLA.A2细胞培养18小时后，对Treg上的CD69和CD137表达进行定量。(C)代表性直方图示出了在用HLA.A1和HLA.A2 B细胞系培养18小时后Treg上的CD69表达。使用了不同的细胞与细胞比。

图8-STAT5磷酸化分析作为IL2R CAR信号传导的指标

将转导的CAR Treg在不含IL2的培养基中静置过夜。用单独的培养基、1000IU/ml的IL-2或存在基于HLA.A2-Ig的人工APC(按照DOI：10.3791/2801中描述的方案生成)的存在下培养10分钟和120分钟后，通过FACS分析评估Treg的STAT5磷酸化。(A)等高线图示出了在用单独的培养基、1:1比例的HLA.A2珠和1000IU/ml的IL-2培养10分钟后，GFP和磷酸化STAT5在转导的CAR-Treg上的表达。(B)直方图示出了用1:1比例的HLA.A2珠或仅使用培养基(未刺激)培养120分钟的Treg的STAT5的磷酸化。

图9-在没有IL-2的情况下非特异性和HLA.A2特异性活化后Treg存活的评估

不存在IL-2的情况下，用抗CD3/28激活珠和K562.A2表达细胞培养具有不同构建体的CAR转导的Treg。活化后7天通过FACS分析评估细胞存活。(A)CAR-Treg的代表性直方图示出了在没有IL-2的情况下激活后第7天基于活力染料染色的GFP+细胞的细胞存活。(B)不存在IL-2的情况下，用抗CD3/28珠和K562-HLA.A2细胞培养7天后，GFP+Treg上的活细胞百分比(*p<0.05，采用Tukey事后校正的ANOVA分析)。

图10-Treg抑制能力测试：通过分析B细胞上的共刺激分子的调节来评估Treg的免疫调节功能

分析与Treg共培养后CD80和CD86的B细胞表达，以评估Treg减少抗原呈递细胞上共刺激分子表达的能力。将固定数量的活的A2表达B细胞(20K/孔)与滴定数量的Treg产物(A2阴性供体)(200、100、50、25、12.5K)共培养过夜。B细胞上CD86和CD80共刺激标志物的FACS分析。

具体实施方式

工程化调节性T细胞(TREG)

如本文所用的“工程化细胞”是指已被修饰以包含或表达下述多核苷酸的细胞，所述多核苷酸不是由所述细胞天然编码。用于改造细胞的方法在本领域中是已知的，包括但不限于细胞的遗传修饰，例如通过诸如逆转录病毒或慢病毒转导之类的转导、转染(如瞬时转染-基于DNA或RNA)包括脂质转染、聚乙二醇、磷酸钙和电穿孔。可以使用任何合适的方法将核酸序列引入细胞。根据本发明，可以使用诸如两亲性细胞穿透肽之类的非病毒技术来引入核酸。

因此，如本文所述的编码CAR的多核苷酸不是由相应的未修饰的细胞天然表达的。合适地，工程化细胞是已经例如通过转导或转染而被修饰的细胞。合适地，工程化细胞是已经例如通过转导或转染被修饰的细胞或其基因组已经例如通过转导或转染被修饰的细胞。合适地，工程化细胞是已被逆转录病毒转导修饰的细胞或其基因组已被逆转录病毒转导修饰的细胞。合适地，工程化细胞是已经被慢病毒转导修饰的细胞或其基因组已经被慢病毒转导修饰的细胞。

如本文所用，术语“引入”是指用于将外源DNA或RNA插入细胞中的方法。如本文所用，术语引入包括转导和转染方法。转染是通过非病毒方法将核酸引入细胞的过程。转导是通过病毒载体将外源DNA或RNA引入细胞的过程。可以通过多种方式之一来引入编码本文所述的CAR的DNA或RNA来产生根据本发明的工程化细胞，所述多种方式包括用病毒载体转导、用DNA或RNA转染。可以在引入编码本文所述的CAR的多核苷酸之前或之后活化和/或扩增细胞，例如通过用抗CD3单克隆抗体或抗CD3和抗CD28单克隆抗体两者进行处理。还可以在抗CD3和抗CD28单克隆抗体与IL-2结合存在的情况下扩增Treg。合适地，IL-2可以被IL-15代替。可以在Treg扩增方案中使用的其他组分包括但不限于雷帕霉素、全反式视黄酸(ATRA)和TGFβ。如本文所用，“活化”是指细胞被刺激，从而导致细胞增殖。如本文所用，“扩增”是指细胞或细胞群已经被诱导而增殖。细胞群的扩增可以例如通过计数群中存在的细胞的数量来测量。细胞的表型可以通过本领域已知的方法例如流式细胞术来确定。

调节性T细胞(Treg)是具有免疫抑制功能的免疫细胞，其控制细胞病变免疫反应并且对维持免疫耐受至关重要。

如本文所用，术语Treg是指具有免疫抑制功能的T细胞。

合适地，免疫抑制功能可以指Treg减少或抑制免疫系统响应诸如病原体、同种异体抗原或自身抗原之类的刺激而促进的多种生理和细胞作用中的一种或多种的能力。这种作用的实例包括常规T细胞(Tconv)增殖的增加和促炎细胞因子的分泌。任何这样的作用都可以用作免疫应答强度的指标。在Treg存在的情况下，Tconv的相对较弱的免疫应答将表明Treg抑制免疫应答的能力。例如，细胞因子分泌的相对减少将指示较弱的免疫应答，并且因此指示Treg抑制免疫应答的能力。Treg还可以通过调节共刺激分子在抗原呈递细胞(APC)(例如B细胞、树突细胞和巨噬细胞)上的表达来抑制免疫应答。CD80和CD86的表达水平可以用于评估共培养后体外活化的Treg的抑制能力。

用于测量免疫应答强度的指标并由此测量Treg的抑制能力的试验是本领域已知的。特别地，可以将抗原特异性Tconv细胞与Treg共培养，并且将相应抗原的肽加入到共培养物中以刺激来自Tconv细胞的应答。响应于肽的加入，Tconv细胞的增殖程度和/或Tconv细胞分泌的细胞因子IL-2的量可以用作共培养的Treg的抑制能力的指标。

与本发明的Treg共培养的抗原特异性Tconv细胞可以比在不存在本发明的Treg的情况下培养的相同Tconv细胞增殖少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、90％、95％或99％。

与本发明的Treg共培养的抗原特异性Tconv细胞可以比在不存在本发明的Treg的情况下培养的相应Tconv细胞少表达至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％的效应细胞因子。

所述效应细胞因子可以选自IL-2、IL-17、TNFα、GM-CSF、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13。

合适地，所述效应细胞因子可以选自IL-2、IL-17、TNFα、GM-CSF和IFN-γ。

合适地，Treg是表达标志物CD4、CD25和FOXP3(CD4

Treg还可以表达CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关分子4)或GITR(糖皮质激素诱导的TNF受体)。Treg细胞存在于外周血、淋巴结和组织中，并且包括胸腺来源的天然Treg(nTreg)细胞和外周产生的诱导Treg(iTreg)细胞。

合适地，Treg可以在不存在表面蛋白CD127的情况下或结合表面蛋白CD127的低水平表达(CD4

Treg可以是CD4

Treg可以是CD4

Treg可以是CD4

Treg可以是天然或胸腺来源的，过继性的或外周来源的或体外诱导的(Abbas,A.K.等，2013年，Nature immunology，14(4)，第307至308页)。

合适地，Treg可以是天然Treg(nTreg)。如本文所用，术语“天然Treg”是指胸腺来源的Treg。天然Treg是CD4

Treg可以具有脱甲基的Treg特异性脱甲基化区(TSDR)。TSDR是调节Foxp3表达的重要甲基化敏感元件(Polansky,J.K.等，2008年，European journal of immunology，38(6)，第1654至1663页)。

其他合适的Treg包括但不限于Tr1细胞(其不表达Foxp3，并且具有高的IL-10产生)、CD8

确定细胞标志物存在的方法是本领域众所周知的，并且包括例如流式细胞术。

合适地，诸如Treg之类的细胞从受试者获得的外周血单核细胞(PBMC)分离出来。合适地，从其获得PBMC的受试者是哺乳动物，优选地为人类。合适地，该细胞与要施用工程化Treg的受试者相匹配(例如，HLA相匹配)或是自体的。合适地，待治疗的受试者是哺乳动物，优选地为人类。该细胞可以从患者自身的外周血(第一方)离体产生，或者可以在来自供体外周血(第二方)的造血干细胞移植的背景下离体产生，或者从来自无关联供体的外周血(第三方)离体产生。合适地，该细胞与要施用工程化Treg的受试者是自体的。

合适地，Treg从受试者获得的外周血单核细胞(PBMC)中分离。在一个优选的实施方案中，Treg从受试者获得的外周血单核细胞(PBMC)中分离，并且与待治疗的受试者相匹配或是自体的。

合适地，Treg从待治疗的受试者中分离。

合适地，Treg是Treg群的一部分。合适地，Treg群包括至少70％的Treg，例如至少75％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的Treg。这样的群可以被称为“富集的Treg群”。

在一些方面，Treg可以源自可诱导祖细胞或胚胎祖细胞向Treg的离体分化。可以在分化为Treg之前或之后将本发明的多核苷酸或载体引入可诱导祖细胞或胚胎祖细胞中。

如本文所用，术语“常规T细胞”或Tcon是指表达αβT细胞受体(TCR)以及下述共受体的T淋巴细胞，所述共受体可以是分化簇4(CD4)或分化簇8(CD8)，并且不具有免疫抑制功能。常规T细胞存在于外周血、淋巴结和组织中。合适地，工程化Treg可以采用多种方法之一通过引入除了本文所述的编码CAR的DNA或RNA之外的编码FOXP3的DNA或RNA来由Tcon产生，所述方法包括利用病毒载体转导或利用在相同或不同载体上的DNA或RNA转染。可替代地，工程化Treg可以在存在IL-2和TGF-β的情况下通过体外培养CD4+CD25-FOXP3-细胞来从Tcon产生。

嵌合抗原受体(CAR)

如本文所用的“嵌合抗原受体”或“CAR”是指可以赋予细胞(例如Treg)抗原特异性的工程化受体。CAR还被称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。优选地，本发明的CAR包含细胞外抗原特异性靶向域、跨膜域、任选地一个或多个共刺激域，以及胞内信号传导域(也称为胞内域)。

可以使用例如逆转录病毒载体将编码CAR的多核苷酸转移至Treg。通过这种方式，可以产生大量的抗原特异性T细胞用于过继性细胞转移。当CAR结合靶抗原时，这会引起激活信号传输到表达其的Treg。因此，CAR指导工程化Treg对表达靶抗原的细胞的特异性。

本发明的CAR包含胞内域，所述胞内域包含STAT5缔合基序和JAK1结合基序和/或JAK2结合基序。

“信号转导和转录激活因子5”(STAT5)是IL-2信号通路中涉及的转录因子，其通过促进诸如FOXP3、IL2RA和BCLXL等基因的表达在Treg功能、稳定性和存活中起关键作用。为了发挥功能并转位到细胞核中，STAT5需要被磷酸化。IL-2连接通过经由分别存在于IL-2Rβ和IL-2Rγ链中的特定信号传导域激活Jak1/Jak2和Jak3激酶，从而引起STAT5磷酸化。尽管Jak1(或Jak2)在无需Jak3的情况下就可以磷酸化STAT5，但是STAT5的活性通过Jak1/Jak2和Jak3的转磷酸作用而增加，转磷酸作用稳定了它们的活性。

如本文所用的“STAT5缔合基序”是指包含酪氨酸并能够结合STAT5多肽的氨基酸基序。本领域已知的任何测定蛋白质:蛋白质相互作用的方法都可以用于确定缔合基序是否能够结合STAT5。例如，先进行共免疫沉淀，然后再进行蛋白质印迹。

合适地，CAR胞内域可以包含两个或更多个如本文定义的STAT5缔合基序。例如，CAR胞内域可以包含两个、三个、四个、五个或更多个如本文定义的STAT5缔合基序。优选地，CAR胞内域可以包含两个或三个如本文定义的STAT5缔合基序。

合适地，所述STAT5缔合基序可以内源性地存在于跨膜蛋白的胞质域中。例如，所述STAT5缔合基序可以来自白细胞介素受体(IL)受体胞内域或激素受体。

CAR胞内域可以包含选自白细胞介素受体的任何链的氨基酸序列，其中，STAT5是下游组分，例如，可以使用包含以下的胞质域：IL-2受体β链第266位至第551位氨基酸(NCBIREFSEQ:NP_000869.1,SEQ ID NO:1)、IL-7Rα链的第265位至第459位氨基酸(NCBI REFSEQ：NP_002176.2，SEQ ID NO:2)、IL-9R链的第292位至第521位氨基酸(NCBI REFSEQ:NP_002177.2,SEQ ID NO:3)、IL-4Rα链的第257位至第825位氨基酸(NCBI REFSEQ:NPJD00409.1,SEQ ID NO:4)、IL-3Rβ链的第461位至第897位氨基酸(NCBI REFSEQ:NP_000386.1,SEQ ID NO:5)，或者IL-17Rβ链的第314位至第502位氨基酸(NCBI REFSEQ:NP_061195.2,SEQ ID NO:6)。可以使用白细胞介素受体链的胞质域的整个区域。

KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ

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RHERIKKTSFSTTTLLPPIKVLVVYPSEICFHHTICYFTEFLQNHCRSEVILEKWQKKKIAEMGPVQWLATQKKAADKVVFLLSNDVNSVCDGTCGKSEGSPSENSQDLFPLAFNLFCSDLRSQIHLHKYVVVYFREIDTKDDYNALSVCPKYHLMKDATAFCAELLHVKQQVSAGKRSQACHDGCCSL

CAR胞内域可以包含STAT5缔合基序，所述STAT5缔合基序包含SEQ ID NO:1-7所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1-7至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的变体。例如，变体可能能够结合STAT5至SEQ ID NO:1-7之一所示的氨基酸序列的水平的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。所述变体或衍生物可能能够结合STAT5至与SEQ ID NO:1-7之一相似或相同的水平，或者可能能够结合STAT5至比SEQ ID NO:1-7之一所示的氨基酸序列更高的水平(例如增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。

例如，STAT5缔合基序可以来自IL2Rβ、IL7Rα、IL-3Rβ(CSF2RB)、IL-9R、IL-17Rβ、促红细胞生成素受体、促血小板生成素受体、生长激素受体和催乳素受体。

STAT5缔合基序可以包含氨基酸基序YXXF/L(SEQ ID NO:8)；其中，X是任意氨基酸。

合适地，STAT5缔合基序可以包含氨基酸基序YCTF(SEQ ID NO:9)、YFFF(SEQ IDNO:10)、YLSL(SEQ ID NO:11)或YLSLQ(SEQ ID NO:12)。

合适地，STAT5缔合基序可以包含氨基酸基序YLSLQ(SEQ ID NO:12)。

CAR胞内域可以包含一个或多个STAT5缔合基序，所述STAT5缔合基序包含氨基酸基序YCTF(SEQ ID NO:9)、YFFF(SEQ ID NO:10)、YLSL(SEQ ID NO:11)和/或YLSLQ(SEQ IDNO:12)。

CAR胞内域可以包含第一STAT5缔合基序和第二STAT5缔合基序，所述第一STAT5缔合基序包含氨基酸基序YLSLQ(SEQ ID NO:12)，所述第二STAT5缔合基序包含氨基酸基序YCTF(SEQ ID NO:9)或YFFF(SEQ ID NO:10)。

CAR胞内域可以包含以下STAT5缔合基序：YLSLQ(SEQ ID NO:12)、YCTF(SEQ IDNO:9)以及YFFF(SEQ ID NO:10)。

如本文所用的“JAK1和/或JAK2结合基序”是指允许酪氨酸激酶JAK1和/或JAK2缔合的BOX基序。合适的JAK1和JAK2结合基序例如由Ferrao和Lupardus(Frontiers inEndocrinology；2017；8(71)；其通过引用并入本文)进行了描述。

JAK1和/或JAK2结合基序可以内源性地出现在跨膜蛋白的胞质域中。

例如，JAK1和/或JAK2结合基序可以来自干扰素λ受体1(IFNLR1)、干扰素α受体1(IFNAR)、干扰素γ受体1(IFNGR1)、IL10RA、IL20RA、IL22RA、干扰素γ受体2(IFNGR2)或IL10RB。

JAK1结合基序可以包含如SEQ ID NO:13-19所示的氨基酸基序或者因此能够结合JAK1的变体。

KVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDK(SEQ ID NO:13)

NPWFQRAKMPRALDFSGHTHPVATFQPSRPESVNDLFLCPQKELT(SEQ ID NO:14)

GYICLRNSLPKVLNFHNFLAWPFPNLPPLEAMDMVEVIYINR(SEQ ID NO:15)

PLKEKSIILPKSLISVVRSATLETKPESKYVSLITSYQPFSL(SEQ ID NO:16)

RRRKKLPSVLLFKKPSPFIFISQRPSPETQDTIHPLDEEAFLK(SEQ ID NO:17)

YIHVGKEKHPANLILIYGNEFDKRFFVPAEKIVINFITLNISDDS(SEQ ID NO:18)

RYVTKPPAPPNSLNVQRVLTFQPLRFIQEHVLIPVFDLSGP(SEQ ID NO:19)

与SEQ ID NO:13-19中的任一个相比，SEQ ID NO:13-19的变体可以包含一个、两个或三个氨基酸差异并保留结合JAK1的能力。

该变体可以与SEQ ID NO:13-19中的任何一个至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同并保留结合JAK1的能力。

在一个优选的实施方案中，JAK1结合域包含SEQ ID NO:13或者其能够结合JAK1的变体。

例如，所述变体可能能够结合JAK1至相应的参考序列的水平的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。所述变体或衍生物可能能够结合JAK1至与相应的参考序列相似或相同的水平，或者可能能够结合JAK1至比相应的参考序列更高的水平(例如，增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。

JAK2结合基序可以包含如SEQ ID NO:20-22所示的氨基酸基序或者因此能够结合JAK2的变体。

NYVFFPSLKPSSSIDEYFSEQPLKNLLLSTSEEQIEKCFIIEN(SEQ ID NO:20)

YWFHTPPSIPLQIEEYLKDPTQPILEALDKDSSPKDDVWDSVSIISFPE(SEQ ID NO:21)

YAFSPRNSLPQHLKEFLGHPHHNTLLFFSFPLSDENDVFDKLSVIAEDSES(SEQ ID NO:22)

与SEQ ID NO:20-22中的任一个相比，SEQ ID NO:21-22的变体可以包含一个、两个或三个氨基酸差异并保留结合JAK2的能力。

例如，所述变体可能能够结合JAK2至相应的参考序列的水平的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。所述变体或衍生物可能能够结合JAK2至与相应的参考序列相似或相同的水平，或者可能能够结合JAK2至比相应的参考序列更高的水平(例如，增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。

本领域已知的任何测定蛋白质:蛋白质相互作用的方法都可以用于确定JAK1或JAK2结合基序是否能够与JAK1或JAK2结合。例如，先进行共免疫沉淀，然后再进行蛋白质印迹。

合适地，本文所述的CAR的胞内域可以不包含“信号转导和转录激活因子3”(STAT3)缔合基序。

STAT3已经被描述为对Treg的稳定性和功能有害的信号。例如，STAT3信号传导促进诸如IL17、IL21和IL22之类的促炎基因的表达。因此，在本发明的工程化Treg的背景下，不包含STAT3缔合基序的CAR的使用提供了特别的优势。

STAT3缔合基序可以包含氨基酸序列YXXQ(SEQ ID NO:52)，其中，“X”是任意氨基酸，并且能够结合STAT3。本领域已知的任何测定蛋白质:蛋白质相互作用的方法都可以用于确定STAT3缔合基序是否能够结合STAT3。例如，先进行共免疫沉淀，然后再进行蛋白质印迹。

合适地，CAR胞内域不包含氨基酸序列YXXQ(SEQ ID NO:52)；其中，“X”是任意氨基酸。

“STAT3缔合基序”可以指包括酪氨酸并且能够结合STAT3多肽的氨基酸基序。例如，如本文所用的“STAT3缔合基序”可以指下述氨基酸基序，该氨基酸基序包括酪氨酸并且当存在于Treg中时能够功能性结合(即导致活化)STAT3多肽。

合适地，CAR胞内域不包含含有酪氨酸并且能够结合STAT3多肽的氨基酸基序。例如，合适地，CAR胞内域不包含下述氨基酸基序，该氨基酸基序包含酪氨酸并且当存在于Treg中时能够功能性结合(即导致活化)STAT3多肽。

合适地，当在Treg中表达时，本发明的CAR的胞内域可能不能诱导生产性STAT3和/或STAT1信号传导。换句话说，当在Treg中表达时，本发明的CAR可能不能功能性结合和/或诱导STAT3和/或STAT1的磷酸化和活化。合适地，当在Treg中表达时，CAR可能不能诱导STAT3和/或STAT1依赖性转录激活。

合适地，CAR胞内域的IL2Rβ胞内域部分不包含如本文定义的STAT3缔合基序。

合适地，CAR胞内域可以包含如SEQ ID NO:1所示的IL2Rβ胞内域；或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的变体。

NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV

该变体可以与SEQ ID NO:1至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

合适地，CAR胞内域可以包含如SEQ ID NO:23或24中的任一个所示的截短型IL2Rβ胞内域，或SEQ ID NO:23或24中的任一个的变体，所述变体与SEQ ID NO:23或24具有至少80％的序列同一性。

NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV

NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV

该变体可以与SEQ ID NO:23或24至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

Jak1/2和Jak3都通过转磷酸作用提高了STAT5的活性，因为这可以稳定它们的活性。合适地，如本文所述的CAR胞内域可以进一步包含JAK3结合基序。如本文所用的“JAK3结合基序”是指允许酪氨酸激酶JAK3的BOX基序。合适的JAK3结合基序例如由Ferrao和Lupardus(Frontiers in Endocrinology；2017；8(71)；其通过引用并入本文)进行了描述。

本领域已知的任何测定蛋白质:蛋白质相互作用的方法都可以用于确定基序是否能够结合JAK3。例如，先进行共免疫沉淀，然后再进行蛋白质印迹。

JAK3结合基序可以内源性地出现在跨膜蛋白的胞质域中。

例如，JAK3结合基序可以来自IL-2Rγ多肽。

JAK3结合基序可以包含如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26所示的氨基酸基序或者因此能够结合JAK3的变体。

ERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEI

ERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEIPPKGGALGEGPGASPCNQHSPYWAPPCYTLKPET

该变体可以与SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

在一个优选的实施方案中，CAR胞内域包含一个或多个JAK1结合域和至少一个JAK3结合域。

如本文所述的CAR的胞内域还包含转导效应子功能信号并指导Treg在抗原结合后执行其专门功能所必需的基序。胞内信号传导域的实例包括但不限于T细胞受体的ζ链胞内域或其任何同源物(例如η链、FcεR1γ和β链、MB1(Igα)链、B29(Igβ)链等)、CD3多肽结构域(Δ、δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)以及参与T细胞转导的其他分子，例如CD2、CD5和CD28。胞内信号传导域可以包含人CD3ζ链胞内域、FcyRIII、FcsRI、Fc受体的细胞质尾、带有胞质受体的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其组合。

优选地，胞内信号传导域包括人CD3ζ链的胞内信号传导域。

在一个实施方案中，人CD3ζ链的胞内信号传导域包含以下序列：

UNIPROT:P20963,CD3Z_HUMAN,第31-143位

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:27)

在一个实施方案中，胞内信号传导域与SEQ ID NO:27具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。

CAR的胞内信号传导域可以包括以下CD28信号传导域：

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:28)

在一个实施方案中，胞内信号传导域是与SEQ ID NO:28具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的信号传导基序。

CAR的胞内信号传导域可以包含以下CD27信号传导域：

QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO:29)。

在一个实施方案中，胞内信号传导域是与SEQ ID NO:29具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的信号传导基序。

其他的胞内信号传导域对本领域技术人员将是显而易见的，并且可以与本发明的替代实施方案结合使用。

本发明的CAR可以包含复合胞内域，该复合胞内域包括T细胞共刺激分子的细胞内部分与例如CD3ζ的细胞内部分的融合物。这样的复合胞内域可以被称为第二代CAR，其可以在抗原识别之后同时传输激活和共刺激信号。最常用的共刺激域是CD28的共刺激域。这提供了最有效的共刺激信号-即免疫信号2，该信号触发T细胞增殖。CAR胞内域还可以包含一个或多个TNF受体家族信号传导域，例如OX40、4-1BB、ICOS或TNFRSF25的信号传导域。

OX40、4-1BB、ICOS和TNFRSF25信号传导域的说明性序列在下文示出为SEQ ID NO:30-33。CAR胞内域还可以包含SEQ ID NO:30-33或SEQ ID NO:30-33的变体中的一个或多个。

Ox40信号传导域(SEQ ID NO:30):

ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI

41BB信号传导域(SEQ ID NO:31):

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

ICOS信号传导域(SEQ ID NO:32):

CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL

TNFRSF25信号传导域(SEQ ID NO:33):

TYTYRHCWPHKPLVTADEAGMEALTPPPATHLSPLDSAHTLLAPPDSSEKICTVQLVGNSWTPGYPETQEALCPQVTWSWDQLPSRALGPAAAPTLSPESPAGSPAMMLQPGPQLYDVMDAVPARRWKEFVRTLGLREAEIEAVEVEIGRFRDQQYEMLKRWRQQQPAGLGAVYAALERMGLDGCVEDLRSRLQRGP

CAR胞内域可以包含SEQ ID NO:30-33的一个或多个的变体，该变体与SEQ ID NO:30-33中的任何一个具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。

合适地，CAR胞内域可以包含SEQ ID NO:45或与SEQ ID NO:45具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的变体。

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

合适地，CAR胞内域可以包含SEQ ID NO:53或与SEQ ID NO:53具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的变体。

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEIKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPG

除了本文提到的特定蛋白质、肽和核苷酸之外，本发明还涵盖衍生物及其片段的用途。

如本文使用的与本发明的蛋白质或多肽相关的术语“衍生物”包括序列的任意取代、变化、修饰、替换、一个(或多个)氨基酸残基的缺失和/或添加，假设所得的蛋白质或多肽保留所需功能(例如，如果衍生物或变体是抗原结合域，则所需功能可以是抗原结合域结合其靶抗原的能力，或者如果衍生物或变体是信号传导域，则所需功能可以是该域发出信号的能力(例如激活或灭活下游分子)。例如，与相应的参考序列相比，变体或衍生物可以具有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的功能。与相应的参考序列相比，变体或衍生物可以具有相似或相同的功能水平，或者可以具有增加的功能水平(例如，增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。

通常，可以进行氨基酸取代，例如1、2或3至10或20个取代，只要修饰的序列保持所需的活性或能力。氨基酸取代可以包括使用非天然存在的类似物。例如，与相应的参考序列相比，变体或衍生物可以具有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的活性或能力。与相应的参考序列相比，变体或衍生物可以具有相似或相同的活性或能力水平，或者可以具有增加的活性或能力水平(例如，增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。

用于本发明的蛋白质或肽还可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，其产生沉默的变化并产生功能上等同的蛋白质。只要保留内源性功能，可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性进行有意的氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷极性头基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。

可以例如根据下表进行保守替换。第二列中相同区块中的氨基酸可以彼此替换，最好是第三列中同一行中的氨基酸可以彼此替换：

衍生物可以是同系物。如本文使用的术语“同源物”是指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同源性的实体。术语“同源性”可以等同于“同一性”。

同源或变体序列可以包括与主体序列至少50％、55％、65％、75％、85％或90％相同，优选至少95％或97％或99％相同的氨基酸序列。通常，同源物将包括与主体氨基酸序列相同的活性位点等。尽管也可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)考虑同源性，但是在本发明的上下文中，优选根据序列同一性来表达同源性。

同源性比较可以通过肉眼进行，或者更通常地，借助于容易获得的序列比较程序进行。这些商业上可获得的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的百分比同源性或同一性。

可以对连续序列计算百分比同源性，即，一个序列与另一序列比对，并且一个序列中的每个氨基酸与另一序列中的对应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“无空位”比对。通常，这种无空位比对只在相对较少的残基上进行。

尽管这是一种非常简单且一致的方法，但是它没有考虑到例如在其他相同的序列对中，核苷酸序列中的一个插入或缺失可能导致以下密码子失配，因此执行全局比对时，可能导致百分比同源性大大降低。因此，大多数序列比较方法被设计为产生最佳比对，该比对考虑了可能的插入和缺失，而不会不合适地损害整体同源性得分。这是通过在序列比对中插入“缺口”以尝试使局部同源性最大化来实现的。

然而，这些更复杂的方法将“空位罚分”分配给比对中出现的每个空位，以便对于相同数目的相同氨基酸而言，以尽可能少的空位进行序列比对，这反映了两个比较序列之间的更高相关性，将获得比具有许多缺口的序列更高的分数。通常使用“仿射空位成本”，其对于空位的存在收取相对较高的成本，并对空位中的每个后续残基收取较小的处罚。这是最常用的空位评分系统。当然，高空位罚分将产生具有较少空位的优化比对。大多数比对程序都允许修改空位罚分。然而，在使用此类软件进行序列比较时，优选使用默认值。例如，当使用GCG威斯康辛最佳拟合软件包时，氨基酸序列的默认空位罚分是对于空位为-12和对于每个延伸为-4。

因此，最大百分比同源性的计算首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。用于进行这种比对的合适的计算机程序是GCG威斯康星最佳拟合软件包(美国威斯康星大学；Devereux等(1984)Nucleic Acids Res.12:387)。可以执行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等(1999)同上-第18章)，FASTA(Atschul等(1990)J.Mol.Biol.第403至410页)和GENEWORKS比较工具套件。BLAST和FASTA均可用于脱机和在线检索(参见Ausubel等(1999)，同上，第7至58页至第7至60页)。但是，对于某些应用而言，优选使用GCG最佳拟合程序。另一种称为BLAST 2序列的工具也可以用来比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol.Lett.(1999)174:247-50；FEMS Microbiol.Lett.(1999)177:187-8)。

尽管可以根据同一性来衡量最终的百分比同源性，但比对过程本身通常不是基于全有或全无的配对比较。而是，通常使用缩放的相似性得分矩阵(scaled similarityscore matrix)，该矩阵基于化学相似性或进化距离为每个成对比较分配赋分。常用的这种矩阵的实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序套件的默认矩阵。GCG威斯康星程序通常使用公用默认值或自定义符号对照表(如果提供的话)(有关更多细节，请参见用户手册)。对于某些应用，优选使用GCG软件包的公共默认值，或者在其他软件的情况下，使用默认矩阵，例如BLOSUM62。合适地，在整个参考和/或查询序列中确定百分比同一性。

一旦软件产生了最佳比对，就可以计算百分比同源性，优选地计算百分比序列同一性。软件通常将此作为序列比较的一部分，并生成数值结果。

“片段”通常是指功能上感兴趣的多肽或多核苷酸的选定区域。因此，“片段”是指作为全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。

这样的衍生物和片段可以使用标准的重组DNA技术例如定点诱变来制备。在要进行插入的情况下，可以制备编码插入以及与插入位点任一侧的天然存在序列相对应的5'和3'侧翼区域的合成DNA。侧翼区域将包含与天然存在序列中的位点相对应的方便的限制性位点，从而可以用适当的酶切割该序列，并将合成的DNA连接到该切口中。然后根据本发明表达DNA以制备编码的蛋白质。这些方法只是本领域已知的用于操纵DNA序列的许多标准技术的示例，然而也可以使用其他已知技术。

抗原特异性靶向域为CAR提供结合预定的感兴趣抗原的能力。抗原特异性靶向域优选靶向临床感兴趣的抗原。

抗原特异性靶向域可以是具有特异性识别并结合生物分子(例如细胞表面受体或其组分)的能力的任何蛋白质或肽。抗原特异性靶向域包括感兴趣的生物分子的任何天然存在的、合成的、半合成的或重组产生的结合伴侣。示例性的抗原特异性靶向域包括抗体或抗体片段或衍生物、受体的细胞外结构域、细胞表面分子/受体的配体或其受体结合域以及肿瘤结合蛋白。尽管如下所述的那样，抗原特异性靶向域可以优选是抗体或衍生自抗体，但是也包括其他抗原特异性靶向域，例如，由抗原肽/MHC或HLA组合形成的抗原特异性靶向域，其能够与在移植、炎症或疾病部位活跃的Tcon细胞的TCR结合。这样的抗原结合域已经例如在Mekala等，Blood，2005，第105卷，第2090至2092页中报道。

在一个优选的实施方案中，抗原特异性靶向域是抗体或衍生自抗体。源自抗体的靶向域可以是抗体的片段或抗体的一个或多个片段的基因工程产物，该片段参与与抗原的结合。实例包括可变区(Fv)、互补决定区(CDR)、Fab、单链抗体(scFv)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、骆驼抗体(VHH)和单域抗体(sAb)。

在一个优选的实施方案中，结合域是单链抗体(scFv)。scFv可以是鼠、人类或人源化的scFv。

关于抗体或其抗原结合片段的“互补决定区”或“CDR”是指抗体的重链或轻链的可变区中的高度可变环。CDR可以与抗原构象相互作用，并在很大程度上决定与抗原的结合(尽管已知某些框架区参与结合)。重链可变区和轻链可变区各自包含3个CDR。“重链可变区”或“VH”是指抗体的重链片段，其包含插入在称为框架区的侧翼延伸片段之间的三个CDR，框架区比CDR保守性更高，并形成支持CDR的支架。“轻链可变区”或“VL”是指抗体的轻链片段，其包含插入在框架区之间的三个CDR。

“Fv”是指带有完整抗原结合位点的抗体的最小片段。Fv片段由结合至单条重链的可变区的单条轻链的可变区组成。“单链Fv抗体”或“scFv”是指由直接彼此连接或通过肽接头序列彼此连接的轻链可变区和重链可变区组成的工程抗体。

可以使用本领域众所周知的方法来制备特异性结合预定抗原的抗体。此类方法包括噬菌体展示、产生人或人源化抗体的方法，或者使用经工程改造以产生人抗体的转基因动物或植物的方法。部分或完全合成的抗体的噬菌体展示文库是可得的，并且可以筛选可以结合靶分子的抗体或其片段。人类抗体的噬菌体展示文库也是可得的。一旦被鉴定，编码抗体的氨基酸序列或多核苷酸序列可以被分离和/或确定。

可以由本发明的CAR靶向的抗原包括但不限于在与移植器官、自身免疫性疾病、过敏性疾病和炎性疾病相关的细胞上表达的抗原。技术人员将理解的是，由于Treg细胞的旁观者效应，抗原可以简单地存在于和/或表达在移植、炎症或疾病的部位。

与器官移植相关的抗原和/或与移植器官相关的细胞包括但不限于存在于移植器官中但不存在于患者体内的HLA抗原，或在移植排斥过程中表达上调的抗原，诸如CCL19、MMP9、SLC1A3、MMP7、HMMR、TOP2A、GPNMB、PLA2G7、CXCL9、FABP5、GBP2、CD74、CXCL10、UBD、CD27、CD48、CXCL11。

举例来说，CAR可以包含能够结合HLA-A2的抗原结合域(HLA-A2在本文中也可以称为HLA-A*02、HLA-A02和HLA-A*2)。HLA-A*02是HLA-A位点的一个特定的I类主要组织相容性复合体(MHC)等位基因组。

抗原识别域可以结合、合适地特异性结合HLA-A2内的一个或多个区域或表位。表位，也称为抗原决定簇，是抗原中被抗原识别域(例如抗体)识别的部分。换句话说，表位是抗体结合的抗原的特定片段。合适地，抗原识别域结合、合适地特异性结合HLA-A2内的一个区域或表位。

抗原识别域可以包含至少一个CDR(例如CDR3)，该CDR可以根据与抗原结合的抗体预测，所述抗原优选为HLA-A2(或这种预测的CDR的变体(例如具有一个、两个或三个氨基酸取代的变体))。应当理解的是，包含三个或更少CDR区(例如，单个CDR或甚至单个CDR的一部分)的分子可能能够保留衍生CDR的抗体的抗原结合活性。包含两个CDR区的分子在本领域中被描述为能够与例如呈小体(minibody)形式的靶抗原结合(Vaughan和Sollazzo，2001年，Combinational Chemistry&High Throughput Screening，4，417-430)。已经描述了包含单个CDR的分子，该分子可以显示出与靶的强结合活性(Nicaise等，2004，ProteinScience，13:1882-91)。

在这个方面，抗原识别域可以包含一个或多个可变重链CDR，例如一个、两个或三个可变重链CDR。或者，或另外地，抗原识别域可以包含一个或多个可变轻链CDR，例如一个、两个或三个可变轻链CDR。抗原识别域可以包含三个重链CDR和/或三个轻链CDR(更特别地，包含三个CDR的重链可变区和/或包含三个CDR的轻链可变区)，其中，至少一个CDR，优选地所有CDR可以来自下述抗体，该抗体与抗原结合，优选地与HLA-A2结合，或者可以选自下面提供的CDR序列之一。

抗原识别域可以包含可变重链CDR和可变轻链CDR的任意组合，例如，一个可变重链CDR与一个可变轻链CDR一起的组合、两个可变重链CDR与一个可变轻链CDR一起的组合、两个可变重链CDR与两个可变轻链CDR一起的组合、三个可变重链CDR与一个或两个可变轻链CDR一起的组合、一个可变重链CDR与两个或三个可变轻链CDR一起的组合或三个可变重链CDR与三个可变轻链CDR一起的组合。优选地，抗原识别域包含三个可变重链CDR(CDR1、CDR2和CDR3)或三个可变轻链CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。

存在于抗原识别域中的一个或多个CDR可能并非全部来自同一抗体，只要该结构域具有上述结合活性即可。因此，可以根据与抗原(例如，HLA-A2)结合的抗体的重链或轻链预测一个CDR，而可以根据与相同抗原(例如，HLA-A2)结合的不同抗体预测另一CDR。在这种情况下，可以优选地根据与抗原(例如，HLA-A2)结合的抗体预测CDR3。然而，特别地，如果在抗原识别域中存在一个以上的CDR，则优选的是，根据与相同抗原(例如，HLA-A2)结合的抗体预测CDR。可用来自不同的抗体，特别是来自与相同所期望的区域或表位结合的抗体的CDR的组合。

在一个特别优选的实施方案中，抗原识别域包含根据与aa抗原(例如，HLA-A2)结合的抗体的可变重链序列预测的三个CDR，和/或根据与抗原(例如，HLA-A2)结合的抗体(优选同一抗体)的可变轻链序列预测的三个CDR。

在一些实施方案中，抗原识别域是抗体或者衍生自抗体(例如，Fab、scFv或sdAb)，其中，所述抗体包含选自SEQ ID NO:90-146或其衍生物的一个或多个CDR区。换句话说，在一些实施方案中，抗原识别域包含选自SEQ ID NO:90-146或其衍生物的一个或多个CDR区。合适地，抗原识别域包含选自SEQ ID NO:90-146或其衍生物的三个CDR区。

优选地，抗原结合域包含选自相同可变链的CDR(CDR1、CDR2和CDR3)或其衍生物。例如，抗原结合域可以包含SEQ ID NO:90至SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93至SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96至SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99至SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102至SEQ IDNO:104、SEQ ID NO:105至SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108至SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111至SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114至SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117至SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120至SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123至SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126至SEQID NO:128、SEQ ID NO:129至SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132至SEQ ID NO:134、SEQ IDNO:135至SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138至SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141至SEQ ID NO:143和/或SEQ ID NO:144至SEQ ID NO:146或其衍生物。

在优选实施方案中，抗原识别域包含如下可变重CDR和可变轻CDR的组合:

(i)SEQ ID NO:90至SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:104或其衍生物；

(ii)SEQ ID NO:93至SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:105至SEQ ID NO:107或其衍生物；

(iii)SEQ ID NO:96至SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:108至SEQ ID:110或其衍生物；

(iv)SEQ ID NO:99至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:111至SEQ ID:113或其衍生物；

(v)SEQ ID NO:99至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:114至SEQ ID:116或其衍生物；

(vi)SEQ ID NO:99至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:117至SEQ ID:119或其衍生物；

(vii)SEQ ID NO:99至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:120至SEQ ID:122或其衍生物；

(viii)SEQ ID NO:99至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:123至SEQ ID:125或其衍生物；

(ix)SEQ ID NO:99至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:126至SEQ ID:128或其衍生物；

(x)SEQ ID NO:99至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:129至SEQ ID:131或其衍生物；

(xi)SEQ ID NO:99至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:132至SEQ ID:134或其衍生物；

(xii)SEQ ID NO:99至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:135至SEQ ID:137或其衍生物；

(xiii)SEQ ID NO:99至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:138至SEQ ID:140或其衍生物；

(xiv)SEQ ID NO:99至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:141至SEQ ID:143或其衍生物；

(xv)SEQ ID NO:99至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:144至SEQ ID:146或其衍生物；

优选地，抗原识别域包含SEQ ID NO:93至SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:105至SEQID NO:107或其衍生物。

抗原结合域可以包含选自SEQ ID NO:54、55、56或57或与SEQ ID NO:54、55、56或57至少80％相同的变体的可变重结构域。该变体可以与SEQ ID NO:54、55、56或57至少85、90、95、97、98或99％相同。

VQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWMAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGTLVTV

QVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSEKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYLDLWGRGT

QVQLVQSGGGVVQPGGSMRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRNDGSDKYYADSVRGRFTISRDNSKKTVFLQMNSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGT

QVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWMAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGT

抗原结合域可以包含选自SEQ ID NO:58至72的可变轻域或与SEQ ID NO:58至72至少80％相同的变体。该变体可以与SEQ ID NO:58至72至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPPTFGGGTKLTVLG

DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSLDISHYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTHFTFTISSLQPEDFATYYCQQYDNLPLTFGGGTKLEIK

DIVLMQSPSFLSASVGDRVTITCRASHGINNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDSYPPTFGRTKVEIKR

DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPLTFGGGTKVDIK

DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPLTFGGGTKVDIK

DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPITFGGGTKVDIK

DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPSTFGGGTKVDIK

DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFGTYYCQQYNTYPLTFGGGTKVDIK

DVVMTQSPSSLTASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLSIDSLQPEDFATYYCQQYHTYPLTFGGGTKVDIK

DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVDIK

DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNNYPLTFGGGTKVDIK

DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLAWYQQKPGRAPTLLIFAASNLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISGLQPEDFATYYCLQDSSYPPTFGGGTKVDIK

DVVMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGRAPTLLIYKASNLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFASYYCQQYSNYPLTFGGGTKVDIK

DVVMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASHGISNYFAWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISGLQPEDFATYYCQQYSSYPLTFGGGTKVDIK

DVVMTQSPSTLSAYVGDRITITCRASRGSNYLAWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPLRFSGSGSGTEFTLTISGLQPEDFATYYCQQYDSYPPTFGGGTKVDIK

抗原结合域可以包含SEQ ID NO:34或73至86或与SEQ ID NO:34或73至86至少80％相同并且能够结合HLA-A2的变体。该变体可以与SEQ ID NO:34或73至86至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

QVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSEKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYLDLWGSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSLDISHYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTHFTFTISSLQPEDFATYYCQQYDNLPLTFGGGTKLEIK

QVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWMAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPPTFGGGTKLTVLG

QVQLVQSGGGVVQPGGSMRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRNDGSDKYYADSVRGRFTISRDNSKKTVFLQMNSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGTSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLMQSPSFLSASVGDRVTITCRASHGINNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDSYPPTFGRTKVEIKR

QVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWMAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGTSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPLTFGGGTKVDIK

QVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWMAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGTSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQEPGKAPKLLIYDETHLDSGVPSRFTGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDSLPPTFGGGTKVDIK

QVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWMAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGTSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPITFGGGTKVDIK

QVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWMAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGTSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPSTFGGGTKVDIK

QVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWMAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGTSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFGTYYCQQYNTYPLTFGGGTKVDIK

QVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWMAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGTSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLTASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLSIDSLQPEDFATYYCQQYHTYPLTFGGGTKVDIK

QVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWMAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGTSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVDIK

QVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWMAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGTSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNNYPLTFGGGTKVDIK

QVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWMAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGTSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLAWYQQKPGRAPTLLIFAASNLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISGLQPEDFATYYCLQDSSYPPTFGGGTKVDIK

QVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWMAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGTSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGRAPTLLIYKASNLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFASYYCQQYSNYPLTFGGGTKVDIK

QVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWMAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGTSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASHGISNYFAWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISGLQPEDFATYYCQQYSSYPLTFGGGTKVDIK

QVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWMAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGTSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSTLSAYVGDRITITCRASRGSNYLAWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPLRFSGSGSGTEFTLTISGLQPEDFATYYCQQYDSYPPTFGGGTKVDIK

抗原结合域可以包含SEQ ID NO:73，或与SEQ ID NO:73至少80％相同的变体。合适地，该变体可以与SEQ ID NO:73至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

抗原结合域可以包含SEQ ID NO:34，或与SEQ ID NO:34至少80％相同的变体。合适地，该变体可以与SEQ ID NO:34至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

抗原结合域可以包含SEQ ID NO:74，或与SEQ ID NO:74至少80％相同的变体。合适地，该变体可以与SEQ ID NO:74至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

抗原结合域可以包含SEQ ID NO:75，或与SEQ ID NO:75至少80％相同的变体。合适地，该变体可以与SEQ ID NO:75至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

抗原结合域可以包含SEQ ID NO:76，或与SEQ ID NO:76至少80％相同的变体。合适地，该变体可以与SEQ ID NO:76至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

抗原结合域可以包含SEQ ID NO:77，或与SEQ ID NO:77至少80％相同的变体。合适地，该变体可以与SEQ ID NO:77至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

抗原结合域可以包含SEQ ID NO:78，或与SEQ ID NO:78至少80％相同的变体。合适地，该变体可以与SEQ ID NO:78至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

抗原结合域可以包含SEQ ID NO:79，或与SEQ ID NO:79至少80％相同的变体。合适地，该变体可以与SEQ ID NO:79至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

抗原结合域可以包含SEQ ID NO:80，或与SEQ ID NO:80至少80％相同的变体。合适地，该变体可以与SEQ ID NO:80至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

抗原结合域可以包含SEQ ID NO:81，或与SEQ ID NO:81至少80％相同的变体。合适地，该变体可以与SEQ ID NO:81至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

抗原结合域可以包含SEQ ID NO:82，或与SEQ ID NO:82至少80％相同的变体。合适地，该变体可以与SEQ ID NO:82至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

抗原结合域可以包含SEQ ID NO:83，或与SEQ ID NO:83至少80％相同的变体。合适地，该变体可以与SEQ ID NO:83至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

抗原结合域可以包含SEQ ID NO:84，或与SEQ ID NO:84至少80％相同的变体。合适地，该变体可以与SEQ ID NO:84至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

抗原结合域可以包含SEQ ID NO:85，或与SEQ ID NO:85至少80％相同的变体。合适地，该变体可以与SEQ ID NO:85至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

抗原结合域可以包含SEQ ID NO:86，或与SEQ ID NO:86至少80％相同的变体。合适地，该变体可以与SEQ ID NO:86至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

CAR也可以包含跨膜域。跨膜域可以包含来自具有跨膜域的任意蛋白质的跨膜序列，所述蛋白质包括I型跨膜蛋白、I型跨膜蛋白或III型跨膜蛋白中的任意一种。CAR的跨膜域还可以包含人工疏水序列。可以选择CAR的跨膜域以使其不二聚化。其他的跨膜域对本领域技术人员将是显而易见的。CAR构建体中使用的跨膜(TM)区的实例为：1)CD28 TM区(Pule等，Mol Ther，2005年11月，12(5)：933-41；Brentjens等，CCR，2007年9月15日；13(18Pt 1)：5426-35；Casucci等，Blood，2013年11月14日；122(20)：3461-72.)；2)OX40 TM区(Pule等，Mol Ther，2005年11月；12(5)：933-41)；3)41BB TM区(Brentjens等，CCR，2007年9月15日；13(18Pt 1)：5426-35)；4)CD3ζTM区(Pule等，Mol Ther，2005年11月；12(5)：933-41；Savoldo B，Blood，2009年6月18日；113(25)：6392-402)；5)CD8a TM区(Maher等，NatBiotechnol，2002年1月；20(1)：70-5.；Imai C,Leukemia，2004年4月；18(4)：676-84；Brentjens等，CCR，2007年9月15日；13(18Pt 1)：5426-35；Milone等，Mol Ther，2009年8月；17(8)：1453-64.)。

合适地，跨膜域可以包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:35至少80％相同的变体。

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV

合适地，该变体可以与SEQ ID NO:35至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

合适地，CAR可以包含CD8α跨膜域。合适地，跨膜域可以包含如SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:87至少80％相同的变体。

示例性CD8αTM域(AA 183至203)(SEQ ID NO:87):

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT

合适地，该变体可以与SEQ ID NO:87至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

合适地，CAR可以包含CD28铰链和跨膜序列。合适地，所述铰链和跨膜域可以包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:36至少80％相同的变体。

IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV

合适地，该变体可以与SEQ ID NO:36至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

在一个实施方案中，跨膜和细胞内信号传导域均衍生自CD28。在一个实施方案中，跨膜和细胞内信号传导域包含以下序列：

人CD28的跨膜和细胞内部分(UNIPROT：P10747，CD28_HUMAN，第153-220位)

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:37)

在一个实施方案中，跨膜和胞内信号传导域与SEQ ID NO:37具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。

在一个实施方案中，CD28的跨膜域包括序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQID NO:38)。

合适地，CAR可以编码标签-例如c-Myc标签(EQKLISEEDL-SEQ ID NO:39)。合适地可以将标签掺入CAR的细胞外结构域中，例如掺入细胞外结构域的铰链区中。具有整合的c-Myc标签的示例性CD28铰链/跨膜域如SEQ ID NO:40所示。

IEVEQKLISEEDLLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:40)。

合适地，CAR可以包含CD8α铰链域和CD28跨膜域。合适地，所述铰链和跨膜域可以包含如SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:88至少80％相同的变体。

示例性CD8α铰链域和CD28跨膜域(SEQ ID NO:88)：

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV

合适地，该变体可以与SEQ ID NO:88至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

合适地，CAR可以包含CD28铰链域和CD8α跨膜域。合适地，所述铰链和跨膜域可以包含如SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:89至少80％相同的变体。

示例性CD28铰链域和CD8α跨膜域(SEQ ID NO:89)：

IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT

合适地，该变体可以与SEQ ID NO:89至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

CAR可以进一步包含将其靶向内质网途径以在细胞表面表达的前导序列。示例性前导序列是MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:41)。

用于本发明的示例性CAR如SEQ IDNO:42-44所示。

SEQ ID NO:42(含有HLA-A2 scFV、c-Myc标签、CD28、IL2RB-Y510、CD3ζ胞内域的CAR)

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWMAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPPTFGGGTKLTVLGAAAIEVEQKLISEEDLLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSNCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRETRGGGATMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK

SEQ ID NO:43(包含HLA-A2 scFV、c-Myc标签、CD28、IL2RG-T52、IL2RB-Y510、CD3ζ胞内域的CAR)

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGGGVVQPGGSLRVSCAASGVTLSDYGMHWVRQAPGKGLEWMAFIRNDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKKTVSLQMSSLRAEDTAVYYCAKNGESGPLDYWYFDLWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPPTFGGGTKLTVLGAAAIEVEQKLISEEDLLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO:44(包含HLA-A2 scFV、c-Myc标签、CD28、IL2RG-T52、IL7RA-2Y、CD3ζ胞内域的CAR)

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CAR可以包含与SEQ ID NO:NO:42-44中的任意一个具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

药物组合物

还提供了包含本发明的工程化Treg或CAR的药物组合物。

药物组合物是包含治疗有效量的药物活性剂即Treg或由治疗有效量的药物活性剂即Treg组成的组合物。药物组合物优选地包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(包括其组合)。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在药学领域是众所周知的，并且被描述在例如《雷明顿制药科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，马克出版公司(A.R.Gennaro编辑，1985年)。药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期的给药途径和标准药学实践进行选择。药物组合物可以包含作为载体、赋形剂或稀释剂的或除载体、赋形剂或稀释剂之外的任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂或增溶剂。

“药学上可接受的”包括制剂是无菌的和无热原的。载体、稀释剂和/或赋形剂必须是“可接受的”，即与Treg相容且对其受体无害。通常，载体、稀释剂和赋形剂将是无菌或无热原的盐水或输注介质，然而，也可以使用其他可接受的载体、稀释剂和赋形剂。

药学上可接受的载体的实例包括例如水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、香料油、脂肪酸单甘油酯和甘油二酯、石油乙基脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

本发明的Treg或药物组合物可以以适合于治疗和/或预防本文所述疾病的方式施用。尽管适当的剂量可以通过临床试验来确定，然而施用的量和频率将由诸如受试者的状况、受试者疾病的类型和严重性之类的因素来确定。可以相应地配制药物组合物。

如本文所述的Treg或药物组合物可以肠胃外施用，例如静脉内施用，或者Treg或药物组合物可以通过输注技术施用。Treg或药物组合物可以以无菌水溶液的形式施用，无菌水溶液可以包含其他物质，例如足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗。水溶液可以合适地缓冲(优选至pH为3至9)。可以相应地配制药物组合物。无菌条件下合适的肠胃外制剂的制备可以通过本领域技术人员众所周知的标准制药技术容易地完成。

药物组合物可以在输注介质例如无菌等渗溶液中包含本发明的Treg。药物组合物可以被封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。

Treg或药物组合物可以单剂量或多剂量施用。特别地，Treg或药物组合物可以以单次、一次性剂量施用。可以相应地配制药物组合物。

药物组合物可以进一步包含一种或多种活性剂。

药物组合物可以进一步包含一种或多种其他治疗剂，例如淋巴衰竭剂(例如胸腺细胞球蛋白、campath-1H、抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、环磷酰胺、氟达拉滨)、mTOR的抑制剂(例如西罗莫司、依维莫司)、抑制共刺激途径的药物(例如抗CD40/CD40L、CTAL4Ig)和/或抑制特定细胞因子的药物(IL-6、IL-17、TNFalpha、IL18)。

根据疾病和待治疗的受试者以及给药途径，可以以不同的剂量(例如以细胞/kg或细胞/受试者来测量)施用Treg或药物组合物。在任何情况下，医生将确定最适合任何个体受试者的实际剂量，并且实际剂量将随特定受试者的年龄、体重和反应而变化。然而，通常，对于本发明的Treg，每个受试者可以施用5×10

可以合适地修饰Treg以用于药物组合物。例如，Treg可以在被注入到受试者体内之前在适当时间将其冷冻保存并解冻。

本发明进一步包括包括本发明的Treg和/或药物组合物的试剂盒的用途。优选地，所述试剂盒用于本文所述的方法和用途，例如本文所述的治疗方法。优选地，所述试剂盒包括试剂盒组分的使用说明。

治疗方法

本发明提供一种用于诱导对移植物的耐受性、治疗和/或预防细胞和/或体液移植排斥反应、治疗和/或预防移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性或过敏性疾病、或促进组织修复和/或组织再生或者改善继发于代谢紊乱的慢性炎症的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的工程化Treg或药物组合物的步骤。

如本文所用，“诱导对移植物的耐受性”是指诱导对受体中的移植器官的耐受性。换句话说，诱导对移植物的耐受性意味着降低受体对供体移植器官的免疫应答水平。诱导对移植器官的耐受性可以减少移植受体所需的免疫抑制药物的量，或者可以使免疫抑制药物停用。

例如，可以将工程化Treg施用于患有疾病的受试者，以减轻、减少或改善疾病的至少一种症状，例如黄疸、溺赤、瘙痒、腹部肿胀或压痛、疲劳、恶心或呕吐和/或食欲不振。至少一种症状可以减轻、减少或改善至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，或者至少一种症状可以完全缓解。

可以将工程化Treg施用于患有疾病的受试者，以减慢、减少或阻止疾病的进展。与未施用工程化Treg的受试者相比，疾病的进展可以减慢、减少或阻断至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，或者疾病的进展可以完全停止。

在一个实施方案中，所述受试者是经受免疫抑制疗法的移植受体。

合适地，受试者是哺乳动物。合适地，受试者是人类。

移植物可以选自肝、肾、心脏、肺、胰腺、肠、胃、骨髓、血管化复合组织移植物和皮肤移植物。

合适地，CAR可以包含能够与存在于移植(移植物)供体中但不存在于移植(移植物)受体中的HLA抗原特异性结合的抗原结合域。

合适地，该移植物是肝移植物。在其中移植物是肝移植物的实施方案中，抗原可以是存在于移植的肝中但不存在于患者体内的HLA抗原，诸如NTCP之类的肝特异性抗原或在排斥过程中表达上调的抗原，诸如CCL19、MMP9、SLC1A3、MMP7、HMMR、TOP2A、GPNMB、PLA2G7、CXCL9、FABP5、GBP2、CD74、CXCL10、UBD、CD27、CD48和CXCL11。

合适地，抗原可以是HLA-A2。

本发明进一步提供一种用于治疗和/或预防移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫或过敏性疾病、或促进组织修复和/或组织再生或改善继发于代谢紊乱的慢性炎症的方法。

治疗疾病的方法涉及本发明的细胞的治疗用途。在这方面，可将细胞施用于患有现有疾病或病症的受试者，以减轻、减少或改善与该疾病有关的至少一种症状和/或减慢、减少或阻止该疾病的进展。

合适地，治疗和/或预防细胞和/或体液移植排斥可以指施用有效量的本发明的Treg，从而减少移植受体所需的免疫抑制药的量，或者可以使免疫抑制药停用。

预防疾病涉及预防性使用本发明的细胞。在这方面，可以将细胞施用于尚未患有该疾病和/或未显示出该疾病的任何症状的受试者，以预防该疾病或减少或预防与该疾病相关的至少一种症状的进展。受试者可能有患病倾向，或被认为有患病风险。

自身免疫或过敏性疾病可以选自：炎性皮肤疾病，包括牛皮癣和皮炎(例如特应性皮炎)；与炎症性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)相关的反应；皮炎；过敏性疾病，诸如食物过敏、湿疹和哮喘；类风湿关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)(包括狼疮性肾炎、皮肤性狼疮)；糖尿病(例如1型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病)；多发性硬化症和青少年型糖尿病。

合适地，本发明的治疗方法可以包括向受试者施用根据本发明的工程化Treg，或通过根据本发明的方法可获得的(例如，获得的)工程化Treg，或如本文定义的多核苷酸或载体(例如，在如上所述的药物组合物中)的步骤。

合适地，本发明用于治疗和/或预防疾病的方法可以包括向受试者施用根据本发明的工程化Treg(例如，在如上所述的药物组合物中)。

该方法可能涉及以下步骤：

(i)分离含细胞的样本或提供含细胞的样本；

(ii)将本文定义的多核苷酸或载体引入细胞；以及

(iii)将来自(ii)的细胞施用于受试者。

合适地，细胞是如本文定义的Treg。

合适地，可以在方法的步骤(ii)之前和/或之后，从含有细胞的样本中分离和/或产生富集Treg群。

例如，可以在步骤(ii)之前和/或之后进行分离和/或产生，以分离和/或产生富集Treg样本。可以在步骤(ii)之后进行富集以富集包含本发明的CAR、多核苷酸和/或载体的细胞和/或Treg。

合适地，可以通过转导引入多核苷酸或载体。合适地，可以通过转染引入多核苷酸或载体。

合适地，细胞可以是自体的。合适地，细胞可以是同种异体的。

合适地，可以将工程化Treg与一种或多种其他治疗剂组合施用，例如淋巴衰竭剂(例如胸腺细胞球蛋白、campath-1H、抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、环磷酰胺、氟达拉滨)、mTOR的抑制剂(例如西罗莫司、依维莫司)、抑制共刺激途径的药物(例如抗CD40/CD40L、CTAL4Ig)和/或抑制特定细胞因子的药物(IL-6、IL-17、TNFalpha、IL18)。可以将工程化Treg与一种或多种其他治疗剂同时或相继(即在其之前或之后)施用。

合适地，受试者是哺乳动物。合适地，所述受试者是人类。

可以在引入编码本文所述的CAR的多核苷酸之前或之后活化和/或扩增Treg，例如通过用抗CD3单克隆抗体或抗CD3和抗CD28单克隆抗体两者进行处理。

还可以在抗CD3和抗CD28单克隆抗体与IL-2结合存在的情况下扩增Treg。合适地，IL-2可以被IL-15代替。可以在Treg扩增方案中使用的其他组分包括但不限于雷帕霉素、全反式视黄酸(ATRA)和TGFβ。

如本文所用的“活化”是指Treg或Treg群被刺激，从而导致Treg增殖。如本文所用的“扩增”是指Treg或Treg群已经被诱导而增殖。Treg群的扩增可以例如通过计数群中存在的Treg的数量来测量。Treg的表型可以通过本领域已知的方法例如流式细胞术来确定。

可以在方法的每个步骤之后，特别是在扩增之后，洗涤Treg。

通过本领域技术人员已知的任何方法，例如通过FACS或磁珠分选，可以进一步富集根据本发明的工程化Treg细胞的群。

生产方法的步骤可以在封闭且无菌的细胞培养系统中进行。

多核苷酸

本发明的多核苷酸可以包括DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。技术人员将理解的是，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸可以编码相同的多肽。另外，应当理解的是，技术人员可以使用常规技术，进行不影响由本发明多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸替换，以反映本发明多肽将在其中表达的任何特定宿主生物的密码子使用。

可以通过本领域可用的任何方法修饰多核苷酸。可以进行此类修饰以增强本发明多核苷酸的体内活性或寿命。诸如DNA多核苷酸之类的多核苷酸可以通过重组、合成或者通过本领域技术人员可获得的任何方式产生。它们也可以通过标准技术进行克隆。

通常将使用重组手段，例如使用聚合酶链反应(PCR)克隆技术来产生更长的多核苷酸。这将涉及在期望克隆的靶序列的侧翼上制作一对引物(例如约15至30个核苷酸)，使引物与从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA接触，在引起所需区域扩增的条件下进行聚合酶链反应，分离扩增的片段(例如通过用琼脂糖凝胶纯化反应混合物)并回收扩增的DNA。所述引物可以被设计成包含合适的限制酶识别位点，从而可以将扩增的DNA克隆到合适的载体中。

本发明的多核苷酸可以进一步包含编码选择标记的核酸序列。合适地选择标记是本领域众所周知的，包括但不限于荧光蛋白-例如GFP。合适地，选择标记可以是荧光蛋白，例如GFP、YFP、RFP、tdTomato、dsRed或其变体。在一些实施方案中，荧光蛋白是GFP或GFP变体。编码选择标记的核酸序列可以以核酸结构形式与编码本发明的CAR的核酸序列组合提供。这样的核酸结构可以在载体中提供。

合适地，选择标记/报告结构域可以是基于荧光素酶的报告子，PET报告子(例如，碘化钠转运体(NIS))或膜蛋白(例如，CD34、低亲和性神经生长因子受体(LNGFR))。

编码CAR和选择标记的核酸序列可以被共表达位点分离，该共表达位点使得每种多肽能够以离散实体的形式表达。合适的共表达位点是本领域已知的，并且包括例如内部核糖体进入位点(IRES)和自切割肽。

其他合适的共表达位点/序列包括自切割或切割结构域。这样的序列可以在蛋白质生产过程中自动切割，或者可以被细胞内存在的常见酶切割。因此，在多肽序列中包含这种自切割或切割结构域可使第一多肽和第二多肽表达为单个多肽，随后其被切割以提供离散的、分离的功能性多肽。

合适的自切割或切割结构域包括但不限于如SEQ ID NO:46-51所示的那些。

(SEQ ID NO:46)P2A肽–切割域：GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP

(SEQ ID NO:47)T2A肽–切割域：GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP

(SEQ ID NO:48)E2A肽–切割域：GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP

(SEQ ID NO:49)F2A肽–切割域：GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP

(SEQ ID NO:50)弗林蛋白酶位点–切割域：RXXR(优先地：RRKR–SEQ ID NO:51)。

选择标记的使用是有利的，因为它允许使用常规方法，例如流式细胞术从起始细胞群中选择并分离出已经成功引入本发明的多核苷酸或载体(使得编码的CAR被表达)的Treg。

密码子优化

本发明中使用的多核苷酸可以是密码子优化的。密码子优化先前已经在WO 1999/41397和WO 2001/79518中进行了描述。不同的细胞在使用特定密码子上会有所不同。该密码子偏好对应于细胞类型中特定tRNA相对丰度的偏好。通过改变序列中的密码子，使密码子适合相应的tRNA的相对丰度，可以增加表达。同样，可以通过刻意选择特定细胞类型中已知罕见的相应tRNA的密码子来降低表达。因此，可获得附加程度的平移控制。

载体

载体是一种允许或促进实体从一种环境转移到另一种环境的工具。根据本发明，举例来说，重组核酸技术中使用的一些载体允许将诸如核酸片段的实体(例如异源DNA片段，如异源cDNA片段)转移到靶细胞中。载体可以是非病毒的或者是病毒的。重组核酸技术中使用的载体的实例包括但不限于质粒、mRNA分子(例如体外转录的mRNA)、染色体、人工染色体和病毒。载体也可以是例如裸核酸(例如DNA)。以最简单的形式，载体本身可以是感兴趣的核苷酸。

本发明所使用的载体可以是例如质粒、mRNA或病毒载体，并且可以包含用于表达多核苷酸的启动子和任选地该启动子的调节子。

可以使用本领域已知的多种技术，例如转化和转导，将包含本发明的多核苷酸的载体引入到细胞中。本领域已知几种技术，例如用重组病毒载体感染，例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒和单纯疱疹病毒载体；核酸直接注射和基因枪转化。

非病毒递送系统包括但不限于DNA转染方法。在此，转染包括使用非病毒载体将基因递送至靶细胞的过程。非病毒递送系统可以包括脂质体或两亲性细胞穿透肽，优选与本发明的多核苷酸复合。

典型的转染方法包括电穿孔、DNA基因枪、脂质介导的转染、压缩DNA介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂质体转染、阳离子试剂介导的转染、阳离子表面两亲物(CFA)(Nat.Biotechnol(1996年)14：556)及其组合。

编码本发明的不同CAR或编码本发明CAR的多个载体和另一种多肽可以用于转导/转染。

制备细胞的方法

可以通过多种方式之一来引入编码本文定义的CAR的DNA或RNA来产生本发明的工程化Treg，所述多种方式包括用病毒载体转导、用DNA或RNA转染。

本发明的细胞可通过以下方法制备：将本文定义的多核苷酸或载体引入细胞(例如通过转导或转染)。

合适地，该细胞可以来自从受试者分离出来的样本。

本发明的工程化Treg可以通过包括以下步骤的方法产生：

(i)从受试者分离含细胞的样本或提供含细胞的样本；以及

(ii)用编码本发明的CAR的多核苷酸、核酸或载体转导或转染含细胞的样本，以提供工程化细胞的群。

合适地，在该方法的步骤(ii)之前和/或之后，可以从含细胞的样本中分离、富集和/或产生富含Treg的样本。例如，可以在步骤(ii)之前和/或之后进行Treg的分离、富集和/或产生，以分离，富集或产生富含Treg的样本。可以在步骤(ii)之后进行分离和/或富集，以富集包含本发明的CAR、多核苷酸和/或载体的细胞和/或Treg。

可以通过本领域技术人员已知的任何方法，例如通过FACS和/或磁珠分选来分离或富集富含Treg的样本。富含Treg的样本可以通过本领域技术人员已知的任何方法从含有细胞的样本中产生，例如通过引入编码FOXP3的DNA或RNA从Tcon细胞中产生，和/或从可诱导祖细胞或胚胎祖细胞的体外分化中产生。

合适地，细胞是如本文定义的Treg。

合适地，本发明的工程化Treg可以通过包括以下步骤的方法产生：

(i)从受试者分离富含Treg的样本或提供富含Treg的样本；以及

(ii)用编码本发明的CAR的多核苷酸、核酸或载体转导或转染富含Treg的样本，以提供根据本发明的工程化Treg细胞的群。

本公开内容不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些方法或材料类似或等同的任何方法和材料都可以用于本公开的实施方案的实践或测试。数值范围包括定义范围的数字。除非另有说明，任何核酸序列都以5'至3'的方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基的方向从左至右进行书写。

在提供数值范围的情况下，应理解的是，除非上下文另外明确指出，还具体公开了介于该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限的单元的十分之一。在公开范围内的任何指定值或中间值与该指定范围内的任何其他指定值或中间值之间的每个较小范围都包括在本公开的范围内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含或排除在该范围内，并且其中任一极限都包括在较小的范围内、两个极限都不包括在较小的范围内或两个极限都包括在较小的范围内的每个范围也包含在本公开内容的范围内，受制于所述范围中任何具体排除的极限。在所述范围包括一个或两个极限的情况下，排除这些包括的极限中的一个或两个的范围也包括在本公开内容的范围内。

必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的那样，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。

如本文所用，术语“包含(comprising)”、“包括(comprises)”和“包括(comprisedof)”与“包括(including)”、“包括(includes)”或“含有(containing)”、“包含(contains)”同义，并且是包括性的或开放式的，并且不排除额外的、未引用的成员、元件或方法步骤。术语“包含(comprising)”、“包括(comprises)”和“包括(comprised of)”也包括术语“组成(consisting of)”。

本文讨论的出版物仅用于在本申请的申请日之前的公开。本文中的任何内容都不应被解释为承认这些出版物构成所附权利要求的现有技术。

现在将通过实施例来进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域的普通技术人员实施本发明，并且不以任何方式限制本发明的范围。

现在将通过实施例来进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域的普通技术人员实施本发明，并且不以任何方式限制本发明的范围。

实施例

分离出CD4

在细胞活化后的不同时间点，分析未转导的Treg和用CAR构建体转导的Treg上的GFP表达。

分析GFP+细胞的频率，以评估不同构建体在Treg扩增期间的转导效率和表达持久性。含有dCAR、CD28z、构建体1、构建体2和构建体3的Treg在转导后显示相似的表达频率。在多克隆细胞扩增期间，整个Treg中GFP+细胞的百分比得以维持(图4)。

通过PE缀合的HLA-A*0201/CINGVCWTV右旋体(Immudex，哥本哈根，丹麦)分析了未转导的和转导的Treg上的CAR构建体的膜表达。所有构建体之间在细胞表面表达CAR蛋白的Treg的频率(HLA-A2右旋体

在抗CD3/CD28激活珠和IL-2的存在下培养并扩增Treg15天。在培养的第15天，通过FACS对未转导的和转导的Treg上的Treg相关标志物FOXP3、HELIOS、CTLA4和TIGIT进行分析，以评估表型谱系的稳定性。

多克隆扩增后，未转导的和转导CAR的显示出与Treg谱系和功能相关的蛋白的相似表达水平(图6)。

未转导的和转导的Treg在不同刺激的存在下培养18小时。分析CD69和CD137激活标志物以评估特异性和非特异性细胞活化。

基于T细胞活化标志物的表达，用CD28z、构建体1、构建体2和构建体3CAR转导的Treg对HLA-A2分子显示出相似的特异性。CD69和CD137的表达在灭活细胞上没有增加或与表达HLA-A1的细胞培养后没有增加。由于缺少信号传导胞内域，dCAR构建体未显示激活作用(图7)。

将转导的CAR Treg在不含IL2的培养基中静置过夜。用单独的培养基、1000IU/ml的IL-2或在基于HLA.A2-Ig的人工APC(按照DOI：10.3791/2801中描述的方案生成)的存在下培养10分钟和120分钟后，通过FACS分析评估Treg的STAT5磷酸化。

IL2R胞内域整合到CAR构建体中显示出HLA-A2分子激活CAR后STAT5的有效磷酸化。在用HLA-A2珠培养后，在没有IL2R胞内域的CAR-Treg上未检测到pSTAT5的显著增加(图8)。

在不存在IL-2的情况下，用抗CD3/28激活珠和K562.A2表达细胞培养具有不同构建体的CAR转导的Treg。活化后7天通过FACS分析评估细胞存活。

在用HLA-A2表达细胞进行细胞培养后，表达包含IL2R胞内域的CAR构建体的Treg与参考CD28z相比显示出增加的细胞生存力。在Treg的多克隆激活后，未观察到这种差异，表明该作用取决于CAR信号传导(图9)。

分析与Treg共培养后CD80和CD86的B细胞表达，以评估Treg减少抗原呈递细胞上共刺激分子表达的能力。

与未转导或表达dCAR的Treg相比，表达CD28z、构建体1和构建体2CAR的Treg显示出增加的抑制功能。CD80和CD86在B细胞上的表达只有在用Treg培养后才下调，所述Treg通过CAR分子发出信号(图10)。

以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和主旨的情况下，本发明所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解的是，所要求保护的本发明不应不适当地局限于这些特定实施方案。实际上，对于分子生物学或相关领域的技术人员来说显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在落入下述权利要求的范围内。