提高在冷冻保存及低氧条件下的存活率的心肌细胞聚集体制备技术

技术领域

本发明在保健福祉部的支持下，通过项目编号HI20C0184010020完成，上述项目的研究管理机构是韩国健康产业振兴院，研究项目的名称为“先进医疗技术开发(R&D)”，研究课题的名称为“探索通过微环境调节的成熟化诱导技术及开发融合试制品开发”，组织机构是T&R Bio Fab，研究期限为2020年04月23日-2022年12月31日。

本发明在疾病控制中心的支持下，通过项目编号2020-ER6106-00完成，上述项目的研究管理机构是疾病控制中心，研究项目的名称是“国家卫生与医疗研究基础设施建设(R&D)”，研究课题的名称是“构建利用国家干细胞库资源的多能干细胞系衍生的心肌细胞的药物反应特性信息”，组织机构是T&R Bio Fab，研究期限为2020年03月16日-2021年12月31日。

本发明在韩国产业通商资源部的支持下，通过项目编号20009748完成，上述项目的研究管理机构是韩国工业技术评估与管理研究所，研究项目的名称是“基于三维生物组织芯片的新药开发平台建设项目(多部门)-三维生物组织芯片产品化”，研究课题的名称为“基于人类干细胞衍生的心肌细胞的药物的心脏毒性评估用三维心脏微环境仿真芯片开发”，组织机构是医科大学合作基金会，研究期限为2020年4月1日-2023年12月31日。

本专利申请要求于2019年12月02日向韩国专利局提交且申请号为10-2019-0158572的韩国专利申请、2020年07月23日向韩国专利局提交且申请号为10-2020-0091585的韩国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

本发明涉及提高在冷冻保存及低氧条件下的存活率的心肌细胞聚集体制备技术，根据本发明制备的心肌细胞聚集体在低氧条件下的存活率良好，可以长期冷冻保存，当在长期冷冻保存之后向心脏移植时，存活率及心脏功能改善效果极为优秀。

背景技术

全球范围内迅速增加的如急性心肌梗塞的难治性心脏病患者正在接受手术治疗或药物治疗等治疗，再生受损心肌的细胞疗法在现有疗法中还没有得到很大发展。

多能干细胞是可以分化成组成生物组织的各种细胞的未分化的细胞，可根据分化条件，分化成需要的细胞，因此，在再生医学领域中，利用干细胞的研究可用于治疗疾病或组织受损。

在从多能干细胞分化诱导的心肌细胞的情况下，正在研究通过形成可以将治疗效果极大化的细胞聚集体来进行注入的方法，而不是注入单一细胞。这种心肌细胞聚集体的旁分泌信号(paracrine signal)释放量大，从而，当向人体注入时，治疗效果更加卓越。

现有聚集体形成方法包括悬滴法(Hanging-drop method)、使用生物反应器的旋转培养法、离心法、使用磁性粒子的方法、微成型(Micromolding)法等，当向体内投入不均匀的聚集体时，将发生因低氧条件所引起的聚集体的内部细胞死亡的问题。因此，制备在低氧条件下，存活率良好，均匀大小的聚集体极为重要。

并且，现有的三维细胞培养方法并未揭示所形成细胞聚集体的冷冻保存方法，即，当冷冻及解冻时，不会降低存活率的方法。

因此，可以冷冻及解冻的细胞聚集体开发可以扩大三维细胞结构研究范围，期待使用多能干细胞的类器官的生产，以及向使用类器官的新药开发商供给及销售聚集体。并且，由于在向体内植入后发生的低氧条件下的细胞存活率的提高，在低氧条件下具有高存活率的聚集体有可能为细胞疗法剂开发商提供信息。

发明内容

技术问题

本发明为了开发可以冷冻及解冻的心肌细胞聚集体形成方法而努力进行了研究。结果，在以规定大小形成心肌细胞聚集体的情况下，没有因低氧症(Hypoxia)所引起的聚集体内部坏死，可以增加生产率，不仅如此，可以维持冷冻及解冻后的存活率，由此完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供可以冷冻保存(cryopreservation)的心肌细胞(Cardiomyocyte)聚集体(Cluster)形成方法。

本发明的再一目的在于，提供可以冷冻保存的心肌细胞聚集体。

本发明的另一目的在于，提供包含可以冷冻保存的心肌细胞聚集体的药剂学组合物。

技术方案

本发明为了开发可以冷冻及解冻的心肌细胞聚集体形成方法而努力进行了研究。结果，在以规定大小形成心肌细胞聚集体的情况下，没有因低氧症(Hypoxia)所引起的聚集体内部坏死，可以增加存活率，不仅如此，可以维持冷冻及解冻后的存活率，由此完成了本发明。

以下，更加详细说明本发明。

本发明一实施方式为包括如下步骤的人类多能干细胞衍生心肌细胞的聚集体形成方法：培养步骤，培养人类多能干细胞来分化成心肌细胞；筛选步骤，在分化的上述心肌细胞中，分离表达CD71表面标记物的CD71阳性心肌细胞来形成特定心肌细胞群；以及形成步骤，培养筛选的上述特定心肌细胞来形成直径为100μm至300μm的心肌细胞聚集体。

在本说明书中，术语“干细胞(Stem cell)”为未分化的细胞，是具有自我复制能力，且具有分化成两个以上的不同种类的细胞的能力的细胞。

在本发明的一实例中，干细胞可选自人类胚胎干细胞或人类逆分化干细胞中。

在本发明的一实例中，干细胞可以为自我或同种衍生干细胞，可以从包括人类及非人类哺乳类任意类型的动物衍生，可以为从成体衍生的干细胞，从胚胎衍生的干细胞。例如，干细胞可以选自由胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞(induced pluripotentstem cell；iPSC)及诱导多能干细胞衍生间充质干细胞组成的组中，但并不局限于此。

在本说明书中，术语“成体干细胞(adult stem cell)”为脐带血、成年骨髓或血液等中提取的细胞，是分化成具体脏器的细胞之前的细胞，是指保留根据需要，可发达成身体内组织的能力的未分化状态的细胞。

在本发明的一实例中，成体干细胞可以选自由从人类、动物或动物组织衍生的成体干细胞、人类、动物或动物组织衍生的间充质干细胞(mesenchymal stromal cell)及从人类、动物或动物组织衍生的诱导多能干细胞衍生的中叶干细胞组成的组，但并不局限于此。

在本发明中，人类、动物或动物组织可选自由脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜及胎盘组成的组中，但并不局限于此。

在本发明中，从人类或动物的多种组织衍生的干细胞可选自由造血干细胞、乳腺干细胞、肠干细胞、血管内皮干细胞、神经干细胞、嗅觉神经干细胞及睾丸干细胞组成的组中，但并不局限于此。

在本说明书中，术语“胚胎干细胞(embryonic stem cell)”为在胚胎的发生过程中提取的细胞，受精卵在即将植入母亲子宫之前，通过从胚泡胚胎中提取内部细胞团(inner cell mass)来在体外培养。

胚胎干细胞为具有包括可分化成个体的所有组织的细胞的多能性(pluripotent)或全能性(totipotent)的自我再生(selfrenewal)的细胞，广义上，包括从胚胎干细胞衍生的胚状体(embryoid bodies)。

在本发明中，干细胞可包括从人类、猴子、猪、马、牛、羊、狗、猫、鼠、兔子等衍生的胚胎干细胞，但并不局限于此。

在本说明书中，术语“诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell；iPSC)”为从分化的细胞，通过人为逆分化过程，被诱导成具有多能性分化能力的细胞，可以按与“逆分化干细胞”相同的含义使用。

人为逆分化过程通过导入以利用逆转录病毒、慢病毒及仙台病毒的病毒介导或利用非病毒性载体、蛋白质及细胞提取物等的非病毒为介导的逆分化因子来执行，或者可包括基于干细胞提取物、化合物等的逆分化过程。

诱导多能干细胞具有与胚胎干细胞几乎相同的特性，具体地，具有类似的细胞形状，基因、蛋白质表达类似，在体内及体外具有多能性，形成畸胎瘤(teratoma)，当向小鼠的囊胚(blastocyst)插入时，形成嵌合体(chimera)小鼠，可以实现基因的种系传递(germline transmission)。

在本发明中，CD71标记物可以作为在收缩性心肌细胞中特异性表达的表面标记物使用。当用CD71标记物染色心肌细胞时，未表达CD71的细胞，即，CD71阴性细胞可以为未分化的干细胞或胚胎体，或者非收缩性心肌细胞。

对此，根据本发明的方法，在未诱导从干细胞向心肌细胞的分化的情况下或者存在从干细胞向心肌细胞的分化，但向未呈现出收缩性的非收缩性心肌细胞分化的情况下，可通过CD71标记物简单地进行栽培。并且，当形成聚集体时，可通过CD71标记物来形成由收缩性心肌细胞形成的相同的心肌细胞群来形成未混合呈现出其他特性的心肌细胞的均质的聚集体。

在本发明的一实例中，在筛选步骤中，特定心肌细胞群可包含40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、99％以上、99.9％或99.99％的上述CD71阳性心肌细胞，例如，可以包含90％以上，但并不局限于此。

在本发明的一实例中，筛选步骤可通过流式细胞分析或手工作业分离CD71阳性心肌细胞。

在本发明的一实例中，在形成步骤中，培养特定心肌细胞来形成直径为85μm至125μm、90μm至120μm、95μm至115μm及100μm至110μm的聚集体，例如，可以形成直径为100μm至110μm的聚集体，但并不局限于此。

在上述聚集体的直径过大的情况下，当处于低氧环境或长期冷冻保存时诱导，内部细胞死亡，从而聚集体内的细胞存活率降低，在聚集体的直径过小的情况下，与单一细胞没有太大的差异，从而，当向体内给药时，存活率低，心脏功能改善效果显著降低(参照图17a及图19至图30)。

在本发明的一实例中，形成步骤可以在球形成型盘(spheroid forming dish；SFD)中培养特定心肌细胞来形成聚集体。

在本发明中，球形成型盘的直径可以为170μm至230μm、175μm至225μm、180μm至220μm、185μm至215μm、190μm至210μm、195μm至205μm或200μm，例如，可以为200μm，但并不局限于此。

在本发明的一实例中，在形成步骤中，可以在直径为170μm至230μm、175μm至225μm、180μm至220μm、185μm至215μm、190μm至210μm、195μm至205μm或200μm的球形成型盘中培养特定心肌细胞来形成直径为85μm至125μm、90μm至120μm、95μm至115μm或100μm至110μm的心肌细胞聚集体。

在本发明的一实例中，在形成步骤中，可在170μm至230μm的球形成型盘中培养特定心肌细胞来形成直径为85μm至125μm的心肌细胞聚集体。

在本发明的一实例中，在形成步骤中，可在直径为170μm至230μm的球形成型盘中培养特定心肌细胞来形成直径为90μm至120μm的心肌细胞聚集体。

在本发明的一实例中，在形成步骤中，可在直径为170μm至230μm的球形成型盘中培养特定心肌细胞来形成直径为100μm至110μm的心肌细胞聚集体。

在本发明的一实例中，在形成步骤中，可在直径为180μm至220μm的球形成型盘中培养特定心肌细胞来形成直径为85μm至125μm的心肌细胞聚集体。

在本发明的一实例中，在形成步骤中，可在直径为180μm至220μm的球形成型盘中培养特定心肌细胞来形成直径为90μm至120μm的心肌细胞聚集体。

在本发明的一实例中，在形成步骤中，可在直径为180μm至220μm的球形成型盘中培养特定心肌细胞来形成直径为95μm至115μm的心肌细胞聚集体。

在本发明的一实例中，在形成步骤中，可在直径为180μm至220μm的球形成型盘中培养特定心肌细胞来形成直径为100μm至110μm的心肌细胞聚集体。

在本发明的一实例中，在形成步骤中，可在直径为190μm至210μm的球形成型盘中培养特定心肌细胞来形成直径为85μm至125μm的心肌细胞聚集体。

在本发明的一实例中，在形成步骤中，可在直径为190μm至210μm的球形成型盘中培养特定心肌细胞来形成直径为90μm至120μm的心肌细胞聚集体。

在本发明的一实例中，在形成步骤中，可在直径为190μm至210μm的球形成型盘中培养特定心肌细胞来形成直径为95μm至115μm的心肌细胞聚集体。

在本发明的一实例中，在形成步骤中，可在直径为190μm至210μm的球形成型盘中培养特定心肌细胞来形成直径为100μm至110μm的心肌细胞聚集体。

在使用上述规定直径的球形成型盘的情况下，当形成聚集体时，可形成均匀大小的心肌细胞聚集体。因此，随着使用球形成型盘实现标准化，能够以高的收率制备均匀化的聚集体，由此，在低氧条件及冷冻保存之后，也可以稳定地维持心肌细胞的存活率，当向心肌细胞的体内移植时，可以谋求所移植的心肌细胞的高的存活率、存活率。

在本发明的一实例中，形成步骤可以利用30个至50个、32个至48个、34个至46个、36个至44个或38个至44个的单一心肌细胞来形成心肌细胞聚集体，例如，可以利用38个至44个的单一心肌细胞来形成心肌细胞聚集体，但并不局限于此。

在本发明的一实例中，方法还可包括冷冻保存所形成的聚集体的冷冻步骤。

在本发明的一实例中，冷冻步骤将聚集体可冷冻保存6个月以上。

在本发明的一实例中，冷冻步骤可以通过10％的二甲基亚砜(DMSO)溶液冷冻保存聚集体。

在本发明的一实例中，方法还可包括解冻冷冻的聚集体的解冻步骤。

在本发明的一实例中，解冻步骤可包括在低糖DMEM(杜贝克改良伊格尔)培养基悬浮聚集体的悬浮步骤。

本发明了另一实施方式为直径为100μm至300μm的心肌细胞絮，上述心肌细胞聚集体包含表达CD71表面标记物的人类多能干细胞衍生心肌细胞。

在本发明的一实例中，人类多能干细胞可选自人类胚胎干细胞或人类逆分化干细胞。

在本发明的一实例中，心肌细胞的直径可以为85μm至125μm、90μm至120μm、95μm至115μm及100μm至110μm，例如，可以为100至110μm，但并不局限于此。

在本发明的一实例中，心肌细胞聚集体可以包含80％以上的表达CD71表面标记物的心肌细胞。

本发明另一实施方式为用于缓解、抑制、预防或治疗心脏病的药剂学组合物，包含表达CD71表面标记物的人类多能干细胞衍生心肌细胞作为有效成分，包含直径为100μm至300μm的心肌细胞聚集体。

本发明的药剂学组合物包含与上述心肌细胞聚集体相同的人类多能干细胞衍生心肌细胞，因此，为了避免本说明书中的过渡复杂性，将省略它们之间的共同内容。

在本说明书中，术语“以有效成分包含”为达成对于从干细胞或此外的培养物分离的外来体的特定疾病的缓和、抑制、预防或治疗活性的充分的量。

在本说明书中，术语“心脏病”可以选自由心绞痛(Angina Pectoris)、心肌梗塞(Myocardial Infarction)、瓣膜疾病(Valvular disease)、心脏衰竭(Cardiac failure)、心脏肥大(Cardiac Hypertrophy)、心律失常(Arrhythmia)、心包炎(Pericarditis)及心内膜炎(Endocarditis)组成的组中，但并不局限于此。

在本发明的一实例中，心脏病可以为缺血性心脏病。

在本说明书中，术语“缺血性心脏病(ischemic heart disease)”为向心脏供血的冠状动脉变窄，导致向心肌供血不足的缺血现象。代表性地，包括心绞痛、心肌梗塞症，严重的情况下，导致心脏骤停。作为症状，典型的是胸痛，但是，变严重的情况下，由于心功能下降而引起的心脏衰竭而引发呼吸困难、心律失常，被认为动脉硬化是主要原因。

在本发明的一实例中，缺血性心脏病可选自由心绞痛、心肌梗塞、心脏衰竭组成的组中，但并不局限于此。

在本发明中，药剂学组合物可以包含药剂学可接受的载体。例如，可包含乳糖，右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基丙氧基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油，但并不局限于此。

在本发明中，药剂学组合物还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂。

在本发明中，药剂学组合物可通过口服及非口服给药，例如，心内注射、静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射、局部给药、鼻内给药、肺内给药、直肠给药、鞘内给药、眼内给药、皮肤给药及经皮给药，但并不局限于此。

在本发明中，药剂学组合物可通过如配制方法、给药方法、患者的年龄、体重、性别、病理状况、食物、给药时间、给药途径、排泄率及反应敏感性的因素以多种方式确定给药量，可以确定或处方为需要治疗或预防的有效给药量。例如，本发明的药剂学组合物的1日给药量可以为0.0001mg/㎏-1000mg/㎏。

在本发明中，药剂学组合物可以根据本发明所属技术领域的普通技术人员轻松实施的方法，利用药剂学接受的载体和/或赋型剂来制剂化，由此，制成单位容量形态或者向多容量容器内放入来制备。在此情况下，剂型可以为油或水介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态或者萃取剂、散剂、栓剂、散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂形态，可含分散剂或稳定化剂，但并不局限于此。

本发明药剂学组合物的给药容量可根据患者的年龄、体重、性别、给药形态、健康状态及疾病程度改变，可根据医生或药师的判断，以规定时间间隔，按每日1次至数次分割给药。例如，以有效成分含量为基准，1日给药量可以为1μg/ml至1000μg/ml，这是一般情况的例示，根据个人差异，剂量可以增加或减少。

本发明的另一实施方式为包括如下步骤的心脏病的治疗或缓和方法，即，包含表达CD71表面标记物的人类多能干细胞衍生心肌细胞作为有效成分，向对象给药包含直径为100μm至300μm的心肌细胞聚集体的组合物。

本发明的治疗方法包含与上述药剂学组合物相同的心肌细胞聚集体，为了避免说明书的过度的复杂性，将省略它们之间的共同的内容。

在本说明书中，“治疗”是指通过本发明的组合物的给药来使疾病好转或者变得有利的所有行为。

在本说明书中，术语“给药”为通过任意适当的方法向患者提供规定物质，本发明的药剂学组合物的给药路径只要可以到达目标组织，可以通过一般的所有路径，口服或非进口给药。并且，本发明的组合物可以利用能够向标的细胞传递有效成分的任意装置来给药。

在本说明书中，术语“对象”并未受到特别限制，例如，包括人类、猴、牛、马、羊、猪、鸡、火鸡、鹌鹑、猫、狗、老鼠、小鼠、兔子或豚鼠，例如，可以为人类，但并不局限于此。

在本发明的一实例中，本发明的药剂学组合物可以单独给药，通常，可以考虑给药方式和标准制药规范(standard phamaceutical practice)，可以与所选择的药剂学载体混合给药。

本发明的另一实施方式为组合物的用途，包含表达CD71表面标记物的人类多能干细胞衍生心肌细胞作为有效成分，包含直径为100至300μm的心肌细胞聚集体。

发明的效果

本发明涉及提高心肌细胞聚集体的长期保存有效性的方法，在利用本发明的方法的情况下，可以冷冻保存心肌细胞聚集体，从而可以扩大利用多能干细胞的类器官制备及利用类器官的新药开发等三维细胞结构体研究范围，不仅如此，在向体内移植后发生的低氧条件下的细胞存活率得到提高，从而期待可有效地用于细胞治疗剂开发等相关技术。

附图说明

图1为示出本发明一实施例的人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell；hESC)及人类逆分化干细胞(human induced pluripotent stem cells；hiPSC)的分化过程的图。

图2为在本发明一实施例的人类胚胎干细胞分化后的第八日观察GFP基因的表达的照片。

图3为示出通过流式细胞分析分类从本发明一实施例的人类胚胎干细胞分化的GFP阳性(GFP+)心肌细胞的过程的照片。

图4为示出根据本发明一实施例的流式细胞分析后，通过手工作业分离收缩性GFP+心肌细胞的过程的照片。

图5a为示出根据本发明一实施例的未分化细胞、通过流式细胞分析分离的细胞(GFP(+/-))及通过手工作业分离的细胞(GFP+收缩性心肌细胞及GFP+非收缩性心肌细胞)的主要成分的分析结果的图表。

图5b为示出根据本发明一实施例的未分化细胞、通过流式细胞分析分离的细胞(GFP(+/-))及通过手工作业分离的细胞(GFP+收缩性心肌细胞及GFP+非收缩性心肌细胞)的主要成分的分析结果(a值d)的热图。

图5c为示出根据本发明的一实施例的未分化细胞、通过流式细胞分析分离的细胞(GFP(+/-))及通过手工作业分离的细胞(GFP+收缩性心肌细胞及GFP+非收缩性心肌细胞)的主要成分的分析结果中的a部分的图。

图5d为示出根据本发明的一实施例的未分化细胞、通过流式细胞分析分离的细胞(GFP(+/-))及通过手工作业分离的细胞(GFP+收缩性心肌细胞及GFP+非收缩性心肌细胞)的主要成分的分析结果中的b部分的图。

图5e为示出根据本发明的一实施例的未分化细胞、通过流式细胞分析分离的细胞(GFP(+/-))及通过手工作业分离的细胞(GFP+收缩性心肌细胞及GFP+非收缩性心肌细胞)的主要成分的分析结果中的c部分的图。

图5f为示出根据本发明的一实施例的未分化细胞、通过流式细胞分析分离的细胞(GFP(+/-))及通过手工作业分离的细胞(GFP+收缩性心肌细胞及GFP+非收缩性心肌细胞)的主要成分的分析结果中的d部分的图。

图6a为示出根据本发明一实施例的未分化细胞、通过流式细胞分析分离的细胞(GFP(+/-))及通过手工作业分离的细胞(GFP+收缩性心肌细胞及GFP+非收缩性心肌细胞)的心肌细胞特异基因表达的主要成分的分析结果的热图。

图6b为示出根据本发明的一实施例的未分化细胞、通过流式细胞分析分离的细胞(GFP(+/-))及通过手工作业分离的细胞(GFP+收缩性心肌细胞及GFP+非收缩性心肌细胞)的心室肌细胞特异基因表达的主要成分的分析结果的热图。

图7为示出本发明一实施例的GFP+收缩性心肌细胞的KEGG路径分析结果的照片。

图8为示出本发明一实施例的GFP+收缩性心肌细胞的CD71表达方式的图表。

图9为示出在本发明一实施例的人类胚胎干细胞衍生心肌细胞中检测CD71的表达的结果的照片。

图10为示出表达本发明一实施例的CD71表面标记物的心肌细胞的免疫组织化学染色结果的照片。

图11为示出表达本发明一实施例的CD71表面标记物的心肌细胞的电生理分析结果的图表。

图12a为示出表达本发明一实施例的CD71表面标记物的心肌细胞的长期培养后的cTnT表达量的图表。

图12b为示出观察表达本发明一实施例的CD71表面标记物的心肌细胞的长期培养后的形态的结果的照片。

图12c为示出表达本发明一实施例的CD71表面标记物的心肌细胞的长期培养后的电生理分析结果的图表。

图13为示出本发明一实施例的临床等级CMC-11iPSC细胞株17的分化10日后观察收缩性心肌细胞的结果的照片。

图14为示出通过CD71表面标记物分类本发明一实施例的临床等级CMC-11iPSC细胞株17之后，分类的心肌细胞的免疫组织化学染色结果的照片。

图15为示出在本发明一实施例的单一心肌细胞及心肌细胞聚集体的低氧条件下培养后的存活率的图表。

图16为示出本发明一实施例的单一心肌细胞及心肌细胞聚集体的低氧条件下培养后的存活的照片。

图17a为示出本发明一实施例的成纤维细胞聚集体的低氧条件下的存活力的照片。

图17b为示出本发明一实施例的300μm以下的成纤维细胞聚集体的冷冻保存后，解冻时的存活的照片。

图17c为示出补充本发明一实施例的二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)的冷冻保存后，解冻时的存活的照片。

图18为示出本发明一实施例的心肌细胞聚集体的冷冻保存后，解冻时的基于大小的存活率的图表。

图19为示出形成本发明一实施例的心肌细胞聚集体的过程的照片。

图20为示出本发明一实施例的心肌细胞聚集体的冷冻保存后观察到收缩的结果及电生理功能的照片。

图21a为示出本发明一实施例的100μm心肌细胞聚集体的27G注射器通过过程的照片。

图21b为示出本发明一实施例的200μm心肌细胞聚集体的27G注射器通过过程的照片。

图21c为比较本发明一实施例的心肌细胞单一细胞及心肌细胞聚集体的基于细胞数的体积的照片。

图21d为示出本发明一实施例的心肌细胞单一细胞及心肌细胞聚集体的心肌梗塞(MI)后向其他部位注入的过程的照片。

图22a为示出测定在本发明一实施例的对照组、单一细胞给药组及聚集体给药组中的RWT的结果的图表。

图22b为示出测定在本发明一实施例的对照组、单一细胞给药组及聚集体给药组中的SWT的结果的图表。

图22c为示出测定在本发明一实施例的对照组、单一细胞给药组及聚集体给药组中的PWT的结果的图表。

图23为示出向本发明一实施例的大鼠心肌梗塞组给药PBS(对照组)、给药单一心肌细胞5×10

图24为示出测定在本发明一实施例的对照组、单一细胞给药组及聚集体给药组中的LVIDd及LVIDs的结果的图表。

图25为示出测定在本发明一实施例的对照组、单一细胞给药组及聚集体给药组中的KaPLAN-Meier curve的结果的图表。

图26为示出测定在本发明一实施例的对照组、单一细胞给药组及聚集体给药组中的LVEF的结果的图表。

图27为示出测定在本发明一实施例的对照组，单一细胞给药组及聚集体给药组中的缩短分数(FS)的结果的图表。

图28a为示出在本发明一实施例的对照组、单一细胞给药组及聚集体给药组中通过血液动力学分析的心压量的图表。

图28b为示出在本发明一实施例的对照组中通过血液动力学分析的心压量的图表。

图28c为示出在本发明一实施例的单一细胞给药组聚集体给药组中通过血液动力学分析的心压量的图表。

图28d为示出在本发明一实施例的聚集体给药组中通过血液动力学分析的心压量的图表。

图29为示出在本发明一实施例的对照组、单一细胞给药组及聚集体给药组中测定的心输出量(Cardiac output；CO)的图表。

图30为示出在本发明一实施例的对照组、单一细胞给药组及聚集体给药组中测定的每搏输出量(每博输出量)的图表。

图31为示出在本发明一实施例的对照组、单一细胞给药组及聚集体给药组中测定的最大体积(V max)的图表。

图32a为示出在本发明一实施例的对照组、单一细胞给药组及聚集体给药组中测定的最大压力(P max)的图表。

图32b为示出在本发明一实施例的对照组、单一细胞给药组及聚集体给药组中测定的dP/dt max的图表。

图32c为示出在本发明一实施例的对照组、单一细胞给药组及聚集体给药组中测定的dP/dt min的图表。

图33为示出在本发明一实施例的对照组、单一细胞给药组及聚集体给药组中测定的终末收缩压-容积关系(ESPVR)的图表。

图34为示出在本发明一实施例的对照组、单一细胞给药组及聚集体给药组中测定的舒张末收缩压容积关系(EDPVR)的图表。

图35为示出在本发明一实施例的对照组中测定的终末收缩压-容积关系及舒张末收缩压容积关系的图表。

图36为示出在本发明一实施例的单一细胞给药组中测定的终末收缩压-容积关系及舒张末收缩压容积关系的图表。

图37为示出在本发明一实施例的聚集体给药组中测定的终末收缩压-容积关系及舒张末收缩压容积关系的图表。

图38为示出本发明一实施例的单一细胞给药组的免疫组织化学结果的照片。

图39为示出本发明一实施例的聚集体给药组的免疫组织化学结果的照片。

图40为示出在左心室组织中计算本发明一实施例的单一细胞给药组和聚集体给药组的cTnT表达-Dil标记的细胞(DiI+/cTnT+)密度的结果的图表。

图41为示出本发明一实施例的单一细胞给药组和聚集体给药组的TUNEL试验结果的图表。

图42为示出将本发明一实施例的聚集体给药组通过Dil、cTnT、GJA1及DAPI染色来执行免疫组织化学分析的结果的照片。

图43为示出将本发明一实施例的聚集体给药组通过Dil、ACTN2、GJA1及DAPI染色来执行免疫组织化学分析的结果的照片。

图44为示出将本发明一实施例的聚集体给药组通过Dil、cTnT、hMYH7及DAPI染色来执行免疫组织化学分析的结果的图表。

图45为示出将本发明一实施例的聚集体给药组通过Dil、ACTN2、hMYH7及DAPI染色来执行免疫组织化学分析的结果的图表。

图46为示出将本发明一实施例的对照组、单一细胞给药组及聚集体给药组通过CD31、cTnT及DAPI染色来执行免疫组织化学分析的结构的图表。

图47为示出在本发明一实施例的对照组、单一细胞给药组及聚集体给药组的心脏梗塞区域及边界区域的毛细血管密度的图表。

具体实施方式

本发明涉及包括如下步骤的人类多能干细胞衍生心肌细胞的聚集体形成方法：培养步骤，培养人类多能干细胞来分化成心肌细胞；筛选步骤，在分化的上述心肌细胞中，分离表达CD71表面标记物的CD71阳性心肌细胞来形成特定心肌细胞群；以及形成步骤，培养筛选的上述特定心肌细胞来形成直径为100μm至300μm的心肌细胞聚集体。

本发明的实施方式

以下，通过实施例，更加信息说明本发明。这些实施例仅用于例示本发明，对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，本发明的范围并不局限于这些实施例是显而易见的。

实施例1.人类多能干细胞衍生心肌细胞的分离

将作为人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells；hESC)的细胞株的H9(NK×2.5eGFP/w)在基质胶上，在iPS-BREW xF培养基(StemMACS TM，Mitenyi Biotec)以未分化状态维持培养4日。在为了初始分化而培养的干细胞，将作为低分子化合物的CHIR 99021和Wnt-C59分别依次处理2日，将细胞在心肌细胞分化培养基(CDM；RPMI1640(ThermoFisherScientific)+500μg/ml Human serum albumin Sigma Aldrich)+213μg/ml Ascorbicacid(Sigma Aldrich))培养4日来获取收缩性(contracting)心肌细胞(图1)。

在总共培养8日之后，观察到GFP+收缩性心肌细胞，观察到作为人类胚胎干细胞的细胞株的H9表达作为心肌细胞特异基因的NK×2.5(NK×2.5GFP+)(图2)。

接着，在通过细胞消化液(Accutase，Gibco)分解所分化的细胞只有，通过PBS进行洗涤。将分解的细胞悬浮在包含5％胎牛血清(FBS，高克隆)的PBS，利用SH800S CellSorter flow cytometer及Cell sorter software Ver 2.1.2(Sony Biotechnology)，通过流式细胞分析分离GFP+表达细胞(图3)。

通过上述流式细胞分析，观察到75％以上的细胞表达GFP。为了从流式细胞分类之后的异种培养物分离均质的GFP+细胞群，在显微镜的观察下，以移液，通过手工作业分离GFP+细胞，在此情况下，试料中均包含收缩性心肌细胞和非收缩性心肌细胞。接着，为了仅从GFP+心肌细胞分离收缩性心肌细胞，再次在显微镜观察下，通过手工作业分离GFP+收缩性心肌细胞(图4)。

实施例2：确认收缩性心肌细胞的特异表面标记物(specific surface maker)

2-1.分析通过RNA测序的基因表达方式

通过第单一细胞总RNA测序(single cell total RNA sequencing analysis)比较分析从手工作业分离的收缩性心肌细胞与通过流式细胞分析分类的心肌细胞之间的转录谱。

为了RNA测序，将在各个样品中分离的RNA作为Illumina测序用SMART-

在筛选之后，使用Tophat v2.0.13，在Homo sapiens(hg19)整列数据(read)。仅匹配的读对用于差异表达的基因(differentially e×pressed gene，DEG)分析。为了确认DEG，通过每百万个碎片的每千碱基外显子的碎片(fragments per kilobase of e×onper million fragment，FPKM)测定基因表达。使用CUFFLINKS软件v.2.2.1来计算表达水平。而且，通过由此获取的数据进行主要成分分析(principal component analysis；PCA)。

分析结果，通过流式细胞分析分离的细胞(GFP(+/-))及通过手工作业分离的细胞细胞(GFP+收缩性心肌细胞及GFP+非收缩性心肌细胞)均呈现出与心肌细胞类似的特性，观察到与未分化的细胞明确区分。并且，与心肌细胞群相比，除未分化细胞之外的NKX2.5 GFP+收缩性细胞呈现出明确不同的表达方式(图5a至图5f)。具体地，GFP+收缩性细胞呈现出心肌细胞及心室肌细胞特异性基因的表达量高，结果，GFP+收缩性细胞明确呈现出心肌细胞的特性(图6a至图6b)。

2-2.筛选收缩性心肌细胞特异性表面标记物

根据上述实施例2-1的结果，筛选GFP+收缩性心肌细胞的表面标记物。

分析特定基因(GO：0009986)，分离288个上调的细胞表面基因之后，使用STRING(http://string-db.org/)来执行KEGG路径分析(表1)。

表1

分析结果，发现了具有0.01以下的错误发现率(FDR，false discovery rate)值，具有0.7以上的高的可靠性的5个KEGG路径。上述5个KEGG路径包括造血细胞谱系、细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞粘附分子(CAMs)、癌症蛋白聚糖、体液切应力(fluidshear stress)及动脉粥样硬化(atherosclerosis)。确认了KEGG路径为288个的细胞表面基因的网络包括286个节点及666个边缘(图7)。

而且，作为收缩性心肌细胞的特异性表面标记物，在确认的288个表面标记物相关基因中，参与左心室重塑，筛选诱导小鼠KO model28的心肌病正的转铁蛋白受体(transferrin receptor，CD 71)基因。

实施例3：作为心肌细胞特异性表面标记物，确定CD71的特性

为了确认CD71是否可以用作用于纯化心肌细胞的表面标记物，在人类胚胎干细胞的心脏分化期间，分析分析了CD71的表达方式。

3-1.确认在收缩性心肌细胞中的CD71表达

进行了在心肌细胞中，对于表达CD71标记物的心肌细胞的流式细胞分析及细胞分类。

将人类胚胎干细胞衍生的心肌细胞悬浮在包含1％FBS的PBS，与PE-Cy7-接合小鼠抗-人类SIRPα(PE-Cy7-conjugated mouse anti-human SIRPα，Biolegend)、PE-接合小鼠抗人类CD71(PE-conjugated mouse anti-human CD71，Bioscience)一同培养。细胞分类与细胞分类器软件Ver 2.1.5(Sony Biotechnology)一同使用SH800S(Sony Biotechnology)流式细胞分析器来执行。而且，为了细胞内的流式细胞分析，在TrypLE Select(Gibco)中培养细胞，在室温条件下，固定在4％多聚甲醛15分钟之后，通过包含1×Perm/Wash Buffer(BD)及5％山羊血清等的块缓冲液，在4℃的温度条件下，固定及粘连15分钟。接着，在4℃的温度条件下，将细胞与cTnT抗体(Abcam)培养1小时之后，在4℃的温度条件下，通过AlexaFluor 488接合的二抗(ThermoFisher Scientific)处理1小时。流式细胞分析数据的收集与分析软件Ver 2.1.2一同使用SONY SH800S流式细胞分析器来分类表达CD71标记物的心肌细胞。

实验结果，CD71表达在观察到收缩性心肌细胞的分化后的第十日最高，随着时间的经过，上述比例逐渐减少(图8)。

而且，CD71在人类胚胎干细胞衍生的收缩性心肌细胞中特异性表达(图9)。

3-2.确认在CD71表达心肌细胞中的心肌细胞特性

在实施例3-1中，在分化10日后，通过细胞分析分离表达CD71的细胞来实施免疫化学染色。

通过4％多聚甲醛固定细胞20分钟，磷酸盐缓冲溶液(PBS，Sigma)中，通过0.1％氚核X-100渗透5分钟。在通过5％正常山羊血清处理30分钟之后，在4℃的温度条件下，通过cTnT及α-辅肌动蛋白(α-actinin，Sigma-Aldrich)染色细胞12小时。通过PBS洗涤3次细胞之后，与Alexa Fluor 488或555-接合二抗(555-conjugated secondary antibodies，ThermoFisher Scientific)一同培养1小时。核通过DAPI(ThermoFisher Scientific)染色。使用荧光显微镜、Nikon TE2000-U(Nikon，Japan)来确认所有图像(图10)。

3-3.确认CD71表达心肌细胞的电生理特性

根据实施例3-1，在生理学温度(37℃)条件下，向通过CD71标记物分类的心肌细胞灌流包含145mM NaCl、4.3mM KCl、1mM MgCl

电生理分析结果，CD71表达心肌细胞呈现出3中类型的所有心肌细胞的电信号，其中，最占优势的细胞类型的为心室类型的细胞(≥65％)(图11)。

3-4.在体外环境中长期培养后，确认是否维持CD71表达心肌细胞的心肌细胞特性

根据实施例3-1，在试验管内，将通过CD71标记物分类的心肌细胞维持70日之后，通过上述实施例3-1至3-3的方法确认是否呈现出心肌细胞的特性。

结果，通过CD71标记物分类的心肌细胞在试验管内维持70日之后，表达作为心肌细胞特异标记的cTnT的细胞为95％以上。肉瘤结构及多核结构呈棒状心肌细胞的形态，细胞呈现出与成熟的心肌细胞类似的电位功能。因此，通过CD71分类的细胞的基因型及表现型的成熟在长期体外培养之后也可以实现。(图12a至图12c)。

因此，CD71可用于对分化的收缩性心肌细胞的表面标记物，由此，分类的心肌细胞在长期体外培养后也可以维持收缩性心肌细胞的特性。

结果，本发明人员确认了CD71标记物在形成用于纯化心肌细胞及移植心肌细胞的聚集体的过程中，可被用作能够筛选出均匀且纯度高的收缩性心肌细胞的表面标记物。

实施例4：在人类逆分化干细胞(hiPSC)衍生心肌细胞中的CD71标记物

在人类逆分化干细胞(human induced pluripotent stem cells；hiPSC)衍生心肌细胞中，与上述实施例1至3相同地确认CD71表面标记特性。

根据图1所示的方案分化诱导临床等级CMC-11iPSC细胞株17，在与人类胚胎干细胞相同地初始诱导10日之后，观察收缩性心肌细胞(图13)。而且，免疫组织化学染色结果，通过利用CD71表面标记物的流式细胞分析分类的收缩性心肌细胞高度表达作为心肌细胞的特异性标记的cTnT及α-辅肌动蛋白(图14)。

因此，与人类胚胎干细胞相同地，在人类逆分化干细胞衍生心肌细胞中，CD71也可以用作为对于收缩性心肌细胞的表面标记物。

实施例5：通过心肌细胞聚集体确认细胞存活率是否提高

5-1.确认在低氧环境下的细胞存活率是否提高

为了形成细胞聚集体，将通过CD71表面标记物筛选的心肌细胞(1×105cell/ml)移到超低附着(ultra-low attachment；ULA)培养板(Corning，Lowell，MA)或直径为200μm的球形成型盘(spheroid forming dish；SFD，SPL life science，Korea)，在悬浮液中，与包含5％FBS(Gibco)的10ml低糖DMEM(Gibco)培养基一同培养。

在低氧培养条件下，为了分析细胞存活率，在3％O

存活率分析结果，单一细胞死亡90％以上，相反，凝集的心肌细胞在第三日确认了存活50％以上(表2及图15)。并且，当在第一日形成大的聚集体(直径＞300μm)时，三日的死亡率高(图16，白色箭头)，直径小于200μm的聚集体(图16，绿色杆)存活7日以上(未表示数据)。

表2

5-2.在冷冻保存之后，确认细胞存活率是否提高

为了冷冻保存，通过PBS柔和地洗涤聚集体来使其再次悬浮在培养基，在离心分离后取出上层液。在Cryo-vial(Cryotube；Thermo Scientific)中，将凝结物与CryoStor(CS10；Biolife solution)混合来通过-30℃冷却1小时。接着，将小瓶移到LN2罐(MVE-×C-47/11，Chart-MVE)并冷冻保存6个月。在冷冻保存之后，在37℃的bead-bath中对冷冻的小瓶嘉文1分钟，使其再次悬浮在包含5％FBS(Gibco)的10ml低糖DMEM(Gibco)培养基，在1000RPM中离心分离3分钟。在解冻之后，如上述实施例5-1所示，通过LIVE/DEAD分析细胞存活率。

分析结果，直径为300μm以下的聚集体在6个月的冷冻保存之后，存活率的减少并不明显(图17a至图17c及图18)，直径为300μm以上的聚集体在6个月的冷冻保存之后，存活率大幅度减少(表3，图18)。

表3

5-3.心肌细胞聚集体的大小最优化

上述实验结果，考虑到低氧环境及冷冻保存后的存活率，直径小于200μm的聚集体为最优的聚集体大小。

对此，在200μm的SFD(SPL life science)涂膜38个至44个单一收缩心肌细胞之后，培养心肌细胞来形成大小为105μm±5μm的均质的聚集体(图19)。而且，上述均匀形成的聚集体30日以上持续收缩，在长期冷冻保存后，呈现出80％以上的存活率。并且，聚集体的电生理功能也得到了维持(图20)。

上述实验结果，大小过小的聚集体在低氧条件下的存活率低，相反，200μm以上的聚集体在冷冻保存时的存活率急剧降低。另一方面，105±5μm大小的聚集体在长期冷冻后的存活率依然高，且心肌细胞持续收缩。对此，本发明人员考虑到心肌细胞的低氧环境及冷冻保存时，判断为105μm±5μm大小的聚集体为最优的大小。

实施例6：在急性心肌梗塞中的心肌细胞聚集体的治疗功效

为了确认心肌细胞聚集体的治疗功效，确认了向生物体内投入心肌细胞聚集体时的心脏功能改善效果。在大鼠实验之前，确认了用于向生物体内投入心肌细胞聚集体的27G注射器的注入。100μm大小的聚集体在通过27G注射器的期间维持形态(图21a)，200μm大小的聚集体在通过27G注射器的期间被破坏(图21b)。这意味着小于200μm的聚集体可用于导管系统。

6-1.确认心肌细胞聚集体的损伤的心脏功能改善效果

通过2％异氟烷麻醉Fisher 344大鼠(160-180g，8周雄性，Koatec，韩国)，通过器官插入静脉导管。使用聚乙二醇缝合线来缝合左前降支(LAD)1分钟，使用7-0绒缝合线来形成扣来诱导心肌梗塞(myocardial infarction；MI)并确立心肌梗塞组(以下，MI组)。在左冠状动脉闭塞后，在MI组中，通过氯甲基苯甲酰胺(chloromethylbenzamido，CellTrackerCM-DiI)标记PBS、单一心肌细胞或在上述实施例中形成的聚集体，在心肌梗塞的边界区域中，向2个不同的部位进行注射(图21c至图21d)。而且，根据注射的物质，实验组分成对照组(PBS给药组)，单一细胞给药组(单一心肌细胞5×106给药)及聚集体给药组(105±5μm心肌细胞聚集体2×104给药)。之后，使用安装有15MHz L15-7io线性变换器(Affniti 50G，Philips)的经胸超声心动图系统来进行治疗之后，在1周、2周、4周及8周执行超声波检查，由此，测定射血分数(ejection fraction；EF)、缩短分数(fractional shortening；FS)、左心室舒张末期直径(left-ventricular end-diastolic diameter；LVIDd)、左心室舒张末期直径(left-ventricular end systolic diameter；LVID)、相关的相关壁厚(relatedwall thickness；RWT)、间隔壁厚度(septal wall thickness；SWT)及后壁厚度(posteriorwall thickness；PWT)(图22a及图22c)。而且，射血分数(EF)及缩短分数(FS)如下计算。

EF(％)＝[(LVEDV-LVESV)/LVEDV]×100

FS(％)＝[(LVEDD-LVESD)/LVEDD]×100

测定结果，在聚集体给药组中，与对照组及单一细胞给药组相比，左心室舒张末期直径(LVIDd)及左心室收缩末期直径(LVISd)在8周后显著减少(表4、图23及图25)。

表4

尤其，在作为心脏功能评价的重要指标左心室射血分数(left ventricularejection fraction；LVEF)及缩短分数(FS)的情况下，与对照组及单一细胞群相比，聚集体给药组呈现出相当改善的值(表5及图26至图27)。

表5

表6

因此，在上述结果中，与单一心肌细胞相比，本发明的心肌细胞聚集体更有效地改善损伤的心脏功能。

6-2.通过血液动力学分析确认心肌细胞聚集体的心脏功能改善

在实施例6-1中，执行对于诱导MI的大鼠的对照组、单一细胞给药组、聚集体给药组的血液动力学分析。

如实施例6-1所示，向心肌梗塞注入PBS、单一心肌细胞、心肌细胞聚集体，血液动力学分析在大鼠的安乐死前8周末执行，在开胸后，用26号针头穿孔心脏的左心室，并将SF电导导管(SPR-838，Millar)插入左心室。左心室的压力容积(pressure-volume；PV)参数通过将PV变换器系统(MPVS Ultra，emka TECHNOLOGIES，France)与数字转换器(PowerLab16/35，ADInstruments，Colorado Springs，USA)相结合来持续记录。而且，为了追加确认负荷(load)-独立的心脏功能，分析了基于暂时性下腔静脉阻塞(Inferior vena cava；IVC)的终末收缩压-容积关系(end-systolic pressure-volume relationship)和舒张末收缩压容积关系(end-diastolic pressure volume relationship)的倾斜度。

血液动力学分析结果，导出如图28a至图28d的左心室的容积-压力图表，在聚集体组中观察到如每分钟心脏的心输出量(Cardiac output；CO)及每搏输出量(每博输出量)的血液动力学参数的增加(表7至表8及图29至图30)。

表7

表8

并且，与其他两组相比，在聚集体组中观察到与负面的心脏重塑相关最大体积(Vmax)更低(表9及图31)，与其他两组相比，最大收缩期中的最大压力(Pmax)更高，与其他两组相比，作为表示心脏功能的改善的变数的变数的dP/dtmax在聚集体组中呈现出约为1.5倍的值，从而在聚集体组中观察到更高的最大压力变化率，与其他两组相比，作为舒张期的最小压力变化率的dP/dt min低(表10及图32a至图32c)。

表9

表10

而且，与其他两组相比，在聚集体组中，终末收缩压-容积关系更高，相反，舒张末收缩压容积关系更低(表11至表12及图33至图37)，聚集体组的心肌梗塞后的负荷-独立心脏收缩性增加。

表11

表12

综上所述，上述血液动力学分析数据与实施例6-1的超声波结果相同，本发明的细胞聚集体可以显著改善移植对象的心脏功能。

实施例7：当注入心肌细胞聚集体时，确认细胞存活率的提高

为了评价向移植对象的心肌梗塞区域注入的心肌细胞的分布及存活率，执行了免疫组织化学。

如实施例6-1所示，向心肌梗塞注入PBS(对照组)、单一心肌细胞(单一心肌细胞5×106给药；单一细胞给药组)、心肌细胞聚集体(心肌细胞聚集体2×104给药；聚集体给药组)之后，心脏被取出并被冷冻。在此情况下，给药的心肌细胞通过红色荧光染料Dil预先标记。通过PBS洗涤冷冻心脏组织，在含有0.5％Triton X-100的PBS中渗透15分钟，并在室温条件下用3％BSA溶液封闭1小时。之后，在4℃的温度条件下，培养如ACTN2(Sigma)、cTnT(ThermoFisher)、MYH6/7(Abcam)、hMYH7(Abcam)、CD31(Abcam)及GJA1(Abcam)的一抗。通过PBS洗涤3次心脏组织，与二抗一同在室温条件下培养1小时。二抗使用抗小鼠/兔子IgGAlexa Fluor 488(Invitrogen)或抗小鼠/兔子IgG Alexa Fluor647(Invitrogen)。免疫组织化学分析通过3个至5个独立样品执行，所有图像使用Nikon A1R HD25共焦显微镜(NikonCorp，Japan)获取并分析。而且，为了定量分析移植的细胞的存活，在左心室组织的上部、中间及下部计算cTnT表达-Dil标记的细胞(DiI+/cTnT+)密度。而且，执行了将在通过作为心肌特异性标记的MYH6/7移植的心肌细胞中死亡的心肌细胞的比例定量化的TUNEL试验。

分析结果，在聚集体给药组中，心肌细胞分布在左心室的宽广区域，相反，在单一细胞给药组中，心肌细胞仅位于限定位置(图38及图39)。并且，定量分析结果，与单一细胞给药组相比，DiI+/cTnT+细胞在聚集体给药组中的存活率约增加3倍(表13及图40)。

表13

TUNEL试验结果，在聚集体组中，观察到显著低的比例的DiI+/TUNEL+心肌细胞，由此，确认了在聚集体组中，被移植到向心肌梗塞移植的细胞的细胞中死亡的心肌细胞的比例极低(表14及图41)。

表14

根据上述结果，当向对象移植本发明的心肌细胞聚集体时，个别心肌细胞的存活率将增加，并且，若考虑到在聚集体给药组移植的心肌细胞数(2×104)显著低于单一细胞给药组(5×106)，则当本发明的心肌细胞聚集体移植时，显著提高个别心肌细胞的存活率。

实施例8：确认心肌细胞聚集体的心肌细胞存活提高效果

如实施例7所示，在冷冻的心脏组织中，使用一抗ACTN2(Sigma)、cTnT(ThermoFisher)、MYH6/7(Abcam)、hMYH7(Abcam)、CD31(Abcam)及GJA1(Abcam)，作为二抗使用抗小鼠/兔子IgG Alexa Fluor 488(Invitrogen)或抗小鼠/兔子IgG Alexa Fluor 647(Invitrogen)来执行免疫组织化学分析。

染色结果，聚集体组的心肌细胞为与成熟的心肌细胞类似的杆形态，在cTnT表达细胞之间观察到间隙连接蛋白(GJA1)的表达(图42)。并且，肉瘤结构(ACTN2)在DiI-标记的心肌细胞中明确呈现，确认与周边细胞形成间隙连接，仅在聚集体组中观察到这种模式，而在单个细胞群中未观察到(图43)。

并且，DiI表达细胞与hMYH7表达完全相同，观察到与成人心肌细胞类似的矩形细胞(图44及图45)。而且，通过使用CD31抗体的染色，测定梗塞区域及观察到cTnT表达细胞的边界区域内的单位面积的毛细血管的密度的结果，在聚集体组中，在梗塞区域和边界区域均观察到毛细血管密度急稿(图46)，在边界区域中，发现50％以上的毛细血管，这在整个群中最高(表15及图47)。

表15

这些结果标明，以聚集体移植的细胞被移植到受损组织中并被诱导成熟，根据本发明的聚集体注入的心肌细胞有望表现出诱导新血管形成的间接效果。最终，通过本发明的聚集体的心肌细胞移植可以稳定地移植心肌细胞，从而，有望表现出对梗塞的心脏的治疗作用。

产业上的可利用性

本发明涉及提高在冷冻保存及低氧条件下的存活率的心肌细胞聚集体制备技术，根据本发明制备的心肌细胞聚集体在低氧条件下的存活率优秀，可以长期冷冻保存，当长期冷冻保存后向心脏移植时，存活率和心脏功能改善效果非常优秀。