用于检测绦虫的方法、设备、试剂盒和组合物

交叉引用

本申请要求美国临时申请序列号62/740,100(2018年10月2日提交)；62/741,849(2018年10月5日提交)；以及62/746,805(2018年10月17日提交)的优先权的权益，均以引用的方式将其整体并入。

技术领域

本发明涉及用于检测和区分哺乳动物中的绦虫物种的组合物、设备、试剂盒和方法。更具体而言，本发明涉及用于检测来自哺乳动物的样品中绦虫物种的存在或不存在和用于区分绦虫抗原的抗体和抗体组合物、设备、试剂盒和方法。

背景技术

寄生性蠕虫感染在动物中很常见，如果未经诊断和治疗，可导致严重的疾病或死亡。目前用于诊断寄生性蠕虫感染的方法主要包括排泄物样品的显微镜检查，所述粪便样品的显微镜检查直接在排泄物涂片中进行或通过在密度介质中浮选或通过沉降来浓缩虫卵和寄生虫后进行。尽管这种程序被高度采用，但该方法具有明显的不足之处。这些显微镜方法很耗时，并需要专门的设备。此外，这些方法的结果准确性高度依赖操作者的技术和专业知识。例如，绦虫的存在通过寻找卵或节片(proglottids)来确定，但是这些卵或节片是间歇性且少量排泄的。毫不奇怪，常规排泄物检查常不能诊断出绦虫感染。

粪便处理令人讨厌且危险。用于处理粪便的卫生且无害的程序不易操纵，而且通常很复杂。此类程序可包括称量、离心和存储，并且除了在配备有合适的仪器、防护设备和熟练的技术人员的临床实验室中之外，此类程序是困难的。因此，排泄物测试所需的步骤数量的任何减少以及测试操作者与测试材料之间的接触的任何减少是期望的。临床实验室已经使用免疫测定方法来检测排泄物中的各种病毒、细菌和非肠虫(non-helminth)寄生生物和有机体。然而，仍然需要用于检测排泄物、全血或血清中的寄生性蠕虫感染的简单的免疫测定方法。

发明内容

在一个方面，本发明涉及能够特异性结合至绦虫粪抗原的分离的抗体，所述绦虫粪抗原例如带绦虫(Taenia)粪抗原(如豆状带绦虫(Taenia pisiformis)粪抗原或巨颈带绦虫(Taenia taeniaeformis)粪抗原)或犬复孔绦虫(Dipylidium caninum)粪抗原。抗体可被可检测地标记或可被附着至固体支持物。

在一个实施方式中，所述分离的抗体特异性结合豆状带绦虫粪抗原。该抗体不与选自于由以下粪抗原所组成的组中的一种或多种粪抗原进行特异性交叉反应：绦虫巨颈带绦虫、绦虫复孔绦虫(Dipylidium)、钩虫(如钩口线虫(Ancylostoma))、蛔虫(roundworm)(弓首蛔虫(Toxocara))、鞭虫(如毛首线虫(Trichuris))、贾第虫(Giardia)和细小病毒；所述绦虫复孔绦虫为犬复孔绦虫；所述钩虫为犬钩口线虫(Ancylostoma caninum)或管形钩口线虫(Ancylostoma tubaeforme)；所述蛔虫为犬弓首蛔虫(Toxocara canis)或猫弓首蛔虫(Toxocara catti)；所述鞭虫为狐毛首线虫(Trichuris vulpis)或猫毛首线虫(Trichuris felis)；所述贾第虫为蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)；以及所述细小病毒为猫细小病毒或犬细小病毒。

在另一实施方式中，所述分离的抗体特异性结合巨颈带绦虫粪抗原。该抗体不与选自于由以下粪抗原所组成的组中的一种或多种粪抗原进行特异性交叉反应：绦虫豆状带绦虫、绦虫复孔绦虫、钩虫(例如钩口线虫)、蛔虫(弓首蛔虫)、鞭虫(例如毛首线虫)、贾第虫和细小病毒；所述绦虫复孔绦虫为犬复孔绦虫；所述钩虫为犬钩口线虫或管形钩口线虫；所述蛔虫为犬弓首蛔虫或猫弓首蛔虫(Toxocara cati)；所述鞭虫为狐毛首线虫或猫毛首线虫；所述贾第虫为蓝氏贾第虫；以及所述细小病毒为猫细小病毒或犬细小病毒。

在其它实施方式中，所述分离的抗体结合犬复孔绦虫粪抗原。该抗体不与选自于由以下粪抗原所组成的组中的一种或多种粪抗原进行特异性交叉反应：绦虫带绦虫、绦虫复孔绦虫、钩虫(例如钩口线虫)、蛔虫(弓首蛔虫)、鞭虫(例如毛首线虫)、贾第虫和细小病毒，其中，所述绦虫带绦虫为豆状带绦虫或巨颈带绦虫；所述钩虫为犬钩口线虫或管形钩口线虫；所述蛔虫为犬弓首蛔虫或猫弓首蛔虫；所述鞭虫为狐毛首线虫或猫毛首线虫；所述贾第虫为蓝氏贾第虫；以及所述细小病毒为猫细小病毒或犬细小病毒。

在另一方面，本发明涉及免疫复合物，所述免疫复合物包含绦虫粪抗原和特异性结合所述绦虫粪抗原的一种或多种抗体。在一个实施方式中，所述绦虫粪抗原可为来自豆状带绦虫、巨颈带绦虫、肥头带绦虫(Taenia crassiceps)或犬复孔绦虫的粪抗原。在另一实施方式中，所述抗体通过用绦虫的全提取物、绦虫的E/S材料、绦虫的蠕虫洗液(WormWash)或绦虫的TCA可溶性材料进行免疫来获得。在另一实施方式中，所述抗体特异性结合至来自样品(例如获取自感染绦虫的哺乳动物的排泄物样品)的绦虫粪抗原。在一些实施方式中，所述哺乳动物进一步感染有蛔虫、鞭虫和钩虫中的一种或多种，并且所述抗体不特异性结合来自样品中可能存在的蛔虫、鞭虫或钩虫中的一种或多种的任何抗原。在一些实施方式中，所述抗体可被可检测地标记或结合至固体支持物。

在另一方面，本发明涉及免疫复合物，所述免疫复合物包含绦虫粪抗原、特异性结合所述绦虫粪抗原的抗体、以及结合所述绦虫粪抗原的凝集素。所述凝集素可结合至所述绦虫粪抗原上的两种以上的碳水化合物，或可特异性结合至所述绦虫粪抗原上的一种特定类型的碳水化合物。

在另一方面中，本发明提供了用于特异性结合并分离来自样品中的肠虫性抗原(例如来自排泄物样品中的粪抗原)的设备，所述设备包含固体支持物，其中，所述固体支持物在其上固定有选自于由以下抗体所组成的组中的一种或多种抗体：(a)第一抗体，所述第一抗体能够特异性结合来自第一绦虫的粪抗原，但不结合来自第二绦虫的粪抗原或来自第三绦虫的粪抗原；(b)第二抗体，所述第二抗体能够特异性结合来自第二绦虫的粪抗原，但不结合来自第一绦虫的粪抗原或来自第三绦虫的粪抗原；以及，(c)第三抗体，所述第三抗体能够特异性结合来自第三绦虫的粪抗原，但不结合来自第一绦虫的粪抗原或来自第二绦虫的粪抗原。所述设备可为(但不限于)例如ELISA设备，例如侧向流动免疫测定设备或微量滴定板设备。

可经由所述设备对绦虫进行测试的样品包括但不限于：例如，排泄物、消化道黏液、尿液、全血、血清、乳汁和整个组织(例如，来自乳腺、肠、肝、心脏、肺、食道、脑、肌肉和眼的组织)。该设备还可包括(但不必须包括)用于对由以下所组成的组中的一种或多种进行检测的一种或多种试剂：一种或多种肠虫性蠕虫寄生生物、非蠕虫寄生生物、一种或多种病毒、一种或多种真菌、一种或多种原生动物、以及一种或多种细菌。在一些实施方式中，所述固体支持物进一步在其上固定有选自以下抗体的一种或多种抗体：(i)能够特异性结合蛔虫粪抗原但不结合源自于由鞭虫、钩虫、绦虫、贾第虫和细小病毒所组成的组中的粪抗原的抗体；(ii)能够特异性结合鞭虫粪抗原但不结合源自于由蛔虫、钩虫、绦虫、贾第虫和细小病毒所组成的组中的粪抗原的抗体；(iii)能够特异性结合钩虫粪抗原但不结合源自于由鞭虫、蛔虫、绦虫、贾第虫和细小病毒所组成的组中的粪抗原的抗体；(iv)能够特异性结合贾第虫粪抗原但不结合选自于由蛔虫粪抗原、鞭虫粪抗原、钩虫粪抗原、绦虫带绦虫粪抗原、绦虫复孔绦虫粪抗原和细小病毒粪抗原所组成的组中的粪抗原的抗体；以及(v)能够特异性结合细小病毒粪抗原但不结合选自于由蛔虫粪抗原、鞭虫粪抗原、钩虫粪抗原、绦虫带绦虫粪抗原、绦虫复孔绦虫粪抗原和贾第虫粪抗原所组成的组中的粪抗原的抗体。在实施方式中，所述钩虫为钩口线虫，所述蛔虫为弓首蛔虫，所述鞭虫为毛首线虫。在其它实施方式中，所述钩虫为犬钩口线虫或管形钩口线虫；所述蛔虫为犬弓首蛔虫或猫弓首蛔虫；所述鞭虫为狐毛首线虫或猫毛首线虫；所述贾第虫为蓝氏贾第虫；以及，所述细小病毒为猫细小病毒或犬细小病毒。

在一些实施方式中，所述固体支持物在其上固定有两种以上的抗体、三种以上的抗体、四种以上的抗体、五种以上的抗体、六种以上的抗体、七种以上的抗体或八种以上的抗体以允许多重化(multiplexing)。

在另一方面，本发明提供了用于检测粪便样品中存在或不存在一种或多种绦虫粪抗原的设备；所述设备包含固体支持物、凝集素和选自于由以下抗体所组成的组中的一种或多种抗体：(a)第一抗体，所述第一抗体能够特异性结合来自第一绦虫物种的粪抗原，但不结合来自第二绦虫物种的粪抗原或来自第三绦虫物种的粪抗原；(b)第二抗体，所述第二抗体能够特异性结合来自第二绦虫物种的粪抗原，但不结合来自第一绦虫物种的粪抗原或来自第三绦虫物种的粪抗原；以及(c)第三抗体，所述第三抗体能够特异性结合来自第三绦虫物种的粪抗原，但不结合来自第一绦虫物种的粪抗原或来自第二绦虫物种的粪抗原，其中，所述固体支持物在其上固定有一种或多种凝集素或一种或多种抗体。在一些实施方式中，所述凝集素固定在所述固体支持物上。在其它实施方式中，第一抗体、第二抗体和第三抗体固定在所述固体支持物上。在其它实施方式中，所述设备进一步包含一个或多个种类(speicies)的绦虫抗原，其中，所述一个或多个种类的绦虫抗原特异性结合至所述抗体。在一些实施方式中，第一绦虫物种为豆状带绦虫，第二绦虫物种为巨颈带绦虫，和/或第三绦虫物种为犬复孔绦虫。

在又一方面，本发明提供了检测样品中存在或不存在一种或多种肠虫性抗原(例如来自排泄物样品的粪抗原)的方法，所述方法包括：(a)使来自哺乳动物的样品与选自于由以下抗体所组成的组中的一种或多种抗体接触：(i)第一抗体，所述第一抗体能够特异性结合来自第一绦虫的粪抗原，但不结合来自第二绦虫的粪抗原或来自第三绦虫的粪抗原；(ii)第二抗体，所述第二抗体能够特异性结合来自第二绦虫的粪抗原，但不结合来自第一绦虫的粪抗原或来自第三绦虫的粪抗原；以及(iii)第三抗体，所述第三抗体能够特异性结合来自第三绦虫的粪抗原，但不结合来自第一绦虫的粪抗原或来自第二绦虫的粪抗原；(b)在样品中存在所述粪抗原(如果有的话)的情况下，形成抗体-粪抗原复合物；以及(c)检测所述抗体-粪抗原复合物(如果有的话)的存在或不存在。绦虫的粪抗原可包括带绦虫物种(如豆状带绦虫和巨颈带绦虫)和复孔绦虫物种(如犬复孔绦虫)的粪抗原。在一个实施方式中，检测复合物存在或不存在的步骤进一步包括提供结合所述复合物中的至少一种的凝集素的步骤。在一些实施方式中，凝集素可被可检测地标记或固定在固体支持物上。在其它实施方式中，第一抗体、第二抗体和第三抗体被可检测地标记或固定在固体支持物上。在一些实施方式中，第一抗体、第二抗体和第三抗体可被固定在固体支持物上，并且所述凝集素可被可检测地标记。在其它实施方式中，第一抗体、第二抗体和第三抗体可被可检测地标记，并且所述凝集素可被固定在固体支持物上。

在另一实施方式中，其中在使来自哺乳动物的排泄物样品与至少一种抗体接触的步骤之前，所述方法进一步包括使排泄物样品与一种或多种凝集素接触的步骤。所述一种或多种凝集素可被可检测地标记或固定在固体支持物上。或者，第一抗体、第二抗体和第三抗体可被可检测地标记或固定在固体支持物上。在一个实施方式中，第一抗体、第二抗体和第三抗体可被固定在固体支持物上，并且所述一种或多种凝集素可被可检测地标记。在另一实施方式中，第一抗体、第二抗体和第三抗体可被可检测地标记，并且所述一种或多种凝集素可被固定在固体支持物上。

一方面，实施所述方法以针对绦虫抗原对哺乳动物排泄物样品进行测试。然而，不限于实施所述方法来测试排泄物样品。因此，除了排泄物之外，样品还可以为(但不限于)例如全血、血清、乳汁和整个组织(例如来自乳腺、肠、肝、心脏、肺、食道、脑、肌肉和眼的组织)。

在又一方面，本发明提供了诊断哺乳动物是否感染有一种或多种寄生性蠕虫的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使来自哺乳动物的样品与选自于由以下抗体所组成的组中的一种或多种抗体接触：(i)第一抗体，所述第一抗体能够特异性结合来自第一绦虫的粪抗原，但不结合来自第二绦虫的粪抗原或来自第三绦虫的粪抗原；(ii)第二抗体，所述第二抗体能够特异性结合来自第二绦虫的粪抗原，但不结合来自第一绦虫的粪抗原或来自第三绦虫的粪抗原；以及(iii)第三抗体，所述第三抗体能够特异性结合来自第三绦虫的粪抗原，但不结合来自第一绦虫的粪抗原或来自第二绦虫的粪抗原；(b)在样品中存在所述粪抗原(如果有的话)的情况下，形成抗体-粪抗原复合物；(c)检测所述抗体-粪抗原复合物(如果有的话)的存在或不存在；以及(d)将所述哺乳动物诊断为具有：(i)第一绦虫感染(如果存在第一绦虫抗体-粪抗原复合物)；(ii)第二绦虫感染(如果存在第二绦虫抗体-粪抗原复合物)；以及(iii)第三绦虫感染(如果存在第三绦虫抗体-粪抗原复合物)。在一个实施方式中，选择两种以上的抗体、三种以上的抗体、四种以上的抗体、五种以上的抗体、六种以上的抗体、七种以上的抗体或八种以上的抗体。在一些实施方式中，检测复合物存在或不存在的步骤进一步包括提供结合所述复合物中的至少一种的一种或多种凝集素的步骤。在一些实施方式中，所述凝集素可被可检测地标记或固定在固体支持物上。在其它实施方式中，第一抗体、第二抗体和第三抗体被可检测地标记或固定在固体支持物上。在一些实施方式中，第一抗体、第二抗体和第三抗体可被固定在固体支持物上，并且所述凝集素可被可检测地标记。在其它实施方式中，第一抗体、第二抗体和第三抗体可被可检测地标记，并且所述凝集素可被固定在固体支持物上。

在另一实施方式中，其中在使来自哺乳动物的排泄物样品与至少一种抗体接触的步骤之前，所述方法进一步包括使所述排泄物样品与一种或多种凝集素接触的步骤。所述凝集素可被可检测地标记或固定在固体支持物上。或者，第一抗体、第二抗体和第三抗体可被可检测地标记或固定在固体支持物上。在一个实施方式中，第一抗体、第二抗体和第三抗体可被固定在固体支持物上，并且所述凝集素可被可检测地标记。在另一实施方式中，第一抗体、第二抗体和第三抗体可被可检测地标记，并且所述凝集素可被固定在固体支持物上。

在进一步的方面，本发明提供了诊断和治疗感染有一种或多种寄生性蠕虫的哺乳动物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使来自哺乳动物的样品与选自于由以下抗体所组成的组中的至少一种抗体接触：(i)第一抗体，所述第一抗体能够特异性结合来自第一绦虫的粪抗原，但不结合来自第二绦虫的粪抗原或来自第三绦虫的粪抗原；(ii)第二抗体，所述第二抗体能够特异性结合来自第二绦虫的粪抗原，但不结合来自第一绦虫的粪抗原或来自第三绦虫的粪抗原；以及(iii)第三抗体，所述第三抗体能够特异性结合来自第三绦虫的粪抗原，但不结合来自第一绦虫的粪抗原或来自第二绦虫的粪抗原；(b)在样品中存在所述粪抗原(如果有的话)的情况下，形成抗体-粪抗原复合物；(c)检测抗体-粪抗原复合物(如果有的话)的存在或不存在；以及(d)将所述哺乳动物诊断为具有：(i)第一绦虫感染(如果存在第一绦虫抗体-粪抗原复合物)；(ii)第二绦虫感染(如果存在第二绦虫抗体-粪抗原复合物)；以及(iii)第三绦虫感染(如果存在第三绦虫抗体-粪抗原复合物)；以及(e)给予有效量的一种或多种治疗剂，以治疗具有第一绦虫感染、第二绦虫感染或第三绦虫感染或它们的组合的哺乳动物。在一个实施方式中，选择两种以上的抗体。在其它实施方式中，步骤(e)进一步包括一种或多种额外的治疗剂用于治疗以下的感染：一种或多种肠虫性蠕虫寄生生物、一种或多种非蠕虫寄生生物、一种或多种病毒、一种或多种真菌、一种或多种原生动物、或者一种或多种细菌。在其它实施方式中，步骤(e)进一步包括一种或多种治疗剂以控制、驱除或杀死以下的中间宿主：扁形动物蠕虫寄生生物、肠虫性蠕虫寄生生物、非蠕虫寄生生物、病毒、真菌或细菌。中间宿主的代表性实例包括可携带绦虫卵的犬嚼虱(chewing lice)和蚤类。

在上述方法的进一步的实施方式中，步骤(a)的组进一步由以下组成：(i)能够特异性结合蛔虫粪抗原但不结合源自于由鞭虫、钩虫、绦虫、贾第虫和细小病毒所组成的组中的粪抗原的抗体；(ii)能够特异性结合鞭虫粪抗原但不结合源自于由蛔虫、钩虫、绦虫、贾第虫和细小病毒所组成的组中的粪抗原的抗体；(iii)能够特异性结合钩虫粪抗原但不结合源自于由鞭虫、蛔虫、绦虫、贾第虫和细小病毒所组成的组中的粪抗原的抗体；(iv)能够特异性结合贾第虫粪抗原但不结合选自于由蛔虫粪抗原、鞭虫粪抗原、钩虫粪抗原、绦虫带绦虫粪抗原、绦虫复孔绦虫粪抗原和细小病毒粪抗原所组成的组中的粪抗原的抗体；以及(v)能够特异性结合细小病毒粪抗原但不结合选自于由蛔虫粪抗原、鞭虫粪抗原、钩虫粪抗原、绦虫带绦虫粪抗原、绦虫复孔绦虫粪抗原和贾第虫粪抗原所组成的组中的粪抗原的抗体。在一些实施方式中，所述钩虫为钩口线虫，所述蛔虫为弓首蛔虫，所述鞭虫为毛首线虫。在其它实施例中，所述钩虫为犬钩口线虫或管形钩口线虫；所述蛔虫为犬弓首蛔虫或猫弓首蛔虫；所述鞭虫为狐毛首线虫或猫毛首线虫；所述贾第虫为蓝氏贾第虫；以及所述细小病毒为猫细小病毒或犬细小病毒。因此，使排泄物样品与两种以上的抗体、三种以上的抗体、四种以上的抗体、五种以上的抗体、六种以上的抗体、七种以上的抗体、或八种以上的抗体接触以允许多重化。

在上述方法的进一步实施方式中，步骤(d)的诊断进一步包括：蛔虫感染(如果存在蛔虫抗体-粪抗原复合物)；鞭虫感染(如果存在鞭虫抗体-粪抗原复合物)；钩虫感染(如果存在钩虫抗体-粪抗原复合物)；贾第虫(如果存在贾第虫抗体-粪抗原复合物)；以及细小病毒感染(如果存在细小病毒抗体-粪抗原复合物)。

在一些实施方式中，检测复合物存在或不存在的步骤进一步包括提供结合所述复合物中的至少一种的一种或多种凝集素的步骤。在一些实施方式中，所述凝集素可被可检测地标记或固定在固体支持物上。在其它实施方式中，第一抗体、第二抗体和第三抗体被可检测地标记或固定在固体支持物上。在一些实施方式中，第一抗体、第二抗体和第三抗体可被固定在固体支持物上，并且所述凝集素可被可检测地标记。在其它实施方式中，第一抗体、第二抗体和第三抗体可被可检测地标记，并且所述凝集素可被固定在固体支持物上。

所述方法还可用于测试以及区分具有绦虫的环境污染。可通过所述设备对绦虫进行测试的环境样品包括但不限于土壤、分解的材料、或来自住宅环境(包括院子、花园、沙箱、游戏场地)的排泄物物质。测试位置还可包括公园，海滩，森林，农场，或暴露于狗、猫或绦虫的其它哺乳动物宿主的排泄物材料的其它位置。还可以测试室内和室外垃圾箱中的排泄物。

在又一方面，本发明包括用于实施本发明方法的一个或多个步骤的试剂盒。所述试剂盒可任选地包括例如本发明的一种或多种组合物和设备以及用于实施本发明的方法的说明。所述试剂盒可进一步任选地包含例如一种或多种指示试剂、一种或多种抗体标记化合物、一种或多种抗体、一种或多种抗原捕获试剂、一种或多种抑制剂、以及一种或多种洗涤试剂，以用作所述设备的一部分和/或用于所述所述方法。

附图说明

图1示出了通过按照实施例1A中所示的本发明的方法，针对来自对绦虫感染呈阴性或阳性的犬科动物的排泄物提取物和蠕虫提取物对抗体ADX131的OD测定。阳性＝来自豆状带绦虫感染的狗的排泄物提取物(FEX)；阴性＝来自未感染豆状带绦虫的狗的FEX；蠕虫提取物＝豆状带绦虫蠕虫提取物(WE)。

图2示出了通过按照实施例1A中所示的本发明的方法，针对来自对绦虫感染呈阴性或阳性的犬科动物的排泄物提取物和蠕虫提取物对抗体ADX132的OD测定。阳性＝来自豆状带绦虫感染的狗的排泄物提取物(FEX)；阴性＝来自未感染豆状带绦虫的狗的FEX；蠕虫提取物＝豆状带绦虫蠕虫提取物(WE)。

图3示出了微量滴定板，在所述微量滴定板中按照实施例1B中所示的本发明的方法，使用感染有绦虫的犬科动物的排泄物提取物进行ELISA测定。H11为阴性对照。A5、B6、B8、E6和E10是来自五只豆状带绦虫阳性狗的排泄物提取物。每个其它的孔都有排泄物提取物，所述排泄物提取物来自以下中的一种：钩虫犬钩口线虫感染的狗、或蛔虫犬弓首蛔虫感染的狗、或鞭虫狐毛首线虫感染的狗、或犬复孔绦虫感染的狗。

图4示出了夹心粪抗原ELISA测定的特异性，所述ELISA测定使用包被在微量滴定板上的抗体ADX131，以及在添加患者样品后施加的ADX132-HRP缀合物。如实施例1B所讨论，该测定在以下物质上运行：犬复孔绦虫WE，豆状带绦虫WE，肥头带绦虫WE，巨颈带绦虫WE，巨颈带绦虫E/S，以及来自犬复孔绦虫阳性的狗、犬复孔绦虫阴性的狗、犬复孔绦虫阳性的猫、犬复孔绦虫阴性的猫、豆状带绦虫阳性的狗、豆状带绦虫阴性的狗、三只巨颈带绦虫阳性的猫科动物的合并、三只巨颈带绦虫阴性的猫科动物的合并的FEX，钩虫犬钩口线虫WE，蛔虫犬弓首蛔虫WE，以及鞭虫狐毛首线虫WE。

图5示出了夹心粪抗原ELISA测定的敏感性，所述ELISA测定使用包被在微量滴定板上的抗体ADX185，随后添加患者样品，然后添加巨颈带绦虫WE兔pAb-HRP缀合物。如实施例2B(B部分)中所讨论的，在来自7只巨颈带绦虫阳性的猫科动物和3只巨颈带绦虫阴性的猫科动物的FEX上运行所述测定。

图6示出了夹心粪抗原ELISA测定的特异性，所述ELISA测定使用包被在微量滴定板上的抗体ADX184，以及在添加患者样品后施加的ADX193-HRP缀合物。如下所述，ADX193是巨颈带绦虫E/S小鼠mAb。如在实施例2B(B部分)中所讨论，该测定在以下物质上运行：犬复孔绦虫WE，豆状带绦虫WE，肥头带绦虫WE，巨颈带绦虫WE，巨颈带绦虫E/S，以及来自犬复孔绦虫阳性的狗、犬复孔绦虫阴性的狗、犬复孔绦虫阳性的猫、犬复孔绦虫阴性的猫、豆状带绦虫阳性的狗、豆状带绦虫阴性的狗、三只巨颈带绦虫阳性的猫科动物的合并、和三只巨颈带绦虫阴性的猫科动物的合并的排泄物提取物。

图7示出了ADX184/ADX193-HRP ELISA测定的结果，如在实施例2C(A部分)中所讨论，所述ELISA测定在以下物质上运行：来自六只巨颈带绦虫阳性的猫的排泄物提取物、来自四只巨颈带绦虫阴性的猫的排泄物提取物、和一份巨颈带绦虫E/S蛋白样品。

图8示出了粪抗原ELISA测定的结果，所述ELISA测定使用包被在微量滴定板上的抗体ADX191和缀合有HRP的ADX194。两种小鼠mAb均以3μg/mL的浓度使用。如在实施例2D中所讨论的，该ELISA在以下物质上运行：来自六只巨颈带绦虫阳性的猫的排泄物提取物、来自四只巨颈带绦虫阴性的猫的排泄物提取物、和一份巨颈带绦虫E/S蛋白样品。

图9示出了ELISA测定的结果，所述ELISA测定使用包被在板上的犬复孔绦虫WE兔pAb，以5μg/mL与FEX接触，然后以3μg/mL与犬复孔绦虫WE兔pAb-HRP缀合物接触，然后与有色底物接触。对来自数个肠虫物种的蠕虫提取物进行犬复孔绦虫WE兔pAb ELISA测定，如实施例3B(A部分)中所讨论的，所述蠕虫提取物为：犬复孔绦虫WE、豆状带绦虫WE、肥头带绦虫WE、钩虫犬钩口线虫WE、蛔虫犬弓首蛔虫WE、鞭虫狐毛首线虫WE。

图10示出了粪抗原ELISA测定的结果，其中，如在实施例3E(A部分)中所讨论的，将犬复孔绦虫WE小鼠pAb包被在板上，与FEX接触，然后与犬复孔绦虫WE小鼠pAb-HRP缀合物接触，然后与有色底物接触。如在实施例3E(A部分)中所讨论的，该测定在来自以下的排泄物提取物上运行：4只犬复孔绦虫阳性的狗和3只犬复孔绦虫阳性的猫；一只感染有贾第虫和巨颈带绦虫的犬复孔绦虫阴性的猫，一只感染有巨颈带绦虫的犬复孔绦虫阴性的猫，以及一只感染有犬弓首蛔虫和豆状带绦虫的犬复孔绦虫阴性的狗。

图11示出了第一粪抗原ELISA测定的结果，所述ELISA测定使用包被在板上的小鼠mAb ADX226，与FEX接触，然后与小鼠mAb ADX251-HRP缀合物接触，然后与有色底物接触。如在实施例3F(A部分)中所讨论的，该测定在来自以下的排泄物提取物上运行：3只犬复孔绦虫阳性的狗，5只犬复孔绦虫阴性的狗；3只犬复孔绦虫阳性的猫，和1只犬复孔绦虫阴性的猫。

图12示出了第二粪抗原ELISA测定的结果，所述ELISA测定使用包被在板上的小鼠mAb ADX251，与FEX接触，然后与小鼠mAb ADX227-HRP缀合物接触，然后与有色底物接触。如在实施例3F(A部分)中所讨论的，该测定在来自以下的排泄物提取物上运行：3只犬复孔绦虫阳性的狗，5只犬复孔绦虫阴性的狗；3只犬复孔绦虫阳性的猫，和1只犬复孔绦虫阴性的猫。

图13示出了第三粪抗原ELISA测定的结果，所述ELISA测定使用包被在板上的小鼠mAb ADX251，与FEX接触，然后与犬复孔绦虫WE兔pAb-HRP缀合物接触，然后与有色底物接触。如在实施例3F(A部分)中所讨论的，该测定在来自以下的排泄物提取物上运行：3只犬复孔绦虫阳性的狗，5只犬复孔绦虫阴性的狗；3只犬复孔绦虫阳性的猫，和1只犬复孔绦虫阴性的猫。

图14示出了第一组粪抗原ELISA测定配置的结果，其中，如在实施例3G(A部分)中所讨论的，将犬复孔绦虫WE小鼠mAb ADX224、ADX225、ADX226和ADX227分别包被在板上，与FEX接触，然后与犬复孔绦虫WE兔pAb-HRP缀合物接触，随后与有色底物接触。

图15示出了第二组粪抗原ELISA测定配置的结果，其中，如在实施例3G(A部分)中所讨论的，将犬复孔绦虫WE小鼠mAb ADX226和ADX227分别包被在板上，与FEX接触，然后与犬复孔绦虫WE小鼠mAb-HRP缀合物ADX227-HRP接触，随后与有色底物接触。

图16示出了确定犬复孔绦虫WE小鼠mAb ADX226所结合的粪抗原是否为糖基化的结果，如在实施例3H(第1部分)中所讨论的，通过使用商业化试剂盒(来自VectorLaboratories，Burlingame，CA的生物素化凝集素试剂盒I、II和III)测试21种不同的凝集素结合粪抗原的能力来进行。

图17示出了确定抗体犬复孔绦虫WE兔pAb所结合的粪抗原是否为糖基化的结果，如在实施例3H(第2部分)中所讨论的，通过使用商业化试剂盒(来自Vector Laboratories，Burlingame，CA的生物素化凝集素试剂盒I、II和III)对21种不同的凝集素关于它们结合粪抗原的能力进行测试来进行。

图18示出了确定犬复孔绦虫WE兔pAb和ADX187(犬复孔绦虫WE小鼠mAb)所结合的粪抗原是否为糖基化的结果，如在实施例3H(第3部分)中所讨论的，通过使用商业化试剂盒(来自Vector Laboratories，Burlingame，CA的生物素化凝集素试剂盒I、II和III)对21种不同的凝集素关于它们结合粪抗原的能力进行测试来进行。

图19示出了微量滴定板，如在实施例4中所讨论的，在所述微量滴定板中使用来自各种被感染的犬科动物和猫科动物的排泄物提取物进行一系列的T.p.、巨颈带绦虫、D.c.、钩虫、蛔虫、鞭虫和贾第虫ELISA测定。ELISA测定中测试了来自以下来源的排泄物提取物：豆状带绦虫阳性的狗(图19，第1列)、巨颈带绦虫感染的猫(图19，第2列)、犬复孔绦虫感染的狗(图19，第3列)、犬复孔绦虫感染的猫(图19，第4列)、钩虫犬钩口线虫感染的狗(图19，第5列)、钩虫管形钩口线虫感染的猫(图19，第6列)、蛔虫犬弓首蛔虫感染的狗(图19，第7列)、蛔虫猫弓首蛔虫感染的猫(图19，第8列)、鞭虫狐毛首线虫感染的狗(图19，第9列)、鞭虫猫毛首线虫感染的猫(图19，第10列)，贾第虫感染的狗(图19，第11列)、贾第虫感染的猫(图19，第12列)、和两只细小病毒感染的猫(图19，第13和14列)。在图19中，第1列至第12列是单个微量滴定板的图像，第13列和第14列是另一个单独的微量滴定板的图像。

图20示出了微量滴定板，如在实施例5中所讨论的，在所述微量滴定板中使用来自各种被感染的犬科动物和猫科动物的排泄物提取物进行了一系列能够检测来自带绦虫属(如豆状带绦虫、巨颈带绦虫)和复孔绦虫属(如犬复孔绦虫)的两个或三个绦虫物种的ELISA测定。在该ELISA测定中测试了来自以下来源的排泄物提取物：四只豆状带绦虫阳性的狗(图20，第1、4、7和10列)、四只巨颈带绦虫感染的猫(图20，第2、5、8和11列)、两只犬复孔绦虫感染的狗(图20，第3和6列)、两只犬复孔绦虫猫感染的猫(图20，第9和12列)。在图20中，第1列至第12列是单个微量滴定板的图像。

具体实施方式

本发明的优选实施方式的详细说明

I.引言

本发明总体上涉及用于检测和区分获取自哺乳动物的排泄物样品中的绦虫种类的方法、设备和试剂盒。本发明涉及来自多种绦虫物种(包括豆状带绦虫、巨颈带绦虫和犬复孔绦虫)的绦虫粪抗原。特别是，本发明涉及用于检测绦虫感染以及区分两种以上的绦虫物种的方法、设备和试剂盒。

本发明提供了对现有显微检查技术的优良替代方式。这是真的，因为本发明提供了用于检测来自哺乳动物的样品中存在或不存在绦虫的设备、试剂盒和方法，所述设备、试剂盒和方法(1)易于使用并且产生一致的可靠结果；(2)使得能够确定哺乳动物中存在或不存在特定的绦虫物种，无论该哺乳动物是否感染了一种以上绦虫物种和/或其它肠虫性蠕虫寄生生物(例如钩虫、蛔虫、鞭虫和/或心丝虫(heartworm))；(3)可在卵和节片首次出现在感染宿主的排泄物中之前检测到绦虫；以及(4)可区分不同的绦虫物种以及肠虫性蠕虫寄生生物(例如蛔虫、鞭虫和钩虫)感染。

本发明部分地基于发现对绦虫感染而言特异的组合物的预料不到的性质。具体而言，已确定针对蠕虫特异性多肽而产生(或针对全绦虫提取物、绦虫的E/S材料、绦虫的蠕虫洗液或绦虫的TCA可溶性材料而产生)的抗体可用于捕获、检测并区分绦虫抗原与哺乳动物中的不同物种。对各个类型的绦虫物种的特异性令人惊讶，因为绦虫是相关的带虫(cestode)，并且针对从这些绦虫物种中任一种分离出的蛋白质而产生的抗体预计将与其它绦虫物种、宿主抗原、或其它宿主组分中的一种或多种发生交叉反应。

进一步确定了这种抗体可用于在排泄物中可见卵和节片之前捕获和检测哺乳动物中的绦虫抗原。这种在感染后不久以及在感染的哺乳动物的排泄物中出现任何虫卵之前检测绦虫的能力是令人惊讶的，因为虫卵和节片通常在宿主受感染后的数周才出现在感染的宿主的排泄物中。

因此，本发明包括使用抗体和/或其片段来特异性捕获和检测和区分哺乳动物中不同绦虫物种的抗原的方法、设备和试剂盒。本发明的即使当还存在一个以上其它绦虫物种或不同蠕虫类型时检测和诊断特定绦虫种类的能力使哺乳动物的照料者有机会最佳地选择从哺乳动物中驱除绦虫以及其它蠕虫(例如蛔虫、鞭虫和/或钩虫)的治疗方法。此外，在某些情况下，本发明在排泄物中出现卵和节片之前检测绦虫的能力提供了如下的可能性：照料者可以在哺乳动物严重患病之前开始此类治疗。排泄物中虫卵和节片出现之前的干预也将显著减少或消除侵染传播到其它动物或人的可能性。

II.术语的定义和使用

术语“本发明的组合物”是指可用于通过实施在本文中明确地描述、隐含地涵盖或以其它方式公开的本发明的方法来检测获得自哺乳动物的样品中存在或不存在绦虫的所有核酸，多肽，糖蛋白，碳水化合物，糖脂，抗体，以及包含这些核酸、多肽、糖蛋白、碳水化合物、糖脂和抗体中的一种或多种以及一种或多种其它化合物的混合物。

可通过本发明检测其中的绦虫的“来自哺乳动物的样品”包括可能含有绦虫抗原的所有机体组分及其提取物(例如任何流体、固体、细胞或组织)。因此，示例性样品包括但不限于为排泄物、乳、全血及其部分(包括血清)，并进一步包括组织提取物，包括例如来自乳腺、肠、肝、心脏、肺、食道、脑、肌肉和眼的组织。样品可直接取自哺乳动物，或者样品可取自与哺乳动物接触过的任何事物。例如，样品可为来自哺乳动物的新鲜或分解的粪便排泄物。作为另一实例，样品可包括例如土壤、尘土、沙、植物材料、或可能与可由哺乳动物留下的机体组分(例如排泄物)混合的任何其它材料。因此，样品可以取自环境来源，包括来自森林、农场或住宅环境(包括垃圾箱、院子、花园、沙箱、游戏场所、公园和海滩)的排泄物物质、分解的材料或土壤。无论样品的来源或内含物如何，有时在本文中将这种样品称为“样品”、“哺乳动物样品”、“测试样品”或“被测样品”。

如本文所使用的“核酸”与“基因”、“DNA”、“cDNA”、“EST”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多聚核酸(polynucleic acid)”、“RNA”和“mRNA”同义，因此可与“基因”、“DNA”、“cDNA”、“EST”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多聚核酸”、“RNA”和“mRNA”互换使用。核酸可为双链形式，或者其可为单链形式。此外，核酸例如是天然分离的(例如从完整绦虫或其部分中分离)，或者核酸例如是在重组宿主有机体中或通过熟练技术人员已知的任何其它人工手段来人工合成的，例如，通过运用基于PCR的技术、通过创建合成该核酸的转基因有机体、通过使用DNA合成机器、或通过任何其它基于分子的技术。

“多肽”、“肽”和“蛋白质”是同义术语，在本文中可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物。本发明的多肽、肽和蛋白质例如可为天然分离的(例如从完整绦虫或绦虫的部分中分离)，或者例如可为在重组宿主有机体中或通过熟练技术人员已知的任何其它人工手段来人工合成的。本发明的多肽、肽和蛋白质可为糖基化的多肽、肽和蛋白质。

术语“抗体”或“本发明的抗体”是指能够特异性结合至特定蠕虫的一种或多种抗原而不结合来自其它蠕虫的抗原的任何抗体。例如，针对一个绦虫物种的抗体能够特异性结合至该绦虫物种的抗原，但不结合来自不同绦虫物种的任何抗原。本发明的抗体可针对本发明的一种或多种免疫原性多肽、糖蛋白、碳水化合物或糖脂而产生。除非另有说明，否则应当理解，本发明的抗体可包括两种以上的不同类型的抗体的混合物。例如，所述抗体可为两种类型抗体的混合物，其中，两种类型中的一种特异性结合一种特定的抗原，而两种类型中的另一种特异性结合某种其它的抗原。

如本文所使用的术语“第一抗体”是指能够特异性结合来自第一绦虫物种的粪抗原但不结合来自第二绦虫物种的粪抗原或来自第三绦虫物种的粪抗原的一种或多种抗体。

如本文所使用的术语“第二抗体”是指能够特异性结合来自第二绦虫物种的粪抗原但不结合来自第一绦虫物种的粪抗原或来自第三绦虫物种的粪抗原的一种或多种抗体。

如本文所使用的术语“第三抗体”是指能够特异性结合来自第三绦虫物种的粪抗原但不结合来自第一绦虫物种的粪抗原或来自第三绦虫物种的粪抗原的一种或多种抗体。

“本发明的免疫原性多肽”以及更简单的“本发明的多肽”是可以针对其产生本发明的抗体的免疫原。所有“本发明的多肽”都是免疫原性的，因此可以用于在宿主动物中引发免疫应答以产生本发明的抗体。除非另有说明，否则应当理解，本发明的多肽可为多种组分的混合组合物中的一种组分。

“免疫原”为例如能够在暴露于该试剂的动物中引起免疫应答的任何试剂，例如本发明的免疫原性提取物、多肽、糖蛋白、碳水化合物或糖脂。

如本文所使用的术语“绦虫”是指扁形动物蠕虫寄生生物，例如肠道绦虫，包括带绦虫属和复孔绦虫属。因此，如本文所使用的术语“绦虫”不是指绦虫纲(cestoda)的整体，而是指多节绦虫亚纲(eucestoda)，包括假叶目(pseudophyllidea)。绦虫的代表性实例包括豆状带绦虫、巨颈带绦虫、肥头带绦虫、犬复孔绦虫、Diphyllobothrium mansonoide、阔节裂头绦虫(Diphyllobothrium latum)和欧猬迭宫绦虫(Spirometraerinaceieuropaei)。

“绦虫粪抗原”或“来自绦虫的粪抗原”是存在于具有绦虫感染的哺乳动物的排泄物中并且可以被本发明的一种或多种抗体特异性结合的任何绦虫产物。例如，绦虫粪抗原可为但不限于本发明的多肽中的一种或多种。

如本文所使用的术语“蛔虫”是指肠虫，例如蛔目(Ascaridida)的肠道蛔虫，其包括弓首属、弓蛔属(Toxascaris)、贝蛔属(Baylisascaris)、禽蛔属(Ascaridia)、副蛔虫属(Parascaris)、蛔属(Ascaris)、异尖线虫属(Anisakis)和伪地新线虫属(Pseudoterranova)。因此，示例性的蛔虫包括犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫和狮弓蛔虫(Toxascaris leonina)。因此，如本文所使用的术语“蛔虫”并不指线虫门(Nematoda)的整体。因此，“蛔虫”不包括任何钩口属、弯口属(Uncinaria)、板口线虫属(Necator)、毛首属(Trichuris)、吴策属(Wuchereria)、布鲁线虫属(Brugia)或恶丝虫属(Dirofilaria)的成员。

“蛔虫粪抗原”或“来自蛔虫的粪抗原”是存在于具有线虫感染的哺乳动物的排泄物中并且可被本发明的抗体中的一种或多种特异性结合的任何线虫产物。例如，蛔虫粪抗原可为但不限于DIV6728的新颖的C端7kD亚型，其为犬弓首蛔虫的排泄/分泌蛋白，在早至犬科动物首次被犬弓首蛔虫感染后的38天就存在于犬弓首蛔虫感染的犬科动物的排泄物中。因此，“蛔虫粪抗原”可为在犬科动物排泄物中观测到的DIV6728的这种新颖的C端7kD亚型(在本文中称作“Copro6728”)，如在美国专利No.7,951,547中所讨论的。

如本文所使用的术语“鞭虫”是指例如以下的肠虫：毛首属和毛尾属(Trichocephalus)的肠道鞭虫。因此，示例性的鞭虫包括狐毛首线虫、Trichuriscampanula、有齿毛首线虫(Trichuris serrata)、猫毛首线虫(Trichuris felis)、猪毛首线虫(Trichuris suis)、毛首鞭形线虫(Trichuris trichiura)、褪色毛首线虫(Trichurisdiscolor)和Trichocephalus trichiuris。此外，如本文所使用的术语“鞭虫”并不指线虫门的整体。例如，“鞭虫”不包括任何钩口属、弯口属、板口线虫属、弓首属、弓蛔属、蛔属、吴策属、布鲁线虫属或恶丝虫属的成员。

“鞭虫粪抗原”或“来自鞭虫的粪抗原”是存在于具有鞭虫感染的哺乳动物的排泄物中并且可被本发明的抗体中的一种或多种特异性结合的任何鞭虫产物。例如，鞭虫粪抗原可为但不限于“DIV6901”或“DIV6902”，此后，其特定的抗体被称作“抗DIV6901”或“抗DIV6902”，如美国专利No.7,951,547中所讨论的。

如本文所使用的术语“钩虫”是指例如以下的肠虫：钩口属、板口线虫属和弯口属的肠道钩虫。因此，示例性的钩虫包括犬钩口线虫、巴西钩口线虫(Ancylostomabraziliense)、十二指肠钩口线虫(Ancylostoma duodenal)、锡兰钩口线虫(Ancylostomaceylanicum)、管形钩口线虫和Ancylostoma pluridentatum、美洲板口钩虫(Necatoramericanus)、以及狭首弯口线虫(Uncinaria stenocephala)。此外，如本文所使用的术语“钩虫”并不指线虫门的整体。例如，“钩虫”不包括任何毛首属、毛尾属、弓首属、弓蛔属、蛔属、吴策属、布鲁线虫属或恶丝虫属属的成员。

“钩虫粪抗原”或“来自钩虫的粪抗原”是存在于具有钩虫感染的哺乳动物的排泄物中并且可被本发明的抗体中的一种或多种特异性结合的任何钩虫产物。例如，钩虫粪抗原可为但不限于ASP5新颖的N-端28kDa亚型，其为钩口线虫的排泄/分泌蛋白，在早至犬科动物首次感染钩口线虫后的9天就存在于所述钩口线虫感染的犬科动物的排泄物中。因此，“钩虫粪抗原”可为在犬科动物排泄物中观测到的ASP5的这种新颖的N-端28kDa亚型(在本文中称作“CoproASP5”)，如在美国专利No.7,951,547中所讨论的。

如本文所用的术语“贾第虫”是指贾第虫属的原生动物。因此，示例性贾第虫种类包括蓝氏贾第虫，也称为肠贾第虫(Giardia intestinalis)。

“贾第虫粪抗原”或“贾第虫的粪抗原”是存在于具有贾第虫感染的哺乳动物的排泄物中并且可被本发明的抗体中的一种或多种特异性结合的任何贾第虫产物。

“凝集素”是识别并结合特定单糖或寡糖结构(碳水化合物)的蛋白质。凝集素通常含有两个或多个碳水化合物单元的结合位点。某些凝集素的碳水化合物结合特异性由结合碳水化合物的氨基酸残基决定。凝集素对碳水化合物的结合强度可随着分子相互作用数而增加。凝集素与碳水化合物的结合的解离常数为约10

在本发明的实施方式中，所使用的凝集素是特异性结合绦虫粪抗原的凝集素。在本发明的实施方式中，特异性结合O-糖基化蛋白质的凝集素在本发明中有用。此类凝集素包括例如ECL凝集素(鸡冠刺桐(Erythrina cristagalli))、GSL I(GriffoniaSimplicifolia凝集素I)、GSL II(Griffonia Simplicifolia凝集素II)、jacalin、LCA凝集素(小扁豆(Lens culinaris))、RCA 123(蓖麻(Ricinus Communis))、和PSA凝集素(菜豆(Phaseolus vulgaris)白细胞凝集素)、WGA(麦胚凝集素(wheat germ agglutinin))和sWGA(琥珀酰化的麦胚凝集素)。凝集素可从例如Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA商购得到。

可使用特异性结合至人、犬科动物、猫科动物、马、牛、绵羊或猿猴绦虫抗原上的碳水化合物的凝集素。

“特异于”、“特异性结合”和“稳定结合”意指本发明的特定组合物(如本发明的抗体、多肽或寡核苷酸)以相比至少一种其它试剂以更高的亲和力识别并结合于一种或多种其它试剂。作为一个实例，只要本发明的抗体能够以比对于来自非绦虫寄生性蠕虫的任何其它抗原更高的亲和力识别并结合蛔虫抗原，则所述抗体被称为“特异于”、“特异性结合”和“稳定结合”这些绦虫抗原。可以使用本领域公知的方法(例如ELISA或放射免疫测定法(RIA))来测试此类结合特异性。基于观测到的关于本发明的特定组合物的结合特异性的信息，本发明的方法可以在允许该组合物结合至一种或多种特定试剂(并因此允许检测与所述特定试剂的此类结合)、但在保持这些条件时不显著结合其它试剂的条件下进行。作为一个实例，本发明的方法可以在以下条件下进行：所述条件允许本发明的抗体结合至特定样品中存在的绦虫抗原种类的一种或多种抗原(并因此允许检测与所述抗原的此类结合)，而不显著结合至样品中可能存在的来自其它绦虫物种或其它肠虫性蠕虫物种的任何抗原，因此允许区分绦虫和蛔虫、鞭虫和钩虫的种类。

“检测绦虫”意指检测一种或多种绦虫特异性产物，包括，例如，本发明的多肽、抗体和核酸中的一种或多种，或一种或多种绦虫抗原。来自哺乳动物的样品中一种或多种此类绦虫产物的存在表明该哺乳动物具有绦虫感染，无论该样品中是否还存在任何完整的绦虫有机体或其虫卵。相反地，来自哺乳动物的样品中不存在一种或多种此类绦虫产物则表明该哺乳动物没有绦虫感染。

“治疗”是指通过任何合适的给予途径向患者给予治疗剂，以通过控制体内的寄生性蠕虫(肠虫)或其它内部寄生生物、使其昏迷或杀死它们来减少或消除所述体内的寄生性蠕虫(肠虫)或其它内部寄生生物，和/或减少或消除可传播寄生性蠕虫或其它内部寄生生物的感染的中间宿主(如昆虫，例如蚤)的侵扰，而不对患者造成明显的伤害。

III.本发明的抗体

本发明进一步包括针对本发明的一种或多种多肽而产生并特异性结合所述一种或多种多肽的全部或部分的抗体及其抗原结合片段，并且本发明还包括包含所述抗体及其抗原结合片段的组合物。当与获得自哺乳动物的样品接触时，这些抗体和抗原结合片段能够特异性结合特定的肠虫性蠕虫抗原。例如，绦虫抗体和抗原结合片段能够特异性结合样品中存在的绦虫抗原，但不能特异性结合样品中可能存在的来自其它蠕虫(如蛔虫、钩虫或鞭虫)的任何抗原。本发明的抗体适合仅用于捕获一种或多种绦虫抗原，仅用于检测一种或多种绦虫抗原，或更优选地用于同时捕获并检测一种或多种绦虫抗原。

本发明的抗体可以属于任何抗体类别，包括例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，并且可以通过熟练的技术人员已知的多种技术中的任一种来制备。(参见，例如，Dean,MethodsMol.Biol.80:23-37(1998)；Dean,Methods Mol.Biol.32:361-79(1994)；Baileg,MethodsMol.Biol.32:381-88(1994)；Gullick,Methods Mol.Biol.32:389-99(1994)；Drenckhahnet al.Methods Cell.Biol.37:7-56(1993)；Morrison,Ann.Rev.Immunol.10:239-65(1992)；Wright等，Crit.Rev.Immunol.12:125-68(1992)；Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；以及Making and UsingAntibodies:A Practical Handbook,Howard和Kaser编著，CRC Press(2006)，以引用的方式将其整体各自并入本文。)

在一种技术中，将本发明的多肽引入宿主动物，例如，如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、猪、奶牛、绵羊、驴、狗、猫、鸡或马。通过使多肽与载体缔合和/或通过使宿主暴露于佐剂，可以在宿主动物中引发增强的免疫应答，但是应当理解，本发明不要求多肽与载体缔合或使宿主暴露于佐剂。可用于该目的的示例性载体是牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。示例性的佐剂包括弗氏完全或不完全佐剂以及MDL-TDM佐剂。不管多肽是否与此类载体缔合或者宿主是否暴露于佐剂，都可以任选地在此后对被采血的宿主动物进行一次或多次加强免疫。然后可以从由一次或多次采血获得的抗血清中纯化特异性结合多肽的多克隆抗体(pAb)。此类纯化可以例如通过采用涉及将多肽与固体支持物缔合的亲和色谱技术来实现。此类亲和色谱技术是熟练的技术人员所公知的。

在数个实施方式中，本发明的绦虫抗体是通过用如下所述的完整绦虫的提取物、绦虫的E/S材料、绦虫的蠕虫洗液、或蠕虫的TCA可溶性材料对宿主动物进行免疫而在兔中产生的抗体。

还应理解，本发明的抗体任选地可为多克隆抗体或单克隆抗体(mAb)、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、以及它们的片段。可以例如通过制备产生对感兴趣多肽具有期望特异性的抗体的细胞系来获得和纯化对感兴趣多肽具有特异性的单克隆抗体。这种类型的细胞系可以源自从宿主动物中分离出来的特定类型的细胞(例如脾细胞)，所述宿主动物先前已用如前所述地的多肽进行了免疫。在这种情况下，可例如通过经由实施熟练的技术人员已知的多种融合技术中的任一种来将这些细胞与骨髓瘤细胞融合，从而使这些细胞永生化。在一种示例性技术中，将来自经免疫的宿主动物的细胞与它们的融合配偶体(例如骨髓瘤细胞)在洗涤剂存在的情况下短时间共孵育，然后铺在支持杂交细胞(但不支持骨髓瘤融合配偶体)生长的培养基上。此类选择可例如通过使用次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT)来实现。当杂交细胞在选择过程中出现(可能在选择过程开始后的一周或两周内)时，对单个杂交集落(及其上清液)就其与对宿主动物进行免疫的多肽结合的能力进行测试。具有最佳结合特异性的杂交集落将代表可以从中分离出单克隆抗体的最佳候选者。例如，可以通过运用熟练的技术人员已知的多种技术中的任一种直接从其中生长有这些集落的上清液(即培养基)中分离这些单克隆抗体。

本发明的抗体也可为单链抗体(scFv)或抗体的抗原结合片段。抗体的抗原结合片段是完整抗体的一部分，其包含完整抗体的抗原结合位点或可变区，其中该部分不含完整抗体Fc区的重链恒定结构域。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、Fab’-SH，F(ab’)

抗体(包括二抗)可用本领域已知的任何类型的标记物来标记，所述标记物包括例如荧光、化学发光、放射性、酶、胶体颗粒、放射性同位素和生物发光标记物。在本发明的多种实施方式中，本发明的一种或多种抗体用酶、胶体颗粒、放射性核素或荧光团标记。颗粒状标记物可为例如与抗体缀合的有色乳胶颗粒、染料溶胶或金溶胶。

IV.本发明的方法、设备和试剂盒

A.本发明的设备和试剂盒

在一个方面，本发明为用于检测样品中存在或不存在一种或多种绦虫抗原的设备，所述设备包含固体支持物，其中，所述固体支持物在其上固定有选自于由以下抗体所组成的组中的一种或多种抗体：(a)第一抗体，所述第一抗体能够特异性结合来自第一绦虫的粪抗原，但不结合来自第二绦虫的粪抗原或来自第三绦虫的粪抗原；(b)第二抗体，所述第二抗体能够特异性结合来自第二绦虫的粪抗原，但不结合来自第一绦虫的粪抗原或来自第三绦虫的粪抗原；以及(c)第三抗体，所述第三抗体能够特异性结合来自第三绦虫的粪抗原，但不结合来自第一绦虫的粪抗原或来自第二绦虫的粪抗原；以及任选的(d)一种或多种类型的贾第虫粪抗原、蛔虫粪抗原、鞭虫粪抗原和/或钩虫粪抗原，其中，所述一种或多种类型的蛔虫粪抗原、鞭虫粪抗原和钩虫粪抗原特异性结合所述抗体。参见美国专利No.7,951,547，以引用的方式将其整体并入。所述设备被安排用来帮助从来自哺乳动物的样品中的任何贾第虫、蛔虫、鞭虫和钩虫抗原中特异性结合和分离绦虫粪抗原。

在一个方面，所述设备包含固体支持物，其中，本发明的一种或多种抗体固定在所述固体支持物上。所述固体支持物可为但不限于，例如，微量滴定板的孔的内侧、底部表面，微粒，微流体设备的通道，筒(cartridge)，膜，或作为侧向流动设备一部分而包含在内的基底。示例性的微量滴定板为Immulon 1B 96孔板(可从Thermo Scientific，Milford，MA商购获得)，但应理解的是，熟练的技术人员将认识到，并非Immulon 1B 96孔板的非常多种其它微量滴定板允许使得抗体固定于其上，并因此将适用于提供本发明的固体支持物。

示例性的侧向流动设备是在美国专利No.5,726,010中描述的侧向流动设备，以引用的方式将其整体并入本文。用于进行侧向流动测定的设备可为可从IDEXXLaboratories,Inc.，Westbrook，ME商购获得的

可通过本领域已知的任何方法学将本发明的设备中使用的抗体固定在固体支持物上，其包括例如使所述抗体直接或间接地、共价或非共价地附着至所述固体支持物。因此，尽管这些抗体可以通过物理吸附(即，不使用化学接头)附着于固体支持物，但也确实这些抗体可以通过本领域技术人员容易知晓的任何化学结合(即，使用化学接头)方法固定于所述固体支持物。

在一些实施方式中，第一抗体可针对第一绦虫物种的全提取物、第一绦虫物种的E/S材料、第一绦虫物种的蠕虫洗液材料、或第一绦虫物种的TCA可溶性材料而产生；(b)第二抗体可针对第二绦虫物种的全提取物、第二种绦虫物种的E/S材料、第一绦虫物种的蠕虫洗液材料、或第二绦虫物种的TCA可溶性材料而产生；或者(c)第三抗体可针对第三绦虫物种的全提取物、第三绦虫物种的E/S材料、第一绦虫物种的蠕虫洗液材料、或第三绦虫物种的TCA可溶性材料而产生。

在一些实施方式中，所述固体支持物进一步在其上固定有一种或多种抗体，所述一种或多种抗体选自：能够特异性结合蛔虫粪抗原但不结合鞭虫或钩虫粪抗原的抗体；能够特异性结合鞭虫粪抗原但不结合蛔虫或钩虫粪抗原的抗体；能够特异性结合钩虫粪抗原但不结合鞭虫或蛔虫粪抗原的抗体；能够特异性结合贾第虫粪抗原但不结合选自于由蛔虫粪抗原、鞭虫粪抗原、钩虫粪抗原、绦虫带绦虫粪抗原、绦虫复孔绦虫粪抗原和细小病毒粪抗原所组成的组中的粪抗原的抗体；以及能够特异性结合细小病毒但不结合选自于由蛔虫粪抗原、鞭虫粪抗原、钩虫粪抗原、绦虫带绦虫粪抗原、绦虫复孔绦虫粪抗原和贾第虫粪抗原所组成的组中的粪抗原的抗体。在实施方式中，所述钩虫为钩口线虫，所述蛔虫为弓首蛔虫，所述鞭虫为毛首线虫。在其它实施方式中，所述钩虫为犬钩口线虫或管形钩口线虫；所述蛔虫为犬弓首蛔虫或猫弓首蛔虫；所述鞭虫为狐毛首线虫或猫毛首线虫；所述贾第虫为蓝氏贾第虫；所述细小病毒为猫细小病毒或犬细小病毒。

还应理解的是，所述固体支持物可为任何适用于固定本发明抗体的材料。例如，所述固体支持物可为珠、颗粒、管、孔、探针、浸量条带(dipstick)、移液器吸头、载玻片、纤维、膜、纸、天然纤维素和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖、玻璃、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、右旋糖酐、尼龙、淀粉酶、塑料、磁石(magnetite)、或本领域技术人员容易知晓的任何其它合适的材料。在一些实施方式中，所述固体支持物可包括多个颗粒、微粒、芯片或珠。所述多个颗粒、微粒、芯片或珠可附着于所述设备，或者与设备松散地缔合。所述多个颗粒、微粒、芯片或珠可以位于所述设备的表面上或所述设备内。所述多个颗粒、微粒或珠可以在所述设备上或所述设备内静止不动，或者它们能够在所述设备内或穿过所述设备移动。

所述设备任选地可包含一种或多种标记的抗原捕获试剂，其可在施用于本发明的设备之前与来自哺乳动物的样品混合。当包含所述标记的抗原捕获试剂时，所述标记的抗原捕获试剂可以或可以不沉积于或干燥于所述设备的固体表面。“抗原捕获试剂”是指对一种或多种感兴趣的抗原具有特异性的任何化合物。所述标记的抗原捕获试剂无论是添加到哺乳动物样品中还是预先沉积在设备上，可为例如对蛔虫抗原具有特异性的标记的抗体，包括但不限于本发明的抗体。

任选地，所述设备还可包含将将未结合的材料(例如，哺乳动物样品的未反应部分，例如，如排泄物提取物的未反应部分，以及未结合的抗原捕获试剂)从反应区(固相)运出(如当所述设备是

所述液体试剂可进一步包括有限量的“抑制剂”，即阻断可检测终产物显色(development)的物质。有限量定义为直到大部分或所有过量的、未结合材料从第二区域运输走(在此时产生可检测的终产物)为止，足以阻断终产物显色的抑制剂的量。

本发明的设备还可包含多种结合试剂，所述结合试剂固定在与一种或多种抗原捕获试剂不同的位置。例如，可包含免疫试剂(抗体、抗原或多肽)或酶标记的试剂的酶部分作为阳性对照以评估所述试剂在所述设备内的活力，所述免疫试剂识别标记的抗体或抗原捕获试剂的物种特异性(例如蛔虫特异性)抗体部分。例如，阳性对照可为在例如山羊或小鼠中产生的抗辣根过氧化物酶抗体。此外，可包含从抗原-抗体复合物的抗体部分所来源的物种的非免疫成员分离的试剂(例如抗体)作为阴性对照以评估免疫复合物(即抗原-抗体复合物)形成的特异性。

除了被设计为特异性结合和分离哺乳动物样品中的绦虫粪抗原外，本发明的设备任选地可被设计为允许进行一种或多种其它诊断测试。例如，所述固体支持物还可包含用于检测以下的试剂：一种或多种肠虫性蠕虫，例如蛔虫、鞭虫、心丝虫和钩虫；一种或多种非蠕虫寄生生物；一种或多种病毒，如细小病毒；一种或多种真菌；一种或多种原生动物，如贾第虫；或一种或多种细菌。用于检测一种或多种非蠕虫寄生生物、一种或多种病毒、一种或多种真菌、一种或多种原生动物或一种或多种细菌的试剂可为，例如，由对一种或多种非蠕虫寄生生物、一种或多种病毒、一种或多种真菌、一种或多种原生动物或一种或多种细菌具有特异性的抗体识别的一种或多种抗原，或一种或多种抗体。

在一个实施方式中，本发明的设备是包含多个孔的微量滴定板，其中每个孔包含固体支持物，所述固体支持物在其上固定有一种或多种本发明的抗体。

微量滴定板可以与本发明的方法结合使用，以检测样品中一种或多种肠虫性粪抗原的存在或不存在。例如，可通过用固定在固体支持物上的抗体检测一种或多种绦虫抗原来诊断哺乳动物中的绦虫感染。在一个实施方式中，所检测的抗原为粪抗原。“粪抗原”是存在于来自宿主物种(例如狗或猫)的排泄物样品中并且可特异性结合抗体的胃肠道寄生生物(例如绦虫)的任何产物。因此，粪抗原可为完整的蠕虫，蠕虫卵，蠕虫片段，或从蠕虫分泌、排出或脱落的产物，或它们的组合。

除了微量滴定板以外，还有非常多种其它可选的手段用于并行进行多个免疫测定(即，多重免疫测定)，这在本领域中是已知的。通常，多重免疫测定可在单个容器中在组合物或设备中进行，其中，多个免疫测定的组分处于流体连通。这些技术可以基于阵列、微阵列和/或微珠或微粒。在阵列或微阵列中，通常将捕获试剂点在或以其它方式沉积在单个设备(例如膜)的分区区域中。在基于珠的方法中，用于每个测定的捕获试剂都附着于所述珠，其中，每个测定的珠可与其它测定的珠区分开来。可通过光的颜色、物理位置、条形码等来进行区分。参见，例如Tighe,P.J.,Ryder,R.R.,Todd,I.和Fairclough,L.C.(2015),ELISAin the multiplex era:Potentials and pitfalls.Prot.Clin.Appl.,9:406-422.doi:10.1002/prca.201400130)。

多数此类多重化平台可商购获得。实例包括

在本发明另一方面，用于检测排泄物样品中存在或不存在一种或多种绦虫粪抗原的设备包含固体支持物、一种或多种凝集素、以及一种或多种选自于由以下抗体所组成的组中的抗体：(a)第一抗体，所述第一抗体能够特异性结合来自第一绦虫物种的粪抗原，但不结合来自第二绦虫物种的粪抗原或来自第三绦虫物种的粪抗原；(b)第二抗体，所述第二抗体能够特异性结合来自第二绦虫物种的粪抗原，但不结合来自第一绦虫物种的粪抗原或来自第三绦虫物种的粪抗原；以及(c)第三抗体，所述第三抗体能够特异性结合来自第三绦虫物种的粪抗原，但不结合来自第一绦虫物种的粪抗原或来自第二种绦虫物种的粪抗原。在一个实施方式中，所述固体支持物在其上固定有一种以上的抗体、两种以上的抗体、三种以上的抗体、四种以上的抗体、五种以上的抗体、六种以上的抗体、七种以上的抗体或八种以上的抗体。标记的凝集素可以出于检测目的而结合至由固定的抗体所捕获的绦虫粪抗原上的碳水化合物。在另一实施方式中，凝集素可固定于所述固体支持物上。固定的凝集素可捕获绦虫粪抗原(如果存在的话)，并可以通过一种或多种标记的抗体检测所得的复合物。在另一实施方式中，所述设备进一步包含一个或多个种类的绦虫抗原，其中，所述一个或多个种类的绦虫抗原特异性结合至所述抗体。

本发明进一步包括用于检测和区分哺乳动物样品中不同绦虫物种的测定试剂盒(例如，制成的制品)。在一些实施方式中，所述测定试剂盒可进一步检测和区分与哺乳动物样品中的肠虫性蠕虫(例如蛔虫、鞭虫和/或钩虫)的共感染。因此，所述试剂盒可包含本发明的一种或多种设备和/或组合物。例如，所述试剂盒可包含抗-绦虫抗体，以及用于确定所述抗体与绦虫抗原的结合的手段和用于确定所述抗体与绦虫抗原的结合的手段。在一个具体实例中，此类试剂盒包括具有以下的设备：针对一种或多种不同绦虫物种的固定化抗绦虫抗体、一种或多种抗原捕获试剂(例如，未固定化的标记的抗原捕获试剂和固定化的抗原捕获试剂)和洗涤试剂，以及检测试剂和阳性对照试剂和阴性对照试剂(如果需要或适合的话)。其它组分(如本领域普通技术人员已知的缓冲液、对照等)可包含在此类测试试剂盒中。不同试剂的相对量可变化，以提供基本上使所述测定的敏感度最优的试剂在溶液中的浓度。具体而言，所述试剂可以干燥粉末的形式提供，通常经冻干，其在溶解时将提供具有合适浓度以用于与样品合并的试剂溶液。本试剂盒可进一步包括用于实施本发明的一种或多种方法的说明书，包括所述试剂盒中所包含的本发明的任何设备和/或组合物的使用的说明书。

B.本发明的方法

本发明进一步包括用于使用本发明的一种或多种设备、试剂盒和/或组合物来检测样品中一种或多种绦虫抗原的存在或不存在的方法。因此，可实施所述方法以检测样品中一个或多个种类的绦虫的存在或不存在，所述样品例如获得自哺乳动物的排泄物样品，所述哺乳动物包括但不限于犬科动物、猫科动物、猪、牛或人。此外，可实施所述方法以检测样品中的肠虫性蠕虫(如蛔虫、鞭虫、钩虫和心丝虫)、非蠕虫寄生生物(如贾第虫)和病毒(如细小病毒)中的一种或多种。

在本发明的方法中，可通过检测一种或多种绦虫抗原的存在或不存在来实现对一个或多个种类的绦虫的检测。当被测试绦虫粪抗原的样品为排泄物时，可通过本领域已知的任何方案收集排泄物的可溶性部分。例如，除了本文实施例部分中所述的特定方案外，样品的可溶性部分通常可通过使用过滤、提取、离心或简单混合然后重量沉降(gravimetricsettling)来收集。熟练的技术人员将认识到，也存在多种从哺乳动物提取和制备非排泄物样品的方法。例如，所述样品可为由哺乳动物天然排泄或以其它方式释放的体液，或者从哺乳动物人工获得的体液。此类人工提取可通过对哺乳动物进行挤奶或通过将注射器扎入哺乳动物并将流体抽吸入注射器来实施。一旦获得，任选地，可对所述流体进行分级(fractionate)(例如，血清可从全血中分级，然后用作样品)。作为另一实例，所述样品可通过从例如哺乳动物(例如所述哺乳动物的口腔)拭取来获得。作为又一实例，可以通过活组织检查获得组织切片。

所述方法包括在允许抗原/抗体复合物(即免疫复合物)形成的条件下，使所述哺乳动物样品与对绦虫粪抗原具有特异性的一种或多种抗体接触。即，抗体特异性结合至所述样品中存在的粪抗原。熟练的技术人员熟悉可用于检测此类抗原/抗体复合物结合的测定法和条件。例如，抗原/抗体复合物可使用结合至所述抗原/抗体复合物的二抗来检测。样品中抗原和抗体之间的复合物的形成可使用本领域已知的任何合适的方法来检测。

此外，在一个特定反应中形成的抗体-抗原复合物的相对量可通过本领域已知的用于实现该目的的任何方法学，以相对于在任何其它反应中形成的抗体-抗原复合物的量来测量。当确定受测试的样品具有特定的绦虫抗体-抗原复合物时，可根据形成的特定复合物得出结论：特定的绦虫存在于所述宿主哺乳动物中以及存在的为何种绦虫(例如绦虫物种豆状带绦虫和犬复孔绦虫)。当确实如此时，可得出结论：从中获得所述测试样品的哺乳动物遭受肠道绦虫感染。受测试的哺乳动物遭受肠道绦虫感染的结论可由诊断服务提供者处的临床医生或所述哺乳动物的照料者(如所述哺乳动物的兽医)来作出。当哺乳动物的照料者确定(或从别处得知)哺乳动物遭受绦虫感染以及存在的为何种绦虫时，所述照料者可随即使所述哺乳动物经受经优化设计以使所述哺乳动物特定驱除所述绦虫的治疗过程，而不是一般性消除寄生性蠕虫感染的治疗过程。此外，本发明可用于确证任何接受针对特定绦虫感染的治疗的动物已消除了该感染。例如，得知样品中包含绦虫和蛔虫、但不包含钩虫的照料者可使用该信息来特别针对绦虫治疗所述样品所取自的哺乳动物，所述治疗通过向该哺乳动物给予对绦虫最具效力的药物和对蛔虫最具效力的第二药物进行。缺乏此类信息，照料者则可能例如，用仅对绦虫最具效力、仅对蛔虫最具效力、或对绦虫或蛔虫均非最具效力(在此类情况下，所述哺乳动物将面临接受次优治疗的风险)的药物来治疗所述哺乳动物。此外，可告诫可能与受感染的动物或其排泄物质接触的人采取预防措施以防染上所述寄生生物。在这种情况下，以高特异性确定所述蠕虫的物种是重要的，因为蠕虫可在人中引起严重疾病(例如，幼虫移行(larval migrans))。

患有肠道寄生生物感染的患者可用已知从所述患者消除所述寄生生物的某些疗法进行治疗。因此，发现排泄物含有来自肠道寄生生物的粪抗原的患者可用适当的治疗剂进行治疗，目的是减少或消除所述肠道寄生生物。

患有肠道寄生性蠕虫(如绦虫、钩虫、鞭虫和/或线虫)感染的患者可用驱虫药物(也被称为驱肠虫药(或驱肠虫剂))治疗。此类驱肠虫药是本领域技术人员所公知的。用于治疗绦虫的驱肠虫药不受限地包括吡喹酮、硝唑尼特、阿苯达唑、epsiprantel、芬苯达唑(fenbendazole)或它们的组合。在肠道寄生生物的治疗和/或预防中，驱肠虫药可通过多种合适的途径向患者给予，所述途径包括口服给予、肠胃外给予(如皮下给予、静脉内给予、肌内给予或腹膜内给予)、或局部给予(皮肤给予)(如直接在暴露的皮肤表面上局部给予)。

贾第虫是引起被称为贾第虫病的腹泻病的微小寄生生物。贾第虫(包括肠贾第虫、蓝氏贾第虫和十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis))在被来自受感染的人或动物的排泄物污染的土壤、食物或水中或者表面上均有发现。贾第虫粪抗原可用许多可商购获得的测试进行检测，所述测试包括

用于治疗贾第虫感染的治疗剂是本领域技术人员所公知的。贾第虫感染可用若干药物中的一种或多种进行治疗，所述药物包括芬苯达唑、阿苯达唑、甲硝唑、替硝唑、硝唑尼特、巴龙霉素、奎吖因(quinacrine)、呋喃唑酮、苯硫胍(febantel)、双羟萘酸噻嘧啶、吡喹酮或它们的组合。在贾第虫的治疗和/或预防中，这些药物可通过多种合适的途径向患者给予，所述途径包括口服给予、肠胃外给予(如皮下给予、静脉内给予、肌内给予或腹膜内给予)、或局部给予(皮肤给予)(如直接在暴露的皮肤表面上具体给予)。

中间宿主会参与一种或多种蠕虫或非蠕虫寄生生物、真菌、病毒和细菌向患者传播，因此成功的治疗干预包括控制或防止再感染的策略。例如，由于绦虫感染可通过中间宿主(如蚤和犬嚼虱)传播，在绦虫感染的情况中成功的治疗干预包括控制可能存在于患者上的任何中间宿主(例如蚤)侵染的策略。因此，控制中间宿主(例如蚤)有助于防止绦虫再次感染患者。用于治疗或控制蚤侵染的治疗剂是本领域技术人员所公知的，包括塞拉菌素(selamectin)、氟虫腈、吡虫啉、茚虫威、除虫菊酯、氯菊酯(permethrin)、氟氯苯菊酯(flumethrin)、多杀菌素、烯啶虫胺(nitenpyram)、afoxolaner、氟雷拉纳(fluralaner)、saralane、烯啶虫胺、methoprene、吡丙醚(pyriproxyfen)和虱螨脲(lufenuron)，或它们的组合。蚤控制剂可通过多种合适的途径向患者给予，所述途径包括口服给予、肠胃外给予(如皮下给予、静脉内给予、肌内给予或腹膜内给予)、或局部给予(皮肤给予)(如直接在暴露的皮肤表面上局部给予)。代表性的合适的蚤控制形式包括喷雾剂、粉剂、环圈(collar)、口服组合物或局部治疗。

本发明的方法的步骤可包括将哺乳动物样品施用至本发明的设备以在所述样品中存在粪抗原(如果有的话)的情况下形成抗体-粪抗原复合物；以及检测所述抗体-粪抗原复合物(如果有的话)的存在或不存在，所述设备包含：(a)第一抗体，所述第一抗体能够特异性结合来自第一绦虫的粪抗原，但不结合来自第二绦虫的粪抗原或来自第三绦虫的粪抗原；(b)第二抗体，所述第二抗体能够特异性结合来自第二绦虫的粪抗原，但不结合来自第一绦虫的粪抗原或来自第三绦虫的粪抗原；以及(c)第三抗体，所述第三抗体能够特异性结合来自第三绦虫的粪抗原，但不结合来自第一绦虫的粪抗原或来自第二绦虫的粪抗原。

在一些实施方式中，所述设备可以进一步包含选自以下的一种或多种抗体：能够特异性结合蛔虫粪抗原但不结合鞭虫或钩虫粪抗原的抗体；能够特异性结合鞭虫粪抗原但不结合蛔虫或钩虫粪抗原的抗体；能够特异性结合钩虫粪抗原但不结合鞭虫或蛔虫粪抗原的抗体；能够异性结合贾第虫粪抗原但不结合选自于由蛔虫粪抗原、鞭虫粪抗原、钩虫粪抗原、绦虫带绦虫粪抗原、绦虫复孔绦虫粪抗原和细小病毒粪抗原所组成的组中的粪抗原的抗体；以及能够特异性结合细小病毒，但不结合选自于由蛔虫粪抗原、鞭虫粪抗原、钩虫粪抗原、绦虫带绦虫粪抗原、绦虫复孔绦虫粪抗原和贾第虫粪抗原所组成的组中的粪抗原的抗体。在实施方式中，所述钩虫为钩口线虫，所述蛔虫为弓首蛔虫，所述鞭虫为毛首线虫。在其它实施方式中，所述钩虫为犬钩口线虫或管形钩口线虫；所述蛔虫为犬弓首蛔虫或猫弓首蛔虫；所述鞭虫为狐毛首线虫或猫毛首线虫；所述贾第虫为蓝氏贾第虫；以及所述细小病毒为猫细小病毒或犬细小病毒。

在一个实施方式中，检测抗体-粪抗原复合物(如果有的话)的存在或不存在的步骤进一步包括提供结合至少一种复合物的一种或多种凝集素的步骤。所述凝集素可被可检测地标记或固定在固体支持物上。或者，第一抗体、第二抗体和第三抗体可被可检测地标记或固定在固体支持物上。在一个实施方式中，第一抗体、第二抗体和第三抗体可固定在固体支持物上，并且所述凝集素可被可检测地标记。在另一实施方式中，第一抗体、第二抗体和第三抗体可被可检测地标记，并且所述凝集素可固定在固体支持物上。

在另一实施方式中，使来自哺乳动物的排泄物样品与一种或多种抗体接触的步骤进一步包括使所述排泄物样品与一种或多种凝集素接触的步骤。所述凝集素可被可检测地标记或固定在固体支持物上。或者，第一抗体、第二抗体和第三抗体可被可检测地标记或固定在固体支持物上。在一个实施方式中，第一抗体、第二抗体和第三抗体可固定在固体支持物上，并且所述凝集素可被可检测地标记。在另一实施方式中，第一抗体、第二抗体和第三抗体可被可检测地标记，并且所述凝集素可固定在固体支持物上。

所述抗体和凝集素可直接或间接地附着于固体支持物或基底，如微量滴定孔，

然而，本发明的方法不要求使用固相或基底。熟练的技术人员将认识到，有多种方式可以实施本方法以检测蛔虫的存在或不存在而无需涉及使用固相或基底。正好在一个实例中，可实施无需使用固相或基底的免疫沉淀方法。

在本发明的一些实施方式中，当指示试剂(例如与抗体结合的酶缀合物)催化可检测的反应时，检测出抗原/抗体复合物。任选地，在允许形成可检测的抗原/抗体/指示剂复合物的条件下，可将包括信号产生化合物的指示试剂施用于所述抗原/抗体复合物。任选地，所述抗体可在形成抗原/抗体复合物之前用指示试剂标记。

在本发明的一些方法中，抗原/抗体复合物或抗原/抗体/指示剂复合物的形成可具体地通过以下进行检测：例如，辐射测量法、酶法、化学发光方法、比色法、浊度法、荧光方法、光度法、尺寸分离方法，表面等离子共振法或沉淀方法。抗原/抗体复合物的检测也可通过添加与包括信号产生化合物的指示试剂偶合的二抗来达成。包括与多肽/抗体复合物缔合的信号产生化合物(标记物)的指示试剂可使用上述方法检测，并且可包括显色剂、催化剂(如酶缀合物)、荧光化合物(如荧光素和罗丹明)、化学发光化合物(如二氧环丁烷(dioxetane)、acridiniums、phenanthridiniums、钌和鲁米诺)、放射性元素、直接可见的标记物，以及辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。酶缀合物的实例包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶等。特定标记物的选择并非至关重要，但是其将能够单独或与一种或多种另外的物质一同产生信号。

本发明的方法包括但不限于基于竞争、直接反应或夹心型测定的方法，其包括但不限于ELISA、RIA、免疫荧光测定(IFA)、血凝(HA)、荧光偏振免疫测定(FPIA)和微量滴定板测定(即，任何在微量滴定板的一个或多个孔中进行的测定)。本发明的一种测定包括可逆流色谱结合测定，所述测定可例如通过使用

在一些实施方式中，本发明的方法促进夹心或竞争型的特异性结合测定。在夹心测定中，抗原捕获试剂固定于反应区中。这些抗原捕获试剂可特异性结合关于绦虫进行测试的样品中的抗原。结合来自所述样品的抗原后，所述抗原捕获试剂/抗原复合物由任何合适的方法检测。例如，所述复合物可与标记的特异性结合试剂(例如，酶-抗体缀合物)反应，而抗原被检测出(例如，在与底物反应后)。

在本发明的方法的其它实施方式中，进行竞争测定。在竞争测定中，将抗原捕获试剂固定于反应区，并与来自样品的抗原和标记的抗原(例如，抗原-酶缀合物)同时接触。在反应区检测到的标记物的量与所述样品中抗原的量成反比。

在本方法的一些实施方式中，对绦虫粪抗原具有特异性的抗体附着于固相或基底。将潜在地包含来自绦虫的抗原的样品添加到所述基底。添加特异性结合绦虫抗原的抗体。所述抗体可为与在固相上使用的抗体相同的抗体，或者其可来自不同的来源或物种。另外，这些抗体可与指示试剂(如酶缀合物)连接。可在每次添加之前进行洗涤步骤。可添加生色团或酶底物，并可允许其显色。所述颜色反应可停止，并且颜色可使用例如分光光度计来量化，和/或所述颜色可由人眼进行主观评估。

在所述方法的其它实施方式中，对绦虫粪抗原具有特异性的抗体附着于固相或基底。将潜在地包含绦虫抗原的样品添加至所述基底。添加特异性结合所述粪抗原的抗物种第二抗。这些第二抗体与固相抗体来自不同的物种。添加特异性结合第二抗体但不特异性结合所述固相抗体的抗物种第三抗体。第三抗体可包含指示试剂，例如酶缀合物。可在每次添加之前进行洗涤步骤。可添加生色团或酶底物，并可允许其显色。所述颜色反应可以停止，并且颜色可使用例如分光光度计来量化，和/或所述可由人眼进行主观评估。

在具体实例中，本发明的方法与设备(其为侧向流动测定设备)结合，通过在第一区域(样品施加区)将准备好的哺乳动物样品添加至所述设备的流动基质来进行。所述准备好的样品在流体流动路径中通过毛细作用携带至流动基质的第二区，在该第二区中存在能够与所述样品中的抗原结合并形成第一复合物的颗粒状标记物。所述微粒标记物可为例如与对蛔虫抗原具有特异性的抗体缀合的有色乳胶颗粒、染料溶胶或金溶胶。第一复合物被携带至流动基质的第三区，在所述第三区中，特异性结合蛔虫抗原的抗体固定于独特的位置。在固定的抗体和第一复合物之间形成第二复合物。作为第二种复合物一部分的颗粒状标记物可由人眼直接看到。

每个特异性蠕虫抗体可为在反应区(固相)中的固定化的抗原捕获试剂。第二抗原捕获试剂(即与标记物缀合的第二特异性绦虫抗体)可在将所述样品添加到所述设备之前添加至所述样品，或者第二抗原捕获试剂可并入所述设备中。例如，标记的抗原捕获试剂可沉积并干燥在提供样品施加区与固相之间的流体连通的流体流动路径上。标记的抗原捕获试剂与测试样品的接触可引起所述标记的抗原捕获试剂的溶解。

在本发明的方法的一个实施方式中，特定蠕虫粪抗原通过ELISA检测。本发明的ELISA方法的特定实例在本文中包含的实施例部分有所描述。尽管本发明参考那些特定的ELISA方法进行描述，但是应当理解，本领域普通技术人员将知道可使用可选的、另外的或替代的ELISA步骤，而不偏离通过本发明的这种方法实现的基本目标。

在本发明的另一实施方式中，绦虫粪抗原通过使用例如侧向流动设备(例如

此外，用于检测绦虫感染的本发明的方法可与其它诊断测定组合以检测其它有机体或病症的存在。例如，本发明的测定可与检测以下的试剂组合：一种或多种肠虫性蠕虫、非蠕虫排泄物寄生生物、一种或多种病毒、一种或多种真菌、一种或多种原生动物、一种或多种细菌、一种或多种血液传播的寄生生物或潜血，或它们的组合。通过在单个测定设备中提供两个以上独特结合位点(例如，如

用于检测一种或多种肠虫性蠕虫、非蠕虫寄生生物、一种或多种病毒、一种或多种真菌、一种或多种原生动物、或一种或多种细菌的试剂可为，例如一种或多种抗体，或者由对一种或多种肠虫性蠕虫、非蠕虫寄生生物、一种或多种病毒、一种或多种真菌、或一种或多种细菌具有特异性的抗体识别的一种或多种抗原。在一些实施方式中，所述试剂可包括一种或多种抗体或一种或多种抗原，所述一种或多种抗原由对一种或多种肠虫性蠕虫寄生生物(例如蛔虫、鞭虫、钩虫和心丝虫)、非蠕虫寄生生物、一种或多种病毒(如细小病毒，如犬细小病毒或猫细小病毒)、一种或多种真菌、一种或多种原生动物(如贾第虫，如蓝氏贾第虫)、或一种或多种细菌具有特异性的抗体识别。

任选地，所述方法可进一步包括使用来自绦虫的一种或多种核酸(包括但不限于本发明的核酸)以确定哺乳动物样品中一种或多种绦虫物种的存在或不存在。此类使用这些核酸确定肠虫的存在可进行所述方法的任何其它方面(包括通过抗体检测一个或多个绦虫物种)之前、之后或同时进行。因此，在一个方面，在特定样品中检测到或未检测到一种或多种绦虫物种，而将获得所述样品的哺乳动物诊断为具有或不具有绦虫感染之后，可关于任何一种或多种核酸(包括本发明的任何一种或多种核酸)的存在或不存在对所述样品(或从经诊断的哺乳动物之后获得的样品)进行测试。任何未能在特定哺乳动物中通过使用一种或多种核酸检测到特定肠虫(在通过使用一种或多种抗体检测到所述肠虫后)的人都将需要考虑到所述抗体在可检测的肠虫性核酸出现在样品中之前便检测到肠虫性粪抗原的可能性。在这种情况下，所述哺乳动物的照料者可选择忽略所述核酸未能检测到所述肠虫的观察结果，而基于所述抗体事实上检测到肠虫的观察结果，继续特异性地针对肠虫感染来治疗所述哺乳动物。在另一方面，所述核酸用于确定特定哺乳动物中肠虫的存在或不存在，然后通过使用本发明的抗体进一步评价肠虫的存在或不存在。一种或多种肠虫性核酸的检测可通过使用熟练的技术人员已知的任何核酸检测技术来进行。例如，此类检测可通过进行基于PCR的技术来实施，例如但不限于，如基于实时PCR的技术。示例性的基于PCR的技术描述于，例如，PCR Protocols(Methods in Molecular Biology),第二版,Bartlett和Stirling编著,Humana Press(2003)；以及Sambrook和Russell,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)；以引用的方式将其各自整体并入本文。

参考以下实施例具体地描述本发明；然而，不应将其视为对本发明的限制。

实施例

实施例A

除非另有指明，下述材料和技术用于产生如下所述在实施例1-实施例5中的一个或多个所描述的数据。

实施例1A

进一步对该五种mAb就其彼此配对时在夹心测定中发挥功能的能力进行筛选。为了这个目的，将这五种mAb各自包被至微量滴定板的孔上，并与FEX(豆状带绦虫阳性样品：n＝10；豆状带绦虫阴性样品：n＝10)一起孵育，然后与缀合至标记物的五种mAb中的一种或者与豆状带绦虫WE小鼠pAb一起孵育。五种mAb与至少一种其它的mAb结合时表现良好，因此被选择用于进一步研究。从表现良好的5种mAb中，选择了2种(ADX131和ADX132)用于进一步测试，因为当在粪抗原ELISA中相互配对时，它们产生了低的背景和高的信号。

在另一ELISA测定中，将ADX131和ADX132各与02D09、03H02、07C02、ADX131和ADX132的HRP缀合物配对。与豆状带绦虫WE兔pAb的另外的配对用作阳性对照。将ADX131和ADX132分别包被至微量滴定板的孔上；与来自豆状带绦虫感染的狗、未感染豆状带绦虫的狗的FEX或豆状带绦虫蠕虫提取物一起孵育；随后与所述缀合物和HRP底物一起孵育。在五种抗体配对的每一种中，ADX131与来自受感染的狗的FEX以及所述蠕虫提取物产生了强信号。在五种抗体配对中的四种中，ADX131与来自未感染的狗的FEX产生了阴性结果(即信号低于阈值)，除了与03H02的配对产生了略高于所选定的0.1OD阈值的信号(图1)。在所有五种抗体配对中，ADX132与来自受感染的狗的FEX以及与所述蠕虫提取物产生了强信号。在所有五种抗体配对中，ADX132与来自未感染的狗的FEX产生了低的背景信号(图2)。

实施例1B

为了评估豆状带绦虫粪抗原ELISA测定(使用包被在板上的ADX131和ADX132-HRP缀合物)的特异性，该测定法在来自822份犬科动物样品的FEX上进行。在这些样品中，通过显微镜检查证实1份样品为豆状带绦虫阳性(即，通过显微镜检查观测到了节片)，并通过显微镜检查将821份样品确认为豆状带绦虫阴性。结果证实，在821份显微镜检查阴性样品中，818份在豆状带绦虫粪抗原ELISA测定中为阴性，3份为阳性。豆状带绦虫粪抗原ELISA测定中，显微镜检查阳性样品呈阳性。因此，在本实验中，所述豆状带绦虫粪抗原ELISA测定具有99.7％特异性。

实施例1C

凝集素结合数据表明，由ADX131/ADX132测定所结合的豆状带绦虫粪抗原为糖基化的。凝集素结合数据进一步表明，ADX131/132粪抗原包含以下部分：非还原的GlcNac；还原的GlcNac；岩藻糖；GSL II；以及甘露糖。

实施例2A

对于用巨颈带绦虫WE兔pAb和巨颈带绦虫E/S兔pAb进行的粪抗原ELISA测定的性能的初步评估，测试了来自七只巨颈带绦虫阳性的猫和六只巨颈带颈虫阴性的猫的猫科动物排泄物提取物。

在犬科动物和猫科动物排泄物提取物上进一步评估了用巨颈带绦虫WE兔pAb进行的粪抗原ELISA测定(如A节所述)的性能。犬科动物样品集包括来自31只巨颈带绦虫阳性的犬科动物和74只巨颈带绦虫阴性的犬科动物的排泄物提取物。猫科动物样品集包括来自13只巨颈带绦虫阳性的猫科动物和39只巨颈带绦虫阴性的猫科动物的排泄物提取物。

对于犬科动物，在31个阳性样品中，该巨颈带绦虫WE兔pAb-兔pAb ELISA测定在8个样品中产生阳性信号。在74个阴性犬科动物样品中，该巨颈带绦虫WE兔pAb-兔pAb ELISA测定在6个样品中产生阳性信号。因此，在该实验中，敏感性为25.8％，特异性为91.9％。

对于猫科动物，在13个阳性样品中，该巨颈带绦虫WE兔pAb-兔pAb ELISA测定在12个样品中产生阳性信号。在39个阴性样品中，该巨颈带绦虫WE兔pAb-兔pAb ELISA测定在4个样品中产生阳性信号。因此，在该实验中，敏感性为92.3％，特异性为89.7％。

在犬科动物和猫科动物排泄物提取物上进一步评估了用巨颈带绦虫E/S兔pAb进行的粪抗原ELISA测定(如A节所述)的性能。犬科动物样品集包括来自31只巨颈带绦虫阳性的犬科动物和74只巨颈带绦虫阴性的犬科动物的排泄物提取物。猫科动物样品集包括来自13只巨颈带绦虫阳性的猫科动物和39只巨颈带绦虫阴性的猫科动物的排泄物提取物。

对于犬科动物，在31个阳性样品中，该巨颈带绦虫E/S兔pAb-兔pAb ELISA测定在4个样品中产生阳性信号。在74个阴性犬科动物样品中，该巨颈带绦虫E/S兔pAb-兔pAbELISA测定在1个样品中产生阳性信号。因此，在该实验中，敏感性为12.9％，特异性为98.6％。

对于猫科动物，在13个阳性样品中，该巨颈带绦虫E/S兔pAb-兔pAb ELISA测定在12个样品中产生阳性信号。在39个阴性样品中，该巨颈带绦虫E/S兔pAb-兔pAb ELISA测定在3个样品中产生阳性信号。因此，在该实验中，敏感性为92.3％，特异性为92.3％。

在犬科动物和猫科动物排泄物提取物上评估了用巨颈带绦虫WW兔pAb进行的粪抗原ELISA测定的性能。犬科动物样品集包括来自31只巨颈带绦虫阳性的犬科动物和74只巨颈带绦虫阴性的犬科动物的排泄物提取物。猫科动物样品集包括来自13只巨颈带绦虫阳性的猫科动物和39只巨颈带绦虫阴性的猫科动物的排泄物提取物。

对于犬科动物，在31个阳性样品中，该巨颈带绦虫WW兔pAb-兔pAb ELISA测定在16个样品中产生阳性信号。在74个阴性犬科动物样品中，该巨颈带绦虫WE兔pAb-兔pAb ELISA测定在3个样品中产生阳性信号。因此，在该实验中，敏感性为51.6％，特异性为98.6％。

对于猫科动物，在13个阳性样品中，该巨颈带绦虫WW兔pAb-兔pAb ELISA测定在12个样品中产生阳性信号。在39个阴性样品中，该巨颈带绦虫WW兔pAb-兔pAb ELISA测定在3个样品中产生阳性信号。因此，在该实验中，敏感性为92.3％，特异性为95.9％。

实施例2B

杂交瘤源自如上所述的用巨颈带绦虫WE免疫的小鼠。从产生的分泌小鼠单克隆抗体(小鼠mAb)的杂交瘤中，选择了两种巨颈带绦虫WE小鼠mAb，因为它们在ELISA测定中引起高信号和低背景：ADX184(IgG)和ADX185(IgM)。

为了评估敏感性，构建了夹心粪抗原ELISA测定，其中将ADX185包被在微量滴定板上，随后添加患者样品，然后添加巨颈带绦虫WE兔pAb-HRP缀合物。该测定在来自7只巨颈带绦虫阳性的猫科动物和3只巨颈带绦虫阴性的猫科动物的FEX上进行。如图5所示，该测定在7个阳性样品中的7个以及在3个阴性样品中的0个中检测到了粪抗原。因此，在本实验中，该ADX185/巨颈带绦虫WE兔pAb-HRP ELISA的敏感性为100％。

为了评估特异性，构建了夹心粪抗原ELISA，其中将ADX184包被在微量滴定板上，并在添加患者样品后施加ADX193-HRP缀合物。

ADX193是巨颈带绦虫E/S小鼠mAb，如下所述。该测定在以下物质上进行：犬复孔绦虫WE，豆状带绦虫WE，肥头带绦虫WE，巨颈带绦虫WE，巨颈带绦虫E/S，以及来自犬复孔绦虫阳性的狗、犬复孔绦虫阴性的狗、犬复孔绦虫阳性的猫、犬复孔绦虫阴性的猫、豆状带绦虫阳性的狗、豆状带绦虫阴性的狗、三只巨颈带绦虫阳性的猫科动物的合并和三只巨颈带绦虫阴性的猫科动物的合并的排泄物提取物。前述WE以1μg/mL的蛋白浓度使用。另外，该测定在10μg/mL蛋白和2μg/mL蛋白的数个WE样品上进行。以这些较高浓度运行的WE样品是犬复孔绦虫WE、豆状带绦虫WE、巨颈带绦虫WE、肥头带绦虫WE、钩虫犬钩口线虫WE、蛔虫犬弓首蛔虫WE和鞭虫狐毛首线虫WE。在这些样品中并如图6所示，该测定仅在巨颈带绦虫WE(10μg/mL)和巨颈带绦虫阳性的猫科动物的合并上呈阳性。因此，在本实验中，该ADX184/ADX193-HRP ELISA具有高度特异性。

杂交瘤源自如上所述用巨颈带绦虫E/S免疫的小鼠。从所产生的分泌小鼠单克隆抗体(小鼠mAb)的杂交瘤中，选择了五种巨颈带绦虫E/S小鼠mAb：ADX190、ADX191、ADX192、ADX193、ADX194。进一步对这五种小鼠mAb就其各自与抗E/S小鼠pAb-HRP缀合物配对时在ELISA测定中的性能进行评估。这五种测定在以下上进行：巨颈带绦虫E/S、来自七只巨颈带绦虫阳性的猫的排泄物提取物、和来自三只巨颈带绦虫阴性的猫的排泄物提取物。五个测定中的每一个都检测所有的7个阳性猫科动物样品。尽管ADX193和ADX194在三个阴性猫科动物样品中的一个上具有较高的背景，各自在来自三个阴性猫科动物的样品上均呈现阴性。

实施例2C

用包被在微量滴定板上的ADX184和与HRP缀合的ADX193构建ELISA。两种小鼠mAb以5μg/mL的浓度使用。

ADX184/ADX193-HRP ELISA在以下上进行：来自六只巨颈带绦虫阳性的猫的排泄物提取物、来自四只巨颈带绦虫阴性的猫的排泄物提取物和一个巨颈带绦虫E/S蛋白样品。如图7所示，该测定在所有六个阳性排泄物提取物和E/S样品中检测到了粪抗原，但是在四个阴性排泄物提取物的任一个中均未检测到粪抗原。

ADX184/ADX193-HRP ELISA在以下上进行：来自68只巨颈带绦虫阳性的猫的排泄物提取物和来自108只犬复孔绦虫阳性但巨颈带绦虫阴性的猫的排泄物提取物。该测定在68个巨颈带绦虫阳性样品的55个中产生了阳性信号(敏感性为80.9％)，在108个巨颈带绦虫阴性样品的1个中产生了阳性信号(99.1％特异性；与犬复孔绦虫的交叉反应为0.9％)。

实施例2D

用包被在微量滴定板上的ADX191和与HRP缀合的ADX194构建粪抗原ELISA。两种小鼠mAb均以3μg/mL的浓度使用。该ELISA在以下上进行：来自六只巨颈带绦虫阳性的猫的排泄物提取物、来自四只巨颈带绦虫阴性的猫的排泄物提取物、和一个巨颈带绦虫E/S蛋白样品。如图8所示，该测定在所有六个阳性排泄物提取物和E/S样品均检测到，但未在四个阴性排泄物提取物的任一个中检测到粪抗原。

实施例3A

A.

犬复孔绦虫的TCA级分如上所述进行制备，并用于对两只兔进行免疫。选择来自这些兔中的一只的抗血清用于进一步分析。

B.

在该粪抗原ELISA测定中，如上所述，将犬复孔绦虫TCA兔pAb包被在板上，与FEX接触，然后与犬复孔绦虫TCA兔pAb-HRP缀合物接触，然后与有色底物接触。

犬科动物：在来自58只犬复孔绦虫阳性的狗的排泄物提取物上进行该犬复孔绦虫TCA兔pAb ELISA测定；该ELISA在58个样品中的57个中产生了阳性信号。还在来自27只犬复孔绦虫阴性的狗的排泄物提取物上进行了该测定；该ELISA在27个样品中的8个中产生了阳性信号。因此，在本实验中，该测定的敏感性为98.3％，特异性为70.4％。

猫科动物：在来自31只犬复孔绦虫阳性的猫的排泄物提取物上进行该犬复孔绦虫TCA兔pAb ELISA测定；该ELISA在31个样品中的28个中产生了阳性信号。还在来自13只犬复孔绦虫阴性的猫的排泄物提取物上进行了该测定；该ELISA在13个样品中的5个中产生了阳性信号。因此，在本实验中，该测定的敏感性为90.3％，特异性为61.5％。

实施例3B

A.

WE如上所述由犬复孔绦虫蠕虫(Antibody Systems)制备，并用于对两只兔进行免疫。选择来自这些兔中的一只的抗血清用于进一步分析。

B.

在该ELISA测定中，如上所述将犬复孔绦虫WE兔pAb包被在板上，以5μg/mL与FEX接触，然后与3μg/mL的犬复孔绦虫WE兔pAb-HRP缀合物接触，然后与有色底物接触。该犬复孔绦虫WE兔pAb ELISA测定在来自数种肠虫物种的蠕虫提取物上进行：犬复孔绦虫WE、豆状带绦虫WE、肥头带绦虫WE、钩虫犬钩口线虫WE、蛔虫犬弓首蛔虫WE、鞭虫狐毛首线虫WE。如图9所示，只有犬复孔绦虫WE在该ELISA中产生了阳性信号，证明了该实验中该测定的特异性。

如下在另外的实验中评估了该犬复孔绦虫WE兔pAb ELISA测定的性能。该测定在来自44只犬复孔绦虫阳性的狗和48只犬复孔绦虫阴性的狗的排泄物提取物上进行。该测定在44个阳性样品的16个以及零个阴性样品中产生了阳性信号。因此，在本实验中，该测定的敏感性为36.4％，特异性为100％。

实施例3C

A.

B.

在该粪抗原ELISA测定中，如上所述将犬复孔绦虫E/S兔pAb包被在板上，与FEX接触，然后与犬复孔绦虫WE兔pAb-HRP缀合物接触，然后与有色底物接触。

该测定在来自7只犬复孔绦虫阳性的狗的排泄物提取物上进行。该测定在7个阳性样品中的4个中产生了阳性信号。该测定在四只犬复孔绦虫阴性的狗中的一只中产生了阳性信号。因此，在本实验中，该测定的敏感性为57.1％，特异性为75％。

实施例3D

A.

WE如上所述由来自狗的完整犬复孔绦虫蠕虫制备而来。根据标准免疫程序(SDIX，Windham，Maine，USA)，用犬复孔绦虫WE对兔进行免疫。在初次免疫后至少3周的加强之后，将来自兔的血液样品用于单克隆抗体的开发(ImmunoPrecise Antibodies,Ltd.，(IPA)，Victoria，British Columbia，加拿大)。收集来自兔的B细胞，并在犬复孔绦虫WE包被的96孔板上评价B细胞培养上清液，并用抗兔IgG二抗进行探测。在第二次筛选(IDEXX)中，用各种排泄物提取物对来自阳性孔的约50μLB细胞上清液就特异性结合进行了测试。将来自该第二筛选的32个最佳候选物的B细胞保存在裂解缓冲液中以用于克隆。从这32个候选物中分离出RNA，并将兔抗体重链和轻链(κ)可变区克隆到单独的哺乳动物表达载体(IPA)中。再次用各种排泄物提取物对从转染有所述抗体重链和轻链载体的哺乳动物细胞中收集的组织培养上清液进行评价。对重组兔mAb DNA构建体的前5名克隆进行了测序(IPA)。选择这5个兔mAb克隆中的两个用于进一步分析：RDX13和RDX12。

B.

在这系列的粪抗原ELISA测定中，如上所述将小鼠mAb ADX226包被在板上，与FEX接触，然后与RDX13-HRP和/或RDX12-HRP缀合物接触，然后与有色底物接触。

在第一个实验中，将RDX13-HRP和RDX12-HRP缀合物混合，并在来自38只犬复孔绦虫阳性的狗、28只犬复孔绦虫阴性的狗、20只犬复孔绦虫阳性的猫和7只犬复孔绦虫阴性的猫的排泄物提取物上进行所述测定。该测定在38只阳性狗中的28只、28只阴性狗中的2只、20只阳性猫中的18只、7只阴性猫中的0只中产生了阳性信号。因此，在本实验中，该测定对狗样品产生了73.7％的敏感性和92.9％的特异性，在猫样品中产生了90.0％的敏感性和100％的特异性。

在第二、第三和第四个实验中，将RDX13-HRP和RDX12-HRP缀合物单独使用和混合使用，并在来自37只犬复孔绦虫阳性的狗、28只犬复孔绦虫阴性的狗、21只犬复孔绦虫阳性的猫和7只犬复孔绦虫阴性的猫的排泄物提取物上进行所述测定。

在第二个实验中，单独使用RDX13-HRP，该测定在37只阳性狗中的20只、28只阴性狗中的一只、21只阳性猫中的15只、以及7只阴性猫中的零只中产生了阳性信号。因此，在本实验中，该测定对狗样品产生了54.1％的敏感性和96.4％的特异性，对猫样品产生了71.4％的敏感性和100％的特异性。

在第三个实验中，单独使用RDX12-HRP，该测定在37只阳性狗中的13只、28只阴性狗中的一只、21只阳性猫中的16只、以及7只阴性猫中的零只中产生了阳性信号。因此，在本实验中，该测定对狗样品产生了35.1％的敏感性和96.4％的特异性，对猫样品产生了76.2％的敏感性和100％的特异性。

在第四个实验中，将RDX13-HRP和RDX12-HRP缀合物混合，该测定在37只阳性狗中的22只、28只阴性狗中的一只、21只阳性猫中的19只、以及7只阴性猫中的零只中产生了阳性信号。因此，在本实验中，该测定对狗样品产生了59.5％的敏感性和96.4％的特异性，对猫样品产生了90.5％的敏感性和100％的特异性。

实施例3E

A.

WE如上所述由来自狗的犬复孔绦虫蠕虫制备而来，并用于对小鼠进行免疫。所得抗血清(犬复孔绦虫WE小鼠pAb)用于以下所述的ELISA实验。

B.

在该粪抗原ELISA测定中，如上所述将犬复孔绦虫WE小鼠pAb包被在板上，与FEX接触，然后与犬复孔绦虫WE小鼠pAb-HRP缀合物接触，然后与有色底物接触。

该测定在来自以下的排泄物提取物上进行：4只犬复孔绦虫阳性狗和3只犬复孔绦虫阳性的猫；一只感染有贾第虫和巨颈带绦虫的犬复孔绦虫阴性猫、一只感染有巨颈带绦虫的犬复孔绦虫阴性的猫和一只感染有弓首蛔虫和豆状带绦虫的狗。如图10所示，该测定在4只阳性狗中的4只、一只阴性狗中的0只、3只阳性猫中的3只和2只阴性猫中的零只中产生了阳性信号。因此，在本实验中，该测定产生了高度的特异性和敏感性。

实施例3F

A.

TCA可溶性级分如上所述由来自狗的犬复孔绦虫蠕虫制备，并用于对小鼠进行免疫(MBS)。使用经免疫的小鼠的脾来产生小鼠mAb ADX251，以用于以下的ELISA实验中。

B.

在第一种粪抗原ELISA配置中，将小鼠mAb ADX226包被在板上，与FEX接触，然后与小鼠mAb ADX251-HRP缀合物接触，然后与有色底物接触。

所述测定在来自以下的排泄物提取物上进行：3只犬复孔绦虫阳性的狗、5只犬复孔绦虫阴性的狗；3只犬复孔绦虫阳性的猫和1只犬复孔绦虫阴性的猫。如图11所示，该测定在3只阳性狗中的3只、5只阴性狗中的0只、3只阳性猫中的3只和1只阴性猫中的0只中产生了阳性信号。因此，在本实验中，该测定产生了高度的特异性和敏感性。

在第二种粪抗原ELISA配置中，将小鼠mAb ADX251包被在板上，与FEX接触，然后与小鼠mAb ADX227-HRP缀合物接触，随后与有色底物接触。所述测定在来自以下的排泄物提取物上进行：3只犬复孔绦虫阳性的狗、5只犬复孔绦虫阴性的狗；3只犬复孔绦虫阳性的猫和1只犬复孔绦虫阴性的猫。如图12所示，该测定在3只阳性狗中的3只、5只阴性狗中的0只、3只阳性猫中的3只和1只阴性猫中的0只中产生阳性信号。因此，在本实验中，该测定产生了高度的特异性和敏感性。

在第三种粪抗原ELISA配置中，将小鼠mAb ADX251包被在板上，与FEX接触，然后与犬复孔绦虫_WE兔pAb-HRP缀合物接触，随后与有色底物接触。所述测定在来自以下的排泄物提取物上进行：3只犬复孔绦虫阳性的狗、5只犬复孔绦虫阴性的狗；3只犬复孔绦虫阳性的猫和1只犬复孔绦虫阴性的猫。如图13所示，该测定在3只阳性狗中的3只、5只阴性狗中的0只、3只阳性猫中的3只和1只阴性猫中的0只中产生了阳性信号。因此，在本实验中，该测定产生了高度的特异性和敏感性。

实施例3G

A.

WE如上所述由来自狗的犬复孔绦虫蠕虫制备而来，并用于对小鼠进行免疫。如上所述，从这些小鼠中生成了四种单克隆抗体(ADX224、ADX225、ADX226和ADX227)，并选择用于进一步分析。

B.

下述ELISA配置在来自以下的排泄物提取物上进行：3只犬复孔绦虫阳性的狗、4只犬复孔绦虫阴性的狗；3只犬复孔绦虫阳性的猫、和1只犬复孔绦虫阴性的猫。

在第一组粪抗原ELISA配置中，将犬复孔绦虫WE小鼠mAb分别包被在板上，与FEX接触，然后与犬复孔绦虫WE兔pAb-HRP缀合物接触，随后与有色底物接触。结果示于图14。因此，在板上用ADX224进行的测定在六个阳性样品中的五个中以及在零个阴性样品中检测到粪抗原。在板上用ADX225进行的测定在六个阳性样品中的六个中以及在零个阴性样品中检测到粪抗原。在板上用ADX226进行的测定在六个阳性样品中的六个中以及在零个阴性样品中检测到粪抗原。在板上用ADX227进行的测定在六个阳性样品中的六个中以及在零个阴性样品中检测到粪抗原。

在第二组粪抗原ELISA配置中，将四种犬复孔绦虫WE小鼠mAb的每种分别包被在板上，与FEX接触，然后与四种犬复孔绦虫WE小鼠mAb-HRP缀合物的每种接触，随后与有色底物接触。结果示于图15。在测试的组合中，选择了两个配对。用ADX227-HRP和处于板上的ADX226进行的检测在六个阳性样品中的六个中以及在零个阴性样品中检测到粪抗原；以及，用ADX227-HRP和处于板上的ADX227进行的检测在六个阳性样品中的六个中以及在零个阴性样品中检测到粪抗原。这种ADX227与自身的成功配对表明，ADX227所检测到的粪抗原包含重复的表位。

实施例3H

A.

为了确定由犬复孔绦虫WE小鼠mAb ADX226所结合的粪抗原是否为糖基化的，使用商业化试剂盒(生物素化凝集素试剂盒I、II和III，来自Vector Laboratories，Burlingame，CA)对21种不同的凝集素就其结合粪抗原的能力进行测试。根据制造商的说明实施所述测定。简而言之，将ADX226包被到Immulon 1b板中。将来自犬复孔绦虫阳性或阴性的犬科动物的FEX添加至所述板。洗涤后，添加凝集素::生物素缀合物，随后添加链霉亲和素-HRP和有色底物。结果在图16中示出。在该测试中，下述凝集素特异性地并强有力地结合至ADX226粪抗原：PSA、LCA、Jacalin、ECL、GSL1、RCA123和WGA。该凝集素结合数据说明由ADX226所结合的犬复孔绦虫粪抗原是糖基化的。

B.

为了确定由抗体犬复孔绦虫WE兔pAb所结合的粪抗原是否为糖基化的，使用商业化试剂盒(生物素化凝集素试剂盒I、II和III，来自Vector Laboratories，Burlingame，CA)对21种不同的凝集素就其结合粪抗原的能力进行测试。根据制造商的说明实施所述测定。简而言之，将犬复孔绦虫WE兔pAb包被在Immulon 1b板中。将来自犬复孔绦虫阳性或阴性的犬科动物和猫科动物的FEX添加至所述板。洗涤后，添加凝集素::生物素缀合物，随后添加链霉亲和素-HRP和有色底物。在该测试中，下述凝集素结合至犬复孔绦虫WE兔pAb粪抗原：Jacalin、WGA、琥珀酰化的WGA、GSL II。结果在图17中示出。该凝集素结合数据说明由犬复孔绦虫WE兔pAb所结合的犬复孔绦虫粪抗原是糖基化的。该数据还显示抗体-凝集素夹心测定可用于检测犬复孔绦虫粪抗原。

C.

类似的测定配置用于确定由犬复孔绦虫WE兔pAb和ADX187(犬复孔绦虫WE小鼠mAb)所结合的粪抗原是否为糖基化的，使用商业化试剂盒(生物素化凝集素试剂盒I、II和III，来自Vector Laboratories，Burlingame，CA)对21种不同的凝集素就其结合粪抗原的能力进行测试。在这种配置中，将21种不同的生物素化凝集素包被在Immulon 1b板中。将来自犬复孔绦虫阳性或阴性的犬科动物的FEX添加至所述板。洗涤后，添加犬复孔绦虫WE兔pAb-HRP或ADX187-HRP缀合物，随后添加链霉亲和素-HRP和有色底物。结果示于图18。在该测试中，下述凝集素结合至犬复孔绦虫WE兔pAb粪抗原：Jacalin、WGA和琥珀酰化的WGA。同一组凝集素结合ADX187粪抗原：Jacalin、WGA和琥珀酰化的WGA。该凝集素结合数据证实由犬复孔绦虫WE兔pAb和ADX187所结合的犬复孔绦虫粪抗原为糖基化的。该数据还显示抗体-凝集素夹心测定可用于检测犬复孔绦虫粪抗原。

在该实验中，将ADX226包被在微量滴定板上，随后为FEX，然后为Jacalin-生物素，然后为链霉亲和素-HRP，最后为HRP底物。所述FEX由20只犬复孔绦虫阳性的狗、24只犬复孔绦虫阴性的狗、12只犬复孔绦虫阳性的猫和3只犬复孔绦虫阴性的猫的排泄物提取物制备。该测定在20只阳性狗中的18只(95％敏感性)、24只阴性狗中的零只(100％特异性)、12只阳性猫中的11只(91.7％敏感性)、以及3只阴性的猫中的零只(100％特异性)中产生了阳性信号。该数据表明ADX226粪抗原为O-糖基化的，以及使用抗体和凝集素的夹心免疫测定可用于检测绦虫粪抗原。

实施例4

基本上如上文“实施例A”节中所述，在微量滴定板上进行一系列排泄物ELISA夹心测定，以测试ELISA测定在检测以下物质中的特异性：绦虫豆状带绦虫、绦虫巨颈带绦虫、绦虫犬复孔绦虫、钩虫犬钩口线虫(A.caninum)、钩虫管形钩口线虫(A.tubaeforme)、蛔虫犬弓首蛔虫(T.canis)、蛔虫猫弓首蛔虫(T.canis)、鞭虫狐毛首线虫(T.vulpis)、鞭虫猫毛首线虫(T.felis)、和原生动物蓝氏贾第虫(Giardia)。

在ELISA测定中测试了来自以下来源的排泄物提取物：豆状带绦虫阳性的狗(图19，第1列)、巨颈带绦虫感染的猫(图19，第2列)、犬复孔绦虫感染的狗(图19，第3列)、犬复孔绦虫感染的猫(图19，第4列)、钩虫犬钩口线虫感染的狗(图19，第5列)、钩虫管形钩口线虫感染的猫(图19，第6列)、蛔虫犬弓首蛔虫感染的狗(图19，第7列)、蛔虫猫弓首蛔虫感染的猫(图19，第8列)、鞭虫狐毛首线虫感染的狗(图19，第9列)、鞭虫猫毛首线虫感染的猫(图19，第10列)、Giardia感染的狗(图19，第11列)、Giardia感染的猫(图19，第12列)和两只细小病毒感染的猫(图19，第13和14列)。在图19中，第1列至第12列是单个微量滴定板的图像，第13列和第14列是另一个单独的微量滴定板的图像。

建立了用于检测狐毛首线虫粪抗原的夹心粪抗原ELISA测定。简而言之，将针对狐毛首线虫蛋白DIV6901产生的小鼠mAb(ADX6)包被在微量滴定板上，与排泄物提取物孵育，然后与针对狐毛首线虫蛋白DIV6901产生的另一小鼠mAb(ADX14)的HRP缀合物孵育，随后用过氧化物酶底物检测，如美国专利No.7,951,547中所讨论的，以引用的方式将其整体并入。ADX6以3μg/mL的浓度包被。ADX10-HRP以3μg/mL的浓度使用。结果显示，这种毛首线虫粪抗原ELISA对来自狐毛首线虫感染的狗和猫毛首线虫感染的猫的FEX产生阳性信号。但是，这种毛首线虫ELISA未在来自以下中的任何一种的FEX中检测到粪抗原：绦虫豆状带绦虫感染的狗、巨颈带绦虫感染的猫、绦虫犬复孔绦虫感染的狗、绦虫犬复孔绦虫感染的猫、钩虫犬钩口线虫感染的狗、钩虫管形钩口线虫感染的猫、蛔虫犬弓首蛔虫感染的狗、蛔虫猫弓首蛔虫感染的猫、Giardia感染的狗、Giardia感染的猫、和细小病毒感染的猫(图19，F行)。因此，这种毛首线虫ELISA特异性检测狐毛首线虫和猫毛首线虫粪抗原，并且不与来自以下中任何一种的粪抗原交叉反应：绦虫巨颈带绦虫、绦虫豆状带绦虫、绦虫犬复孔绦虫、钩虫犬钩口线虫、钩虫管形钩口线虫、蛔虫犬弓首蛔虫、蛔虫猫弓首蛔虫、原生动物蓝氏贾第虫、和猫细小病毒。因此，这种毛首线虫ELISA具有高度特异性，并且对于狐毛首线虫和猫毛首线虫的感染或侵染的检测或诊断有用。这种鞭虫毛首线虫ELISA可用于区分鞭虫狐毛首线虫或猫毛首线虫的感染与以下物质的感染：绦虫豆状带绦虫、绦虫巨颈带绦虫、绦虫犬复孔绦虫、钩虫犬钩口线虫、钩虫管形钩口线虫、蛔虫犬弓首蛔虫、蛔虫猫弓首蛔虫、原生动物蓝氏贾第虫、犬细小病毒和猫细小病毒。

根据制造商(IDEXX Laboratories Inc.，Westbrook，Maine，USA)的说明用

该数据证明，本发明的方法可用于以物种特异的方式容易地检测和区分至少八种不同肠寄生生物的感染。

实施例5

开发了一系列能够检测来自带绦虫属(如豆状带绦虫、巨颈带绦虫)和复孔绦虫属(如犬复孔绦虫)的两个或三个绦虫物种的排泄物ELISA测定。基本上如上文“实施例A”节中所述在微量滴定板中进行所述ELISA。

在所述ELISA测定中测试了来自以下来源的排泄物提取物：四只豆状带绦虫阳性的狗(图20，第1、4、7和10列)、四只巨颈带绦虫感染的猫(图20，第2、5、8和11列)、两只犬复孔绦虫感染的狗(图20，第3和6列)、两只犬复孔绦虫感染的猫(图20，第9和12列)。在图20中，第1列至第12列为单个微量滴定板的图像。