生物体液中6-苄基腺嘌呤的检测方法

技术领域

本发明属于医学检测领域，具体涉及一种生物体液中6-苄基腺嘌呤的检测方法。

背景技术

6-苄基腺嘌呤(N-(phenylmethyl)-1H-Purin-6-amine)(6-BA)是人工合成的细胞分裂素，其主要生理功能是促进细胞分裂，诱导组织分化，具有如下结构。常用于组织培养及与生长素配合使用提高坐果率，促进果实生长及蔬菜保鲜。在我国，6-苄基腺嘌呤作为已经取得农业部注册登记的植物生长调节剂之一，可在水果、蔬菜等农作物上限量限定范围使用，尽管如此，近年来6-苄基腺嘌呤滥用案件时有发生，其对人体的潜在危害性，也成为了社会关注热点。因此，建立在生物体液中准确快速的检测6-苄基腺嘌呤方法是非常必要的。

静电场轨道阱-高分辨率质谱是近年来兴起的分析测试技术，其原理是被测物质离子化后进入轨道阱内，在电场作用下围绕中心做纵向和横向的往复运动，仪器记录其物质运动轨迹，通过傅里叶变换，测得精确质量数。其分辨率高达140000FWHM，可达到小于3ppm的质量精度，既保证了分析的可靠性，同时也兼顾了灵敏度和宽线性范围。

目前对6-苄基腺嘌呤等植物生长素检测的方法多以研究水果、蔬菜基质为主，仪器多为气相色谱法、液相色谱法、气相色谱质谱联用仪法、液相色谱质谱联用仪法等，以上这些方法均有前处理复杂，假阳性率高，回收率低等问题。而针对生物样本的6-苄基腺嘌呤的检测，且应用静电场轨道阱-高分辨率质谱法尚未见报道。本发明旨在发明一种全新的检测生物样本的6-苄基腺嘌呤的技术，它将应用静电场轨道阱-高分辨率质谱技术同时结合同位素内标技术，提取精确质量数对被测物进行定量测定，应用同位素内标法消除基质效应对回收率的影响，实现对6-苄基腺嘌呤在生物样本中的精确测定。

被测物质的物理化学性质

苄基腺嘌呤，CAS号:1214-39-7分子式:C

发明内容

本发明提供的生物体液中6-苄基腺嘌呤的检测方法，样品前处理简单、快速，方法回收率高、灵敏度高、稳定性和重现性好。

本发明提供一种生物体液中6-苄基腺嘌呤的检测方法，含有如下步骤：

1)生物体液的前处理，

2)液-液萃取，

3)液相-高分辨率质谱联用检测。

其中，步骤1)中所述生物体液选自血液或者尿液。

其中，步骤2)中所述液-液萃取的萃取溶剂为乙腈、水、甲醇，或者乙腈和水的混合溶液。

其中，步骤2)中所述液-液萃取的萃取溶剂为乙腈，或者乙腈和水的混合溶液，二者体积比为1:3。

其中，步骤2)中所述液-液萃取的萃取溶剂为乙腈。

其中，步骤2)中所述液-液萃取含有如下步骤：取被测生物体液于离心管中，加入6-苄基腺嘌呤-D5同位素内标，加入萃取溶剂，涡旋提取，超声，离心，取上清液过滤膜，得到供步骤3)上机测定的样品。

其中，步骤2)中所述液-液萃取含有如下步骤：取被测生物体液500μL于2mL离心管中，加入6-苄基腺嘌呤-D5同位素内标10μL(50ng)，加入500μL萃取溶剂，涡旋提取2分钟，超声5min后，离心机在在4℃，10000g/min的离心力下离心5分钟，取上清液过0.22μm滤膜，得到供步骤3)上机测定的样品。

其中，步骤3)中所述液相-高分辨率质谱联用检测所用的检测器为静电场轨道阱-高分辨率质谱检测。

其中，步骤3)中所述液相的色谱条件为：waters ACQUITY BEH C18 1.7μm，2.1*100mm；色谱柱温度：35℃；流动相A：10mmol/L乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱，洗脱条件：0-2分钟，10％B；2-7分钟，线性升高至95％B；7-9分钟，线性降低至10％B，9-10分钟，10％B。流速为0.3mL/分钟，进样量为2μL。

其中，步骤3)中所述质谱的质谱条件为：电喷雾离子源(high electrosprayionization，HESI)；电喷雾电压Spray Voltage：3200V；毛细管温度CapillaryTemperature 350℃；鞘气Sheath Gas：35arb；碰撞能(CE)：30；

辅助气Aux Gas：15arb；辅助加热温度Pro Heater Temp：300；S-lens RF level：50；

扫描模式：负模式全扫描/实时二级质谱扫描Full MS/dd MS2模式，一级全扫描的扫描范围为m/z50-750，分辨率70000，二级扫描(dd-MS2)分辨率17500。

本发明的有益效果如下：

1、在生物体液(血液、尿液中)在添加水平为4ng/mL、20ng/mL、40ng/mL三水平下，方法回收率可达到90％以上，精密度标准方差在15％之内，符合生物样品检测方法的方法学要求。

2、本方法的方法检出限为4ng/mL，远高于现有文献报道的检出限300ng/mL。

附图说明

图1、6-苄基腺嘌呤标准工作曲线

图2、空白血样基质提取液中6-苄基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤-D5质谱提取流图

图3、空白尿样中6-苄基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤-D5质谱提取流图

图4、空白血样加标基质提取液中6-苄基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤-D5质谱提取流图

图5、6-苄基腺嘌呤二级质谱图

图6、6-苄基腺嘌呤-D5二级质谱图

具体实施方式

第一部分生物体液中6-苄基腺嘌呤的检测方法

1.实验部分

1.1.实验材料

1.1.1.标准品和试剂

6-苄基腺嘌呤购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度98.9％；

6-苄基腺嘌呤-D5购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度98.0％；

甲醇、乙腈购自Merck公司，色谱纯

一级水、二级水均为Mliipore纯水制备系统制备

甲醇、乙腈、乙酸乙酯购自天津国药试剂公司，分析纯

0.22μm滤膜购自天津博纳艾吉尔公司

1.1.2.生物样品来源

空白人血液购自河北省血液中心

空白尿液采自健康志愿者

1.1.3.标准溶液的配置

6-苄基腺嘌呤储备液的配置：精确称取5.0mg 6-苄基腺嘌呤标准品于5mL容量瓶中，加入少许甲醇，超声溶解，然后用甲醇定容至刻度。配置成1mg/mL的6-苄基腺嘌呤储备液，4℃储存于冰箱中备用。

6-苄基腺嘌呤-D5(内标)储备液的配置：精确称取5.1m g6-苄基腺嘌呤-D5标准品于5mL容量瓶中，加入少许甲醇，超声溶解，然后用甲醇定容至刻度。配置成1mg/mL的6-苄基腺嘌呤D5储备液，4℃储存于冰箱中备用。

1.1.4.标准储备液的配置

取10μL 6-苄基腺嘌呤储备液于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到1μg/mL的中间液，取10μL6-苄基腺嘌呤-D5储备液于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到1μg/mL的内标中间液，再分别移取部分中间液，内标中间液，配置成6-苄基腺嘌呤分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL，内标浓度为50ng/mL的系列标准工作溶液，4℃储存于冰箱中备用。

1.2.仪器以及参考条件

静电场轨道阱-四极杆串联高分辨率质谱仪Q Exactive plus(美国赛默飞公司)

超高效液相色谱仪Ultimate3000(美国赛默飞公司)

电子天平BT125D最小感量0.01mg(瑞士赛利多斯公司)

Millipore超纯水净化系统(美国密理博公司)

Wiggens涡旋震荡器Vortex3000(维根技术公司)

超声波清洗器KQ500E(昆山超声仪器有限公司)

高速离心机CT15RE(日本日立公司)

移液枪(10μL，100μL，1000μL)(德国eppendorf公司)

1.3.样品制备方法

取待检测的尿液或者血液500μL于2mL离心管中，加入6-苄基腺嘌呤D5同位素内标50μL，加入450μL乙腈，涡旋提取2分钟，超声5min后，使用离心机在10000g/min的离心力4℃下离心5分钟，取上清液过0.22μm滤膜，上机测定。

1.4.仪器参考条件

1.4.1.液相色谱-四极杆-静电场轨道阱串联高分辨率质谱仪条件

色谱条件：

色谱柱：waters ACQUITY BEH C18 1.7μm，2.1*100mm；

色谱柱温度：35℃；

洗脱程序：梯度洗脱洗脱条件：流动相A：10mmol/L乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱，洗脱条件：0-2分钟，10％B；2-7分钟，线性升高至95％B；7-9分钟，线性降低至10％B，9-10分钟，10％B。流速为0.3mL/分钟，进样量为2μL。

质谱条件：

电喷雾离子源(high electrospray ionization，HESI)；

电喷雾电压Spray Voltage：3200V；

毛细管温度Capillary Temperature 350℃；

鞘气Sheath Gas：35arb；

辅助气Aux Gas：15arb；

辅助加热温度Pro Heater Temp：300；

S-lens RF level：50；

扫描模式：

负模式全扫描/实时二级质谱扫描Full MS/dd MS2；

一级全扫描(m/z50-750)分辨率70000；

二级扫描(dd-MS2)分辨率17500。

碰撞能(CE)：30

表1 6-苄基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤-D5、理论精确分子量、加合精确分子量、二级子离子精确分子量

2.方法验证

按照1.3、1.4所述对样品进行前处理，仪器检测，对方法进行验证，验证包括方法线性范围、抗干扰性、灵敏度、回收率、精密度等指标。

2.1.线性范围

配置成6-苄基腺嘌呤(外标)分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL，6-苄基腺嘌呤D5(内标)浓度为50ng/mL的系列标准工作溶液，各取2μL进样，以外标峰面积与内标峰面积之比为纵坐标(Y)，以外标浓度为横坐标(X)进行线性回归，求得6-苄基腺嘌呤的回归方程为Y＝0.0193269+0.0158084*X，R

2.2.方法抗干扰性

取空白血液、尿液，加入一定量的6-苄基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤D5，按照1.3、1.4所述对样品进行前处理，仪器检测，同时做空白对照试验，图谱见图2、图3、图4，结果表明，在目标物出峰时间内，空白血液以及尿液均未出现明显色谱峰，表明方法不存在干扰。

2.3.方法回收率

取空白血液或者尿液，加入一定量的6-苄基腺嘌呤，使其浓度达到4ng/mL、20ng/mL、100ng/mL三个水平，每个水平重复测定6次，按照1.3、1.4所述对样品进行前处理以及分析检测，测得添加样品中回收率结果见表2。

表2生物样品中添加6-苄基腺嘌呤的平均回收率(％)n＝6

2.4.方法精密度

取空白血液或者尿液，加入一定量的6-苄基腺嘌呤，使其浓度达到4ng/mL、20ng/mL、100ng/mL三个水平，按照1.3、1.4所述对样品进行前处理以及分析检测，每个水平每天重复测定6次，得到日内精密度，每个水平测定1次，连续测定6天，得到日间精密度，日内精密度和日间精密度见表3。结果表明：日内精密度在3.4％-5.6％之间，日间精密度在4.5％-11.7％之间，该方法重现性较好。

表3生物样品日内和日间精密度

2.5.方法灵敏度

取空白血液或者尿液，加入一定量的6-苄基腺嘌呤，按照1.3、1.4所述对样品进行前处理以及分析检测，使其信噪比达到S/N＝3，测得此时对应的样品添加浓度即为方法检出限4ng/mL。

3.结果与讨论

3.1.提取方法的选择

萃取溶剂的选择，本发明比较了乙腈、水、甲醇、或者乙腈和水的混合溶液(V/V＝1:3)等4种常用的萃取溶剂，取空白血液或者尿液，加入一定量的6-苄基腺嘌呤，改变提取溶剂，其他条件不变，按照1.3、1.4所述对样品进行前处理以及分析检测。通过考察回收率来比较不同提取溶剂的提取效果，结果表明：乙腈回收率最高，乙腈和水的混合溶液回收率其次，使用水、甲醇做提取溶剂由于沉淀蛋白效果不显著，导致基质效应偏大，且提取液离心后仍然浑浊，难以过滤。综合考虑，本发明优选乙腈做提取溶剂。

3.2.标准溶液配置的选择

由于质谱检测中普遍存在基质效应，导致测定回收率时偏差较大，本方法研究的基质是血液和尿液，基质复杂，产生的基质效应较大，使用外标法导致回收率偏低，实验重复性差。针对此现象，本方法采用引入同位素内标方法来降低基质效应干扰。我们比较基质添加标线和有机溶剂直接配置标线对定量的区别，使用空白血液提取液基质、尿液提取液基质(将“1.3样品制备方法”中“待检测的尿液或者血液”替换为空白的尿液或者血液，并按照“1.3样品制备方法”制备得到)、纯甲醇分别配置成6-苄基腺嘌呤(外标)分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL，6-苄基腺嘌呤D5(内标)浓度为50ng/mL的系列标准溶液，对添加样品浓度为4ng/mL、20ng/mL、100ng/mL下比较三种标线对定量的影响，经过比较，测定结果相互间差异无统计学意义(P＞0.05)。这可能是由于引入了内标对基质效应进行了同步消除，因此选择溶剂直接配置标线。

3.3.质谱条件的选择

本发明将提取精确质量数的偏差设定在5ppm之内，在此基础上利用二级特征碎片离子进行辅助定性，最大程度的降低了质量偏差，得到的二级碎片特征离子谱图见图5、图6，有效降低了仪器噪音干扰以及杂质干扰以及假阳性的产生。

4.稳定性考察

6-苄基腺嘌呤稳定性可能受到以下几种因素影响：一是随着储存时间对其稳定性的影响；二是在生物体液受到其他物质作用而发生分解；因此需要考察其稳定性。

4.1.实验部分

4.1.1.溶液中稳定性考察

分别配置含4ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的6-苄基腺嘌呤的甲醇溶液，每份3平行，置于冰箱中4℃储存，放置0，7，14，21，28，35天后按照1.4所述对样品进行分析检测。比较出峰面积大小差异，经比较，浓度无统计学意义(P＞0.05)，说明6-苄基腺嘌呤在冰箱中4℃储存条件下具有1个月以上稳定性。

4.1.2.提取样品反复融冻稳定性考察

用空白尿液提取液基质以及血液提取液基质配置4ng/mL、10ng/mL、50ng/mL三个水平基质加标溶液，-20℃保存，分别放置24小时、48小时、72小时后，按照1.3、1.4所述对样品进行前处理以及分析检测，考察每次分析结果之间差异，结果表明浓度无统计学意义(P＞0.05)，说明6-苄基腺嘌呤在提取样品溶液中72小时具有稳定性。

4.1.3.在血液和尿液中稳定性考察

取足量的空白血液及尿液加入一定量标准品，使其浓度达到到4ng/mL、10ng/mL、50ng/mL每个水平样品平均分成18份，-20℃保存。分别在第0天、7天、14天、21天、28天、35天，按照1.3、1.4所述对样品进行前处理以及分析检测，每次检测3份，考察样品含量检测差异，结果表明测定含量无统计学意义(P＞0.05)，说明6-苄基腺嘌呤在血液以及尿液中-20℃保存具有稳定性，含量1个月内无明显变化。

5.结论

本发明建立了生物体液中6-苄基腺嘌呤的检测方法，该方法回收率高、重现性好、特异性好。方法前处理简便、快速、廉价高效。与目前已经公布的文献报道(GC/MS检测血中的6-苄基腺嘌呤，P-532，崔冠峰等，第三届全国质谱分析学术报告会，中国厦门，2017.12.09)相比，本发明检出限优势明显，此外，本发明使用了高分辨率质谱一级精确质量数和二级特征碎片离子进行了定量和定性，大大减少了假阳性和假阴性误判的发生。因此，我们认为本发明不仅可以作为最终确认方法应用于涉及生物体液中6-苄基腺嘌呤中毒案件的检测，还可以作为早期监测方法，应用于相关人员健康监测中。

6-苄基腺嘌呤在冰箱中4℃储存条件下具有1个月以上稳定性。

6-苄基腺嘌呤在空白尿液基质提取液以及血液基质提取液中，经72小时反复融冻其含量不会发生明显变化。

6-苄基腺嘌呤在血液以及尿液中-20℃保存具有稳定性，含量1个月内无明显变化。

实施例1：

精确称取6-苄基腺嘌呤10mg，用生理盐水配置成浓度为0.2mg/mL的混合溶液50mL，置4℃冰箱保存备用。喂养健康的实验用Sprague-Dawley大鼠，周龄在8-10周，饲养环境：温度22℃-24℃，湿度40％Rh-60％Rh，喂养常规饲料和高压消毒灭菌水，适应性喂养1周，选取体重在250g-300g范围内Sprague-Dawley大鼠6只，实验前12h禁食，其中1只做空白对照，其余5只以1mg/kg剂量灌胃给与6-苄基腺嘌呤溶液，3h后将6只大鼠处死，取血、尿，采用1.3、1.4所述对样品进行前处理以及分析检测。结果见下表4，结果表明在较低的浓度下本方法仍可检测出6-苄基腺嘌呤，与其他文献报道(GC/MS检测血中的6-苄基腺嘌呤，P-532，崔冠峰等，第三届全国质谱分析学术报告会，中国厦门，2017.12.09)的方法相比，本方法检出限更低。应用本方法检测生物体液中6-苄基腺嘌呤的含量是可行的。

表4 6-苄基腺嘌呤检测结果