一种皮肤衰老蛋白标志物—CERU蛋白及其无创性提取方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种皮肤衰老蛋白标志物—CERU蛋白及其无创性提取方法。

背景技术

皮肤老化，也即皮肤衰老，是指皮肤功能衰老性损伤，使皮肤对机体的防护能力，调节能力等减退，由此皮肤不能适应内外环境的变化，出现颜色、色泽、形态、质感等外观整体状况的改变。皮肤的老化分为内源性老化和外源性老化。内源性老化是指皮肤随年龄增长的自然老化。表现为皮肤变白，出现细小皱纹、弹性下降、皮肤松弛等。外源性老化的最主要原因是日晒所致的光老化。表现为皱纹、皮肤松弛、粗糙、淡黄或灰黄色的皮肤变色、毛细血管扩张、色素斑形成等。

随着人们生活水平的提高，人们越来越重视皮肤保养，但通常只是关注皮肤衰老的外在表现，比如皱纹、色斑、以及毛孔粗细程度等信息，并由此来判断皮肤的衰老程度，这种判断皮肤衰老程度的方法不能从根源上找到导致皮肤衰老的内在因素，无法在皮肤老化外在表现出现前提前干预皮肤衰老，另外正确判断皮肤的衰老程度以及判断衰老的生理年龄是否与实际年龄相符，也是美容或者医学美容的前提。

CP：铜蓝蛋白是一种蓝色的，铜结合的(每分子6-7个原子)糖蛋白,也是一种重要的抗氧化剂,它可以防止自由基的产生。并且与铁死亡代谢途径相关，在我们的研究中在衰老人群中上调。它具有将Fe

CER具有氧化酶的活性，对多酚及多胺类底物有催化其氧化的能力。最近研究认为CER可催化Fe

近年来另一研究结果认为CER起着抗氧化剂的作用。在血循环中CER的抗氧化活力可以防止组织中脂质过氧化物和自由基的生成，特别在炎症时具有重要意义。

目前没有将CERU蛋白(铜蓝蛋白)用于辅助判断皮肤衰老程度的先例。

发明内容

一种无创提取皮肤中CERU蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；

(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；

3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品。

优选地，表皮皮肤样本中CERU蛋白基于质谱的相对含量的测定方法，包括如下步骤：(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；

(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；

3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品；

(3)检测

将干燥的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样；通过UCERU蛋白LC进行分离；样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱串联，以500nl/min流速通过如下有效梯度进行：

分离：0-5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5-160min，流动相B从5％线性升至35％；160-170min，流动相B从35％升至80％；170-175min，80％流动相B；176-180min，5％流动相B；纳升液相分离末端直接连接质谱仪；

DDA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q-Exactive HF模式检测；主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为60,000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率15,000。二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到7+，峰强度超过10,000的强度排在前20的母离子；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为30s；AGC设置为：一级3E6，二级1E5；

DIA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q-Exactive HF模式检测；主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为120,000；将350-1500Da均分为40个窗口进行碎裂及信号采集；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为30s；AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

优选地，用于检测CERU蛋白含量的物质为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；所述用于检测CERU蛋白含量的物质为轨道阱高分辨率质谱仪。

优选地，所述CERU蛋白的P值为0.029955387。

优选地，所述CERU蛋白判断衰老程度及皮肤衰老程度的方法：

1)取受试者表皮皮肤样本；

2)检测所得受试者皮肤样本中CERU蛋白含量；

3)将步骤2)测得的CERU蛋白含量与该年龄段正常衰老的人员皮肤中的CERU蛋白含量值进行比较，根据比较结果，判断受试者的皮肤衰老程度；

或4)将步骤2)测得的CERU蛋白含量与各年龄段正常衰老的人员皮肤中的CERU蛋白含量标准曲线进行比较，根据比较结果，判断受试者皮肤的生理年龄。

优选地，辅助判断衰老程度的系统，包括如下模块：

(1)数据接收模块；所述数据接收模块被配置为接收受试者皮肤样本中CERU蛋白含量数据；

(2)数据存储模块：所述数据存储模块被配置为存储与受试者年龄段一致的正常人皮肤中的CERU蛋白含量数据；

(3)数据比较模块：所述数据比较模块被配置为将数据接收模块接受到的受试者皮肤样本中CERU蛋白含量数据与数据存储模块中存储的与受试者年龄段一致的正常人皮肤中的CERU蛋白含量数据进行比较；；

(4)判断模块；所述判断模块被配置为接收由所述数据比较模块发送的比较结果，并对比较结果进行判定，判定受试者的皮肤衰老程度，或判定受试者皮肤生理年龄是否与其实际年龄相符，并输出判定结果。

本发明通过检测皮肤中CERU蛋白含量，辅助判断皮肤衰老程度，从根源上找到导致皮肤衰老的内在因素，在皮肤老化外在表现出现前提前干预皮肤衰老，另外可以正确判断皮肤的衰老程度以及判断衰老的生理年龄是否与实际年龄相符，为美容或者医学美容提供参考和方向。该方法简单易行，具有广阔的市场前景。

附图说明

图1为检测得到的CERU蛋白的特征肽段(LISVDTEHSNIYLQNGPDR)的质谱图。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替换，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一种无创提取皮肤中CERU蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；

(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；

3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品。

表皮皮肤样本中CERU蛋白基于质谱的相对含量的测定方法，包括如下步骤：(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；

(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；

3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品；

(3)检测

将干燥的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样；通过UCERU蛋白LC进行分离；样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱串联，以500nl/min流速通过如下有效梯度进行：

分离：0-5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5-160min，流动相B从5％线性升至35％；160-170min，流动相B从35％升至80％；170-175min，80％流动相B；176-180min，5％流动相B；纳升液相分离末端直接连接质谱仪；

DDA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q-Exactive HF模式检测；主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为60,000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率15,000。二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到7+，峰强度超过10,000的强度排在前20的母离子；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为30s；AGC设置为：一级3E6，二级1E5；

DIA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q-Exactive HF模式检测；主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为120,000；将350-1500Da均分为40个窗口进行碎裂及信号采集；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为30s；AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

用于检测CERU蛋白含量的物质为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；所述用于检测CERU蛋白含量的物质为轨道阱高分辨率质谱仪。

所述CERU蛋白的P值为0.029955387。

所述CERU蛋白判断衰老程度及皮肤衰老程度的方法：

1)取受试者表皮皮肤样本；

2)检测所得受试者皮肤样本中CERU蛋白含量；

3)将步骤2)测得的CERU蛋白含量与该年龄段正常衰老的人员皮肤中的CERU蛋白含量值进行比较，根据比较结果，判断受试者的皮肤衰老程度；

或4)将步骤2)测得的CERU蛋白含量与各年龄段正常衰老的人员皮肤中的CERU蛋白含量标准曲线进行比较，根据比较结果，判断受试者皮肤的生理年龄。

辅助判断衰老程度的系统，包括如下模块：

(1)数据接收模块；所述数据接收模块被配置为接收受试者皮肤样本中CERU蛋白含量数据；

(2)数据存储模块：所述数据存储模块被配置为存储与受试者年龄段一致的正常人皮肤中的CERU蛋白含量数据；

(3)数据比较模块：所述数据比较模块被配置为将数据接收模块接受到的受试者皮肤样本中CERU蛋白含量数据与数据存储模块中存储的与受试者年龄段一致的正常人皮肤中的CERU蛋白含量数据进行比较；

(4)判断模块；所述判断模块被配置为接收由所述数据比较模块发送的比较结果，并对比较结果进行判定，判定受试者的皮肤衰老程度，或判定受试者皮肤生理年龄是否与其实际年龄相符，并输出判定结果。

图1为检测得到的CERU蛋白的特征肽段(LISVDTEHSNIYLQNGPDR)的质谱图。

随机抽样正常健康中国人7女、6男为受试者，其中皮肤样本中CERU蛋白相对含量数据如下：

由上表中数据可以看出，随着年龄的增长，受试者皮肤样本中CERU蛋白相对含量增加。

在实际应用中，首先采集数量上有统计学意义的各个年龄正常人的皮肤为样本，分别测定各皮肤样本中CERU相对含量，比如要为某个城市中35岁的人群进行服务，那么首先采集数量上有统计学意义的这个城市生活的35岁正常人的皮肤样本，测定各皮肤样本中CERU相对含量，并且取得平均值。这个平均值，就是一个衡量受试者皮肤衰老程度的阈值，当有受试者来进行评估的时候，采用与获得阈值相同的方法测量去皮肤中CERU的含量，当CERU的含量低于阈值的时候，说明该受试者皮肤的生理年龄比实际年龄年轻；受试者皮肤中CERU含量高于阈值的时候，判定受试者皮肤的生理年龄比实际年龄年老。

至于说怎样测量皮肤中CERU的含量，除了本实施例中质谱的方法以外，其余的任何能够测定蛋白的绝对和相对含量的方法，比如抗原抗体结合法等，都是可以的，并且应受到本发明的保护。

除了皮肤以外，CERU的含量，也可作为辅助判断人整体衰老程度的指标。

Gene:CERU

Protein:CERU蛋白

MKILILGIFLFLCSTPAWAKEKHYYIGIIETTWDYASDHGEKKLISVDTEHSNIYLQNGPDRIGRLYKKALYLQYTDETFRTTIEKPVWLGFLGPIIKAETGDKVYVHLKNLASRPYTFHSHGITYYKEHEGAIYPDNTTDFQRADDKVYPGEQYTYMLLATEEQSPGEGDGNCVTRIYHSHIDAPKDIASGLIGPLIICKKDSLDKEKEKHIDREFVVMFSVVDENFSWYLEDNIKTYCSEPEKVDKDNEDFQESNRMYSVNGYTFGSLPGLSMCAEDRVKWYLFGMGNEVDVHAAFFHGQALTNKNYRIDTINLFPATLFDAYMVAQNPGEWMLSCQNLNHLKAGLQAFFQVQECNKSSSKDNIRGKHVRHYYIAAEEIIWNYAPSGIDIFTKENLTAPGSDSAVFFEQGTTRIGGSYKKLVYREYTDASFTNRKERGPEEEHLGILGPVIWAEVGDTIRVTFHNKGAYPLSIEPIGVRFNKNNEGTYYSPNYNPQSRSVPPSASHVAPTETFTYEWTVPKEVGPTNADPVCLAKMYYSAVDPTKDIFTGLIGPMKICKKGSLHANGRQKDVDKEFYLFPTVFDENESLLLEDNIRMFTTAPDQVDKEDEDFQESNKMHSMNGFMYGNQPGLTMCKGDSVVWYLFSAGNEADVHGIYFSGNTYLWRGERRDTANLFPQTSLTLHMWPDTEGTFNVECLTTDHYTGGMKQKYTVNQCRRQSEDSTFYLGERTYYIAAVEVEWDYSPQREWEKELHHLQEQNVSNAFLDKGEFYIGSKYKKVVYRQYTDSTFRVPVERKAEEEHLGILGPQLHADVGDKVKIIFKNMATRPYSIHAHGVQTESSTVTPTLPGETLTYVWKIPERSGAGTEDSACIPWAYYSTVDQVKDLYSGLIGPLIVCRRPYLKVFNPRRKLEFALLFLVFDENESWYLDDNIKTYSDHPEKVNKDDEEFIESNKMHAINGRMFGNLQGLTMHVGDEVNWYLMGMGNEIDLHTVHFHGHSFQYKHRGVYSSDVFDIFPGTYQTLEMFPRTPGIWLLHCHVTDHIHAGMETTYTVLQNEDTKSG。

以上所述仅为本发明专利的较佳实施例而已，并不用以限制本发明专利，凡在本发明专利的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。