一种表达双报告标签的重组副流感病毒5型

技术领域

本发明属于重组病毒构建技术领域，具体涉及一种表达双报告标签的重组副流感病毒5型。

背景技术

副流感病毒5型(parainfluenza virus 5，PIV5)，旧称“猴病毒5型”，属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)、正腮腺炎病毒属(Orthorubulavirus)成员。PIV5基因组为单股、负链、线性的RNA，全长15246nt，包含七个非重叠基因，顺序依次为3′-NP-V/P-M-F-SH-HN-L-5′，其中P基因包含V基因，对应编码V蛋白(非结构蛋白)。病毒经纯化后电镜下观察形状不定，但多呈球形或椭球形，外披脂质囊膜，囊膜外表面嵌有铆钉状纤突。囊膜内表面紧邻基质蛋白，其单体之间相互作用构成了整个病毒的外骨架，内部则含有鲱鱼骨状螺旋型核衣壳。

PIV5可感染多种哺乳动物，如牛、猪、犬等，也包括能感染人。该病毒除了引起狗的犬窝咳之外，通常不能导致其他易感动物表现出临床症状。另外，PIV5可感染多种细胞系，如Vero细胞、BHK细胞、MDBK细胞等，但通常不引起或只引起轻微的细胞病变，这便在多个方面限制了PIV5的应用，如病毒滴度测定。而表达荧光标签的重组PIV5，由于具有实时荧光指示作用，因此可以解决野生型病毒不诱导细胞病变所带来的限制。

发明内容

本发明目的是提供一种共表达增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescence protein，eGFP)和NanoLuc萤光素酶(NanoLuc luciferase,NLuc)的重组副流感病毒5型PIV5(rPIV5-GN)，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种用于拯救共表达eGFP和NLuc的重组PIV5核酸片段(rPIV5-GNcDNA clone)，所述核酸片段的结构如下：5′-NP-V/P-eGFP-T2A-NLuc-M-F-SH-HN-L-3′；其中，NP、V/P、M、F、SH、HN、L为PIV5病毒的自身基因；eGFP-T2A-NLuc为插入的融合序列；eGFP-T2A-NLuc的上游包含M基因起始序列(M GS)和Pme I酶切位点，下游包含Not I酶切位点及V/P基因终止序列(V/P GE)；

作为实施例的一种具体记载，所述重组PIV5核酸片段的序列为SEQ IDNO:1；

本发明所提供的核酸片段用于在细胞内拯救能够共表达eGFP和NLuc的重组副流感病毒5型；

所述的细胞为BSR-T7/5细胞和Madin-Darby bovine kidney(MDBK)细胞，两者分别用于重组病毒的拯救和传代；

本发明再一个方面提供一种能够共表达eGFP和NLuc的重组副流感病毒5型，所述的病毒是使用共表达eGFP和NLuc的重组PIV5核酸片段的重组质粒在细胞内拯救获得的。

本发明还提供用于检测所述的重组副流感病毒5型的引物对，其上游引物的序列为5′-GCAATCATCCGCAGTGCAATTTGA-3′；

下游引物的序列为5′-TGCGGGAATGCTGATGGATGGCAT-3′。

本发明通过反向遗传技术拯救的rPIV5-GN在细胞内对于eGFP及NLuc的表达水平较高。eGFP的表达可直接通过荧光显微镜观察；Nluc的表达在发光底物作用下，黑暗环境中可发出肉眼可见的淡蓝色荧光。且本发明的eGFP-T2A-NLuc融合序列在病毒传代过程中稳定。

附图说明

图1：eGFP-T2A-NLuc融合蛋白序列模式图。

图2：rPIV5-GN cDNA clone模式图。

图3：三个辅助质粒模式图。

图4：四质粒共转染BSR-T7/5细胞42h图。

图5：共转染60h荧光素酶活性检测图。

图6：rPIV5-GN拯救后MDBK细胞连续传代图。

图7：第七代rPIV5-GN感染48h荧光素酶活性检测图。

图8：第七代rPIV5-GN的RT-PCR及PCR分析图。

图9：第八代rPIV5-GN蛋白质谱分析图。

图10：rPIV5-GN感染MDBK细胞噬斑分析图。

图11：第七代rPIV5-GN生长曲线图。

图12：第七代rPIV5-GN对NLuc表达的动力学曲线图。

图13：第16、18、20代rPIV5-GN对eGFP的表达图。

图14：第16、18、20代rPIV5-GN的荧光素酶活性检测图。

图15：第16、18、20代rPIV5-GN的RT-PCR检测图。

具体实施方式

本发明所涉及的eGFP是目前应用较为广泛的荧光蛋白标签，开放阅读框(openreading frame,ORF)长度为720bp。NLuc是一个经基因工程改造的新型小分子酶，分子量为19.1kD。NLuc可催化一种新型底物furimazine，从而产生高强度、辉光型发光现象。NLuc催化的生物发光反应不依赖ATP，自发光背景低，光信号较传统荧光素显著增强，同时抑制背景发光，可获得极高检测灵敏度。NLuc作为一种荧光示踪蛋白(Genbank登录号：MH037010)，因ORF较短(516bp)，因此极大方便了基因操作。

Thosea asigna virus 2A(T2A)为自剪切肽，完整序列为“EGRGSLLTCGDVEENPG↓P”，其通过核糖体跳跃机制进行自我“剪切”，“↓”所示为自剪切位点。因此T2A序列可作为Linker连接两个外源蛋白，当融合蛋白在宿主细胞内表达，由于核糖体跳跃机制，融合蛋白将被“剪切”，形成两个独立行使生物学功能的蛋白。

本发明构建了一种含eGFP-T2A-NLuc融合序列的rPIV5-GN cDNA clone，将其与分别表达PIV5 NP、P、L蛋白的真核表达质粒共转染BSR-T7/5细胞，成功拯救了rPIV5-GN，进而对重组病毒进行鉴定及特性分析。

以下通过实施例来进一步阐明本发明，但是应理解，所述实施例只是举例说明目的，本发明的保护范围并不仅限于说明书的具体实施例的记载。

实施例1、rPIV5-GN cDNA clone的构建

本实施例首先构建eGFP-T2A-NLuc融合蛋白序列，上游包含M基因起始序列(M GS)和Pme I酶切位点，下游包含Not I酶切位点及V/P基因终止序列(V/P GE)。eGFP-T2A-NLuc融合蛋白序列如图1所示，箭头所示为自剪切位点。在此基础上构建用于拯救共表达eGFP和NLuc的重组PIV5核酸片段rPIV5-GN cDNA clone。该片段呈“5′-NP-V/P-eGFP-T2A-NLuc-M-F-SH-HN-L-3′”分布(图2)。其中NP、V/P、M、F、SH、HN、L基因为PIV5毒株(GenBank:NC_006430.1)的相关基因；eGFP为增强型绿色荧光蛋白ORF；T2A为自剪切肽序列；NLuc为NanoLuc荧光素酶的ORF。

本实施例构建的rPIV5-GN cDNA clone的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

将核苷酸序列为SEQ ID NO:1的rPIV5-GN cDNA clone的全长序列进行核酸合成，亚克隆至pBR322质粒上。这样在pBR322质粒上，rPIV5-GN cDNA clone上游受T7启动子序列调控，下游受丁肝病毒核酶及T7终止子序列调控。

实施例2、rPIV5-GN的拯救

复苏BSR-T7/5细胞，在DMEM培养基中传代2次，DMEM培养基包含penicillin(100U/mL)、streptomycin(100μg/mL)、amphotericin B(0.25μg/mL)、G418(500μg/mL)及10％FBS(fetal bovine serum)。转染前一天，在12孔板中接种BSR-T7/5细胞，次日待细胞达到70％汇合度，将rPIV5-GN cDNA clone质粒及三个辅助质粒(图3)共转染BSR-T7/5细胞，四者每孔的转染量分别为2μg、1μg、0.5μg、0.5μg。按每孔加75μL Opti-MEM和8μLLipofectamine2000的比例配制溶液I。再按每孔加75μL Opti-MEM和4μg质粒配制溶液II。将溶液I和II轻柔混匀，室温放置15min以形成脂质体-DNA复合物。向细胞孔中逐滴加入脂质体-DNA混合液。将12孔板置于CO

实施例3、rPIV5-GN的鉴定

将拯救的rPIV5-GN在MDBK细胞中进行连续盲传，传至第七代。随着病毒盲传，eGFP达到了理想的表达水平，但整个传代过程中未观察到细胞病变(图6)。同时，第七代rPIV5-GN感染细胞48h后，也可高效表达NLuc(图7)。第7代病毒液冻融一次，收集上清提取总RNA，用于病毒的RT-PCR检测。上游引物序列：5′-GCAATCATCCGCAGTGCAATTTGA-3′，下游引物序列：5′-TGCGGGAATGCTGATGGATGGCAT-3′，预扩增1578bp片段。RT-PCR反应采用HighFidelity One Step RT-PCR Kit(Takara)，反应条件设定如下，45℃10min,94℃2min,经历30个循环：98℃(10s),55℃(15s),68℃(16s)。为消除残留质粒污染，另设PCR对照。PCR反应采用2×PrimeSTAR Max Premix(Takara)，反应条件设定为30个循环：98℃(10s),55℃(10s),72℃(16s)。RT-PCR和PCR反应结束后，同时进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图8所示，仅RT-PCR扩增出了特异性条带(1578bp)。第8代rPIV5-GN病毒液进行蛋白质谱分析，结果显示NP、P、M、F、HN、L蛋白皆可匹配特异性肽段图谱，其中L蛋白对应图谱如图9。

实施例4、rPIV5-GN空斑分析

将rPIV5-GN进行10倍连续稀释，并将其分别接种6孔板中的MDBK细胞，将培养板置于培养箱中孵育2h，吸弃病毒液，D-PBS润洗一遍，补加1％低熔点琼脂糖凝胶的DMEM(含10％FBS)，置于培养箱中培养72h，荧光显微镜下观察细胞。然后采用4％多聚甲醛固定细胞，0.2％结晶紫染色细胞，自来水轻柔冲洗后晾干6孔板，观察是否有空斑形成。结果表明，虽然eGFP可以高效表达，但病毒感染的细胞并未有空斑形成(图10)。

实施例5、rPIV5-GN生长动力学及NLuc表达动力学

将MDBK细胞接种五个12孔板(1.5×10

实施例6、rPIV5-GN的传代稳定性

将rPIV5-GN在MDBK细胞中连续传代(72h/代)，共计20代，每一代都可观察到eGFP的高效表达。第16、18及20代eGFP的表达情况如图13所示。收获第16、18及20代的病毒液，冻融一次后，进行荧光素酶活性分析，如图14所示，三个病毒子代皆可有效表达Nluc。同时采用上游(5′-GCAATCATCCGCAGTGCAATTTGA-3′)及下游(5′-TGCGGGAATGCTGATGGATGGCAT-3′)引物，对第16、18及20代的病毒液进行RT-PCR分析，结果如图15所示，三个病毒子代都扩增出了特异性目的片段(1578bp)。

上述结果表明，本发明方法制备的rPIV5-GN，其外源eGFP-T2A-NLuc融合序列在重组病毒传代过程中稳定存在。

尽管参考其示例性实施方案，对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离本发明说明书具体技术思路的情况下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种表达双报告标签的重组副流感病毒5型

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16662

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

accaagggga aaatgaagtg gtgactcaaa tcatcgaaga ccctcgagat tacataggtc 60

cggaacctat ggccttcgtg accgacctcg agtcagagta gttcaataag gacctatcaa 120

gtttgggcaa tttttcgtcc ccgacacaaa aatgtcatcc gtgcttaaag catatgagcg 180

attcacgctc actcaagaac tgcaagatca gagtgaggaa ggtacaatcc cacctacaac 240

actaaaaccg gtaatcaggg tatttatact aacctctaat aacccagagc taagatcccg 300

gcttcttcta ttctgcctac ggattgttct cagtaatggt gcaagggatt cccatcgctt 360

tggagcatta ctcacaatgt tttcgctacc atcagccaca atgctcaatc atgtcaaatt 420

agctgaccag tcaccagaag ctgatatcga aagggtagag atcgatggct ttgaggaggg 480

atcattccgc ttaatcccca atgcacgttc aggtatgagc cgtggagaga tcaatgccta 540

tgctgcactt gcagaagatc tacctgacac actaaaccat gcaacacctt tcgttgattc 600

cgaagtcgag ggaactgcat gggatgagat tgagactttc ttagatatgt gttacagtgt 660

cctaatgcag gcatggatag tgacttgcaa gtgcatgact gcgccagacc aacctgctgc 720

ttctattgag aaacgcctgc aaaaatatcg tcagcaaggc aggatcaacc cgagatatct 780

cctgcaaccg gaggctcgac gaataatcca gaatgtaatc cggaagggaa tggtggtcag 840

acatttcctc acctttgaac tgcagcttgc ccgagcacaa agccttgtat caaataggta 900

ttatgctatg gtaggggatg ttggaaagta tatagagaat tgtggaatgg gaggcttctt 960

tttgacacta aaatatgcat taggaactag atggcccaca cttgctttag ctgcattttc 1020

aggagagcta acaaagctaa agtccctcat ggcattatac cagacccttg gtgagcaggc 1080

ccgatatttg gccctattgg agtcaccaca tttgatggat tttgctgcag caaactaccc 1140

actgctatat agctatgcta tgggaatagg ctatgtgtta gatgtcaaca tgaggaacta 1200

cgctttctcc agatcataca tgaacaagac atatttccaa ttgggaatgg aaactgcaag 1260

aaaacaacag ggtgcagttg acatgaggat ggcagaagat ctcggtctaa ctcaagccga 1320

acgcaccgag atggcaaata cacttgccaa attgaccaca gcaaatcgag gggcagacac 1380

caggggagga gtcaacccgt tctcatctgt cactgggaca actcaggtgc ccgctgcagc 1440

aacaggtgac acactcgaga gttacatggc agcggatcga ctgaggcaga gatatgctga 1500

tgcaggcacc catgatgatg agatgccacc attggaagag gaggaagagg acgacacatc 1560

tgcaggtcca cgcactggac caactcttga acaagtggcc ttggacatcc agaacgcagc 1620

agttggagct cccatccata cagatgacct gaatgccgca ctgggtgatc ttgacatcta 1680

gacaattcag atcccaatct aaaattgaca tacctaattg attagttaga tggaactaca 1740

gtggattcca taaggttcct gcctaccatc ggctttaaag aaaaaaatag gcccggacgg 1800

gttagcaaca agcgactgcc ggtgccaaca gcgcaatcca caatctacaa tggatcccac 1860

tgatctgagc ttctccccag atgagatcaa taagctcata gagacaggcc tgaatactgt 1920

agagtatttt acttcccaac aagtcacagg aacatcctct cttggaaaga atacaatacc 1980

accaggggtc acaggactac taaccaatgc tgcagaggca aagatccaag agtcaactaa 2040

ccatcagaag ggctcagttg gtgggggtgc aaaaccaaag aaaccgcgac caaaaattgc 2100

cattgtgcca gcagatgaca aaacagtgcc cggaaagccg atcccaaacc ctctattagg 2160

tctggactcc accccgagca cccaaactgt gcttgatcta agtgggaaaa cattaccatc 2220

aggatcctat aagggggtta agcttgcgaa atttggaaaa gaaaatctga tgacacggtt 2280

catcgaggaa cccagagaga atcctatcgc aaccagttcc cccatcgatt ttaagagggg 2340

cagggatacc ggcgggttcc atagaaggga gtactcaatc ggatgggtgg gagatgaagt 2400

caaggtcact gagtggtgca atccatcctg ttctccaatc accgctgcag caaggcgatt 2460

tgaatgcact tgtcaccagt gtccagtcac ttgctctgaa tgtgaacgag atacttaata 2520

cagtgagaaa tttggactct cggatgaatc aactggagac aaaagtagat cgcattctct 2580

catctcagtc tctaatccag accatcaaga atgacatagt tggacttaaa gcagggatgg 2640

ctactttaga aggaatgatt acaactgtga aaatcatgga cccgggagtt cccagtaatg 2700

ttactgtgga agatgtacgc aagacactaa gtaaccatgc tgttgttgtg ccagaatcat 2760

tcaatgatag tttcttgact caatctgaag atgtaatttc acttgatgag ttggctcgac 2820

caactgcaac aagtgttaag aagattgtca ggaaggttcc tcctcagaag gatctgactg 2880

gattgaagat tacactagag caattggcaa aggattgcat cagcaaaccg aagatgaggg 2940

aagagtatct cctcaaaatc aaccaggctt ccagtgaggc tcagctaatt gacctcaaga 3000

aagcaatcat ccgcagtgca atttgatcaa gaaacaccca attacactac actggtatga 3060

cactgtacta accctgaggg ttttagaaaa aacgattaac gataaataag cccgaacact 3120

acacactacc tgaggcagcc gtttaaacat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg 3180

ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc 3240

cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac 3300

cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg 3360

cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga 3420

aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc 3480

cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt 3540

caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt 3600

ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa 3660

catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga 3720

cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga 3780

ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac 3840

tctcggcatg gacgagctgt acaaggaggg cagaggaagt ctgctaacat gcggtgacgt 3900

cgaggagaat cctggcccaa tggtcttcac actcgaagat ttcgttgggg actggcgaca 3960

gacagccggc tacaacctgg accaagtcct tgaacaggga ggtgtgtcca gtttgtttca 4020

gaatctcggg gtgtccgtaa ctccgatcca aaggattgtc ctgagcggtg aaaatgggct 4080

gaagatcgac atccatgtca tcatcccgta tgaaggtctg agcggcgacc aaatgggcca 4140

gatcgaaaaa atttttaagg tggtgtaccc tgtggatgat catcacttta aggtgatcct 4200

gcactatggc acactggtaa tcgacggggt tacgccgaac atgatcgact atttcggacg 4260

gccgtatgaa ggcatcgccg tgttcgacgg caaaaagatc actgtaacag ggaccctgtg 4320

gaacggcaac aaaattatcg acgagcgcct gatcaacccc gacggctccc tgctgttccg 4380

agtaaccatc aacggagtga ccggctggcg gctgtgcgaa cgcattctgg cgtagcggcc 4440

gctcaagaaa cacccaatta cactacactg gtatgacact gtactaaccc tgagggtttt 4500

agaaaaaacg attaacgata aataagcccg aacactacac actacctgag gcagccatgc 4560

catccatcag cattcccgca gaccccacca atccacgtca atcaataaaa gcgttcccaa 4620

ttgtgatcaa cagtgatggg ggtgagaaag gccgcttggt taaacaacta cgcacaacct 4680

acttgaatga cctagatact catgagccac tggtgacatt cataaatacc tatggattca 4740

tctacgaaca ggatcggggg aataccattg tcggagagga tcaacttggg aagaaaagag 4800

aggctgtgac cgctgcaatg gttacccttg gatgtgggcc taatctacca tcattaggga 4860

atgtcctggg acaactgagg gaattccagg tcactgttag gaagacatcc agcaaagcgg 4920

aagagatggt ctttgaaatt gttaagtatc cgagaatatt tcggggtcat acattaatcc 4980

agaaaggact agtctgtgtc tccgcagaaa aatttgttaa gtcaccaggg aaaatacaat 5040

ctggaatgga ctatctcttc attccgacat ttctgtcagt gacttactgt ccagctgcaa 5100

tcaaatttca ggtacctggc cccatgttga aaatgagatc aagatacact cagagcttac 5160

aacttgaact aatgataaga atcctgtgta agcccgattc gccacttatg aaggtccata 5220

cccctgacaa ggagggaaga ggatgtcttg tatcagtatg gctgcatgta tgcaacatct 5280

tcaaatcagg aaacaagaat ggcagtgagt ggcaggaata ctggatgaga aagtgtgcta 5340

acatgcaact tgaagtgtcg attgcagata tgtggggacc aactatcata attcatgcca 5400

gaggtcacat tcccaaaagt gctaagttgt tttttggaaa gggtggatgg agctgccatc 5460

cacttcacga agttgttcca agtgtcacta aaacactatg gtccgtgggc tgtgagatta 5520

caaaggcgaa ggcaataata caagagagta gcatctctct tctcgtggag actactgaca 5580

tcataagtcc aaaagtcaaa atttcatcta agcatcgccg ctttgtgaaa tcaaattggg 5640

gtctgttcaa gaaaactaaa tcactgccta acctgacgga gctggaatga ctgacctcta 5700

atcgagacta caccgccgca aactataggt gggtggtacc tcagtgatta atcttgtaag 5760

cactgatcgt aggctacaac acactaatat tatccagatt agagagctta attagctctg 5820

tattaataat aacactacta ttccaataac tggaatcacc agcttgattt atctccaaaa 5880

tgattcaaag aaaacaaatc atattaagac tatcctaagc acgaacccat atcgtccttc 5940

aaatcatggg tactataatt caatttctgg tggtctcctg tctattggca ggagcaggca 6000

gccttgatcc agcagccctc atgcaaatcg gtgtcattcc aacaaatgtc cggcaactta 6060

tgtattatac tgaggcctca tcagcattca ttgttgtgaa gttaatgcct acaattgact 6120

cgccgattag tggatgtaat ataacatcaa tttcaagcta taatgcaaca gtgacaaaac 6180

tcctacagcc gatcggtgag aatttggaga cgattaggaa ccagttgatt ccaactcgga 6240

ggagacgccg gtttgcaggg gtggtgattg gattagctgc attaggagta gctactgccg 6300

cacaggtcac tgccgcagtg gcactagtaa aggcaaatga aaatgctgcg gctatactca 6360

atctcaaaaa tgcaatccaa aaaacaaatg cagcagttgc agatgtggtc caggccacac 6420

aatcactagg aacggcagtt caagcagttc aagatcacat aaacagtgtg gtaagtccag 6480

caattacagc agccaattgt aaggcccaag atgctatcat tggctcaatc ctcaatctct 6540

atttgaccga gttgacaacc atcttccaca atcaaattac aaaccctgca ttgagtccca 6600

ttacaattca agctttaagg atcctactgg ggagtacctt gccgactgtg gtcgaaaaat 6660

ctttcaatac ccagataagt gcagctgagc ttctctcatc agggttattg acaggccaga 6720

ttgtgggatt agatttgacc tatatgcaga tggtcataaa aattgagctg ccaactttaa 6780

ctgtacaacc tgcaacccag atcatagatc tggccaccat ttctgcattc attaacaatc 6840

aagaagtcat ggcccaatta ccaacacgtg ttatggtgac tggcagcttg atccaagcct 6900

atcccgcatc gcaatgcacc attacaccca acactgtgta ctgtaggtat aatgatgccc 6960

aagtactctc agatgatact atggcttgcc tccaaggtaa cttgacaaga tgcaccttct 7020

ctccagtggt tgggagcttt ctcactcgat tcgtgctgtt cgatggaata gtttatgcaa 7080

attgcaggtc gatgttgtgc aagtgcatgc aacctgctgc tgtgatccta cagccgagtt 7140

catcccctgt aactgtcatt gacatgtaca aatgtgtgag tctgcagctt gacaatctca 7200

gattcaccat cactcaattg gccaatgtaa cctacaatag caccatcaag cttgaatcat 7260

cccagatctt gtctattgat ccgttggata tatcccaaaa tctagctgcg gtgaataaga 7320

gtctaagtga tgcactacaa cacttagcac aaagtgacac atatctttct gcaatcacat 7380

cagctacgac tacaagtgta ttatccataa tagcaatctg tcttggatcg ttaggtttaa 7440

tattaataat cttgctcagt gtagttgtgt ggaagttatt gaccattgtc gttgctaatc 7500

gaaatagaat ggagaatttt gtttatcata aataagcatt ccaccactca cgatctgatc 7560

tcagtgagaa aaatcaacct gcaactcttg gaacaagata agacagtcat ccattagtaa 7620

tttttaagaa aaaaacgata ggaccgaacc tagtattgaa agaaccgtct cggtcaatct 7680

aggtaatcga gctgataccg tctcggaaag ctcaaatcat gctgcctgat ccggaagatc 7740

cggaaagcaa gaaagctaca aggagagcag gaaacctaat tatctgcttc ctattcatct 7800

tctttctgtt tgtaaccttc attgttccaa ctctaagaca cttgctgtcc taacacctgc 7860

tataggctat ccactgcatc atctctcctg ccatacttcc tactcacatc atatctattt 7920

taaagaaaaa ataggcccga acactaatcg tgccggcagt gccactgcac acacaacact 7980

acacatacaa tacactacaa tggttgcaga agatgcccct gttagggcca cttgccgagt 8040

attatttcga acaacaactt taatctttct atgcacacta ctagcattaa gcatctctat 8100

cctttatgag agtttaataa cccaaaagca aatcatgagc caagcaggct caactggatc 8160

taattctgga ttaggaagta tcactgatct tcttaataat attctctctg tcgcaaatca 8220

gattatatat aactctgcag tcgctctacc tctacaattg gacactcttg aatcaacact 8280

ccttacagcc attaagtctc ttcaaaccag tgacaagcta gaacagaact gctcgtggag 8340

tgctgcactg attaatgata atagatacat taatggcatc aatcagttct atttttcaat 8400

tgctgagggt cgcaatctga cacttggccc acttcttaat atgcctagtt tcattccaac 8460

tgccacgaca ccagagggct gcaccaggat cccatcattc tcgctcacta agacacactg 8520

gtgttataca cacaatgtta tcctgaatgg atgccaggat catgtatcct caaatcaatt 8580

tgtttccatg ggaatcattg aacccacttc tgccgggttt ccattctttc gaaccctaaa 8640

gactctatat ctcagcgatg gggtcaatcg taagagctgc tctatcagta cagttccggg 8700

gggttgtatg atgtactgtt ttgtttctac tcaaccagag agggatgact acttttctgc 8760

cgctcctcca gaacaacgaa ttattataat gtactataat gatacaatcg tggagcgcat 8820

aattaatcca cccggggtac tagatgtatg ggcaacattg aacccaggaa caggaagcgg 8880

ggtatattat ttaggttggg tgctctttcc aatatatggc ggcgtgatta aaggtacgag 8940

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gtgtttagtt ctgccctttt ctaatgatca ggtgcttatg ggtgctgaag ggagattata 9180

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tcccggtttt tgcttgacag gagtgtatgc cgatgcctgg ttactgacca acccttcgtc 9420

taccagtaca tttggatcag aagcaacctt cactggttct tatctcaaca cagcaactca 9480

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