动物细胞、动物细胞的制造方法及靶蛋白的制造方法

技术领域

本发明涉及一种表达靶蛋白的动物细胞。本发明涉及一种上述动物细胞的制造方法及使用上述动物细胞的靶蛋白的制造方法。

背景技术

在抗体等生物药物的制造中，为了提高抗体的生产率，通常使用补料分批培养，在该补料分批培养中通过在培养液中追加添加营养而改善细胞的状态。并且，在抗体等生物药物的制造中，为了提高抗体的生产率，通常使用灌注培养，在该灌注培养中将培养液连续过滤及排出，同时将包含营养成分的新鲜培养基连续供给到培养槽中。

在专利文献1中，作为能够以高生产量制造蛋白质的方法，公开有一种多肽的制造方法，其包括如下工序：培养导入强烈表达谷氨酸-丙酮酸转氨酶并编码所需多肽的DNA的细胞，从而产生所需多肽。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO2009/020144号公报

发明内容

发明要解决的技术课题

在补料分批培养中，与不追加营养的情况相比，能够以更高密度的细胞密度长期进行细胞培养，但是由于从细胞分泌的废物的积蓄的影响，培养后半部分的细胞存活率降低，因此存在无法通过延长培养期间来增加产物的问题。

并且，为了在灌注培养法中以高密度培养细胞，由于为了供给营养以及将废物排出到系统外，需要每天回收和供给培养体积的1～3倍量的培养基，培养成本变高成为问题。

本发明要解决的课题在于提供一种能够以高生产率制造靶蛋白的动物细胞。本发明要解决的课题还在于提供一种上述动物细胞的制造方法及使用上述动物细胞的靶蛋白的制造方法。

用于解决技术课题的手段

本发明人等为了解决上述问题进行了深入研究的结果，在CHO细胞中强制表达SNAT2(Sodium-dependent neutral amino acid transporter-2：钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白2)基因(基因名称为SLC38A2)会影响蛋白质的产量，其结果，能够实现抗体生产率(Qp)的提高及抗体产量的提高。本发明是根据上述见解而完成的。

即，根据本发明，提供以下发明。

＜1＞一种动物细胞，其具有编码靶蛋白的基因及编码SNAT2的外源基因即与启动子连接的外源基因，上述SNAT2过表达。

＜2＞根据＜1＞所述的动物细胞，其中，

过表达为组成型的。

＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的动物细胞，其中，

编码SNAT2的外源基因具有碱基序列，所述碱基序列与序列号1中所记载的碱基序列具有90％以上的序列同源性。

＜4＞根据＜1＞至＜3＞中任一项所述的动物细胞，其中，

编码SNAT2的外源基因包含序列号1中所记载的碱基序列。

＜5＞根据＜1＞至＜4＞中任一项所述的动物细胞，其中，

动物细胞为CHO细胞。

＜6＞根据＜1＞至＜5＞中任一项所述的动物细胞的制造方法，其包括：对动物细胞导入编码靶蛋白的基因及编码SNAT2的外源基因即与启动子连接的外源基因的工序。

＜7＞根据＜6＞所述的方法，其中，

导入编码SNAT2的外源基因即与启动子连接的外源基因的工序通过电穿孔法来进行。

＜8＞一种靶蛋白的制造方法，其包括：培养＜1＞至＜5＞中任一项所述的动物细胞。

＜9＞根据＜8＞所述的方法，其中，

培养为补料分批培养。

＜10＞根据＜9＞所述的方法，其中，细胞培养的接种细胞密度为0.2×10

＜11＞根据＜10＞所述的方法，其中，培养期间中的活细胞率在整个期间为60％以上。

＜12＞根据＜8＞所述的方法，其中，

培养为灌注培养。

＜13＞根据＜12＞所述的方法，其中，细胞培养的接种细胞密度为0.2×10

＜14＞根据＜13＞所述的方法，其中，培养期间中的活细胞率在整个期间为90％以上。

发明效果

根据本发明的动物细胞，能够以高生产率制造靶蛋白。

附图说明

图1是表示测定基因导入后的细胞的培养上清液中的抗体浓度的结果。

图2是测定基因导入后的细胞的培养上清液中的每个细胞的抗体生产率(Qp)的结果。

图3表示测定基因导入后的细胞尺寸的结果。

图4表示测定培养期间的活细胞密度积分的结果。

具体实施方式

以下，对用于实施本发明的方式进行详细说明。

在本说明书中，使用“～”表示的数值范围是指将“～”前后所记载的数值分别作为最小值及最大值而包含的范围。

[动物细胞]

本发明的动物细胞为具有编码靶蛋白的基因及编码SNAT2的外源基因即与启动子连接的外源基因，并且上述SNAT2过表达的动物细胞。

在小鼠肝脏中，SNAT2基因表达激活mTORC1/S6K途径(Nature Communications 6，Article number：7940(2015))，因此显示SNAT2基因的表达与mTOR基因的表达的相关性。据报告，在大鼠细胞中，通过激活mTOR而细胞增殖受到抑制并且细胞尺寸变大(GenesDev.2002Jun 15；16(12)：1472-1487)。并且，细胞尺寸越大，蛋白质产物的产量越多(Cytotechnology 34：59-70，2000)。然而，SNAT2基因表达与重组蛋白的产量的关系尚不清楚。

在专利文献1中，通过谷氨酸-丙酮酸转氨酶的导入效果而存活率的降低变得缓慢，但是由于60％以下的期间长，对抗体质量的影响令人担忧。并且，由于牛磺酸转印蛋白的导入，每个细胞的抗体生产率(Qp)降低，因此存在即使细胞密度上升也无法增加产量的问题。相对于此，在本发明中，通过增强与蛋白质生物合成相关的SNAT2基因的表达来提高每个细胞的抗体生产率(Qp)。

＜靶蛋白＞

在本发明中，靶蛋白的种类不受特别限定，例如为重组多肽链、重组分泌多肽链、抗原结合蛋白、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、小鼠抗体、双特异性抗体、Fc融合蛋白、片段化免疫球蛋白、单链抗体(scFv)。靶蛋白优选为人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或小鼠抗体。作为片段化免疫球蛋白，可以举出Fab、F(ab’)

人抗体包括具有衍生自人免疫球蛋白序列的一个或多个可变区及恒定区的所有抗体。在一实施方式中，可变结构域及恒定结构域全部都衍生自人免疫球蛋白序列(完全人抗体)。

人源化抗体具有与通过一个或多个氨基酸取代、缺失、和/或添加衍生自非人物种的抗体的序列不同的序列，以在给药于人对象时，与非人物种抗体相比，人源化抗体诱发免疫应答的可能性降低和/或严重免疫应答的诱发变少。在一实施方式中，非人物种抗体的重链和/或轻链的骨架结构域及恒定结构域内的某一特定的氨基酸发生突变以产生人源化抗体。在另一实施方式中，来自人抗体的恒定结构域与非人物种的可变结构域融合。

嵌合抗体是指来源互不相同的可变区与恒定区连接的抗体。例如，由小鼠抗体的重链及轻链的可变区和人抗体的重链及轻链的恒定区组成的抗体为小鼠/人异源嵌合抗体。通过将编码小鼠抗体的可变区的DNA与编码人抗体的恒定区的DNA连接并将其编入表达载体中，能够制作表达嵌合抗体的产物载体。通过培养用上述载体转化的产物细胞并使所编入的DNA表达，从而能够获取在培养中生产的嵌合抗体。

双特异性抗体是指识别两个不同的抗原特异性的、通过化学方法或细胞融合制作出的抗体。作为制作双特异性抗体的方法，报道有如下：使用N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯或S-乙酰巯基琥珀酸酐等交联剂将两个球蛋白分子结合而制作的方法、将球蛋白分子的Fab片段彼此结合而制作的方法等。

Fc融合蛋白表示具有Fc区的蛋白，包括抗体。

Fab为具有V

F(ab’)

Fv片段具有抗体的单臂的V

单链抗体(scFv)为V

编码靶蛋白的基因能够通过本领域技术人员公知的方法来获得。当靶蛋白为抗体时，能够使用编码抗体的L链的DNA及编码H链的DNA。

能够以如下方式制备编码抗体的L链的DNA及编码H链的DNA。从具有表达抗体的基因的杂交瘤、细胞、噬菌体、核糖体等提取mRNA。通过使用逆转录酶的逆转录反应，由该mRNA制作cDNA。通过使用具有与L链基因或H链基因互补的碱基序列的引物和cDNA的PCR来扩增L链基因或H链基因，并通过与克隆用质粒结合来获取各基因。

能够以如下方式制备编码抗体的L链的片段的DNA及编码H链的片段的DNA。从具有表达抗体的基因的杂交瘤、细胞、噬菌体、核糖体等提取mRNA。通过使用逆转录酶的逆转录反应，由该mRNA制作cDNA。通过使用具有与L链基因片段或H链基因片段互补的碱基序列的引物和cDNA的PCR来扩增L链基因片段或H链基因片段，并通过与克隆用质粒结合来获取各基因片段。

＜SNAT2及SNAT2基因＞

在本发明中，SNAT2的来源不受特别限定，能够使用对源自人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠等哺乳动物的SNAT2进行编码的外源基因。在本发明中，外源基因是指从外部导入动物细胞中的基因。并且，在扩增内源基因而进行了基因导入的情况下也视为外源基因。

将人SNAT2的碱基序列和氨基酸序列示于序列表的序列号1及2。

人SNAT2基因的碱基序列(序列号1)

ATGAAGAAGGCCGAAATGGGACGATTCAGTATTTCCCCGGATGAAGACAGCAGCAGCTACAGTTCCAACA

GCGACTTCAACTACTCCTACCCCACCAAGCAAGCTGCTCTGAAAAGCCATTATGCAGATGTAGATCCTGA

AAACCAGAACTTTTTACTTGAATCGAATTTGGGGAAGAAGAAGTATGAAACAGAATTTCATCCAGGTACT

ACTTCCTTTGGAATGTCAGTATTTAATCTGAGCAATGCGATTGTGGGCAGTGGAATCCTTGGGCTTTCTT

ATGCCATGGCTAATACTGGAATTGCTCTTTTTATAATTCTCTTGACATTTGTGTCAATATTTTCCCTGTA

TTCTGTTCATCTCCTTTTGAAGACTGCCAATGAAGGAGGGTCTTTATTATATGAACAATTGGGATATAAG

GCATTTGGATTAGTTGGAAAGCTTGCAGCATCTGGATCAATTACAATGCAGAACATTGGAGCTATGTCAA

GCTACCTCTTCATAGTGAAATATGAGTTGCCTTTGGTGATCCAGGCATTAACGAACATTGAAGATAAAAC

TGGATTGTGGTATCTGAACGGGAACTATTTGGTTCTGTTGGTGTCATTGGTGGTCATTCTTCCTTTGTCG

CTGTTTAGAAATTTAGGATATTTGGGATATACCAGTGGCCTTTCCTTGTTGTGTATGGTGTTCTTTCTGA

TTGTGGTCATTTGCAAGAAATTTCAGGTTCCGTGTCCTGTGGAAGCTGCTTTGATAATTAACGAAACAAT

AAACACCACCTTAACACAGCCAACAGCTCTTGTACCTGCTTTGTCACATAACGTGACTGAAAATGACTCT

TGCAGACCTCACTATTTTATTTTCAACTCACAGACTGTCTATGCTGTGCCAATTCTGATCTTTTCATTTG

TCTGTCATCCTGCTGTTCTTCCCATCTATGAAGAACTGAAAGACCGCAGCCGTAGAAGAATGATGAATGT

GTCCAAGATTTCATTTTTTGCTATGTTTCTCATGTATCTGCTTGCCGCCCTCTTTGGATACCTAACATTT

TACGAACATGTTGAGTCAGAATTGCTTCATACCTACTCTTCTATCTTGGGAACTGATATTCTTCTTCTCA

TTGTCCGTCTGGCTGTGTTAATGGCTGTGACCCTGACAGTACCAGTAGTTATTTTCCCAATCCGGAGTTC

TGTAACTCACTTGTTGTGTGCATCAAAAGATTTCAGTTGGTGGCGTCATAGTCTCATTACAGTGTCTATC

TTGGCATTTACCAATTTACTTGTCATCTTTGTCCCAACTATTAGGGATATCTTTGGTTTTATTGGTGCAT

CTGCAGCTTCTATGTTGATTTTTATTCTTCCTTCTGCCTTCTATATCAAGTTGGTGAAGAAAGAACCTAT

GAAATCTGTACAAAAGATTGGGGCTTTGTTCTTCCTGTTAAGTGGTGTACTGGTGATGACCGGAAGCATG

GCCTTGATTGTTTTGGATTGGGTACACAATGCACCTGGAGGTGGCCAT

人SNAT2基因的氨基酸配列(序列号2)

MKKAEMGRFSISPDEDSSSYSSNSDFNYSYPTKQAALKSHYADVDPENQNFLLESNLGKKKYETEFHPGT

TSFGMSVFNLSNAIVGSGILGLSYAMANTGIALFIILLTFVSIFSLYSVHLLLKTANEGGSLLYEQLGYK

AFGLVGKLAASGSITMQNIGAMSSYLFIVKYELPLVIQALTNIEDKTGLWYLNGNYLVLLVSLVVILPLS

LFRNLGYLGYTSGLSLLCMVFFLIVVICKKFQVPCPVEAALIINETINTTLTQPTALVPALSHNVTENDS

CRPHYFIFNSQTVYAVPILIFSFVCHPAVLPIYEELKDRSRRRMMNVSKISFFAMFLMYLLAALFGYLTF

YEHVESELLHTYSSILGTDILLLIVRLAVLMAVTLTVPVVIFPIRSSVTHLLCASKDFSWWRHSLITVSI

LAFTNLLVIFVPTIRDIFGFIGASAASMLIFILPSAFYIKLVKKEPMKSVQKIGALFFLLSGVLVMTGSM

ALIVLDWVHNAPGGGH

作为编码SNAT2的外源基因，能够使用：

(1)编码由序列号2中所记载的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；

(2)编码由在序列号2中所记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成且具有SNAT2功能的蛋白质的基因；或

(3)编码由与序列号2中所记载的氨基酸序列具有85％以上(进一步优选为90％以上，尤其优选为95％以上，最优选为98％以上)的序列同源性的氨基酸序列组成且具有SNAT2功能的蛋白质的基因。

SNAT2功能是指，激活mTORC1/S6K途径的功能。已知在大鼠细胞中，通过激活mTOR细胞增殖受到抑制并且细胞尺寸变大。

作为编码SNAT2的外源基因，也能够进一步使用：

(4)由序列号1中所记载的碱基序列组成的基因；

(5)编码由在序列号1中所记载的碱基序列中缺失、取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列组成且具有SNAT2功能的蛋白质的基因；

(6)编码由对序列号1中所记载的碱基序列的互补序列在严格(stringendo)的条件下杂交(hybridize)的碱基序列组成且具有SNAT2功能的蛋白质的基因；或

(7)编码具有与序列号1中所记载的碱基序列具有90％以上(进一步优选为95％以上，尤其优选为98％以上)的序列同源性的碱基序列且具有SNAT2功能的蛋白质的基因。

“缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列”中的“一个或多个”是指优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个，尤其优选为1～3个。

本发明中的序列同源性是指用以下式计算的值。

％序列同源性＝[(相同残基数)/(较长的比对长度)]×100

两个氨基酸序列中的序列同源性能够利用本领域技术人员公知的任意的方法来确定，能够使用BLAST((Basic Local Alignment Search Tool))程序(J.Mol.Biol.215：403-410，1990)等来确定。分母的“较长的比对长度”是指当比较了两个比对时，分母使用较长的比对长度。

“缺失、取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列”中的“一个或多个”是指优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个，尤其优选为1～3个。

“在严格的条件下杂交”中的“在严格的条件下”是指在中度或高度的严格条件下杂交，这些只要是本领域技术人员就能够认识到。作为中度的严格的条件，能够举出Sambrook等人、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第3版、Vol.1、7.42-7.45 ColdSpring Harbor Laboratory Press，2001中所记载的条件。中度的严格条件例如能够举出在硝基纤维素过滤器中5×SSC、0.5％SDS、1.0mmol/L EDTA(pH8.0)的预洗涤溶液、约40～50℃下的约50％甲酰胺、2×SSC～6×SSC(或约42℃下的约50％甲酰胺中的施托克溶液(Stark’s solution)等其他同样的杂交溶液)的杂交条件及约60℃、0.5×SSC、0.1％SDS的洗涤条件。高程度严格的条件也能够由本领域技术人员轻松地确定，例如包括比上述中度严格的条件高的温度和/或低的盐浓度下的杂交和/或洗涤。例如，能够举出如上所述的杂交条件及68℃、0.2×SSC、0.1％SDS下的洗涤。在此，1×SSC的组成为150mmol/L NaCl、15mmol/L柠檬酸钠、pH7.4。SDS为十二烷基硫酸钠，EDTA为乙二胺四乙酸。

以下示出除了人以外的SNAT2的氨基酸序列和碱基序列的信息。以下编号表示NCBI(National Center for Biotechnology Information：美国国家生物技术信息中心)的Gene No.。

ID：29642大鼠(Rattus norvegicus)

ID：67760小鼠(Mus musculus)

ID：566537斑马鱼(Danio rerio)

ID：338044牛(Bos taurus)

ID：417807鸡(Gallus gallus)

ID：702253猕猴(Macaca mulatta)

ID：101083348猫(Felis catus)

ID：100525644猪(Sus scrofa)

ID：101149564大猩猩(Gorilla gorilla)

对于除人以外的SNAT2，也可以与人SNAT2的情况相同地使用：

(2A)编码由在规定的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成且具有SNAT2功能的蛋白质的基因；

(3A)编码由与规定的氨基酸序列具有85％以上(进一步优选为90％以上，尤其优选为95％以上，最优选为98％以上)的序列同源性的氨基酸序列组成且具有SNAT2功能的蛋白质的基因；

(5A)编码由在规定的碱基序列中缺失、取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列组成且具有SNAT2功能的蛋白质的基因；

(6A)编码由对规定的碱基序列的互补序列在严格(stringendo)的条件下杂交(hybridize)的碱基序列组成且具有SNAT2功能的蛋白质的基因；或

(7A)编码具有与规定的碱基序列具有90％以上(进一步优选为95％以上，尤其优选为98％以上)的序列同源性的碱基序列且具有SNAT2功能的蛋白质的基因。

编码SNAT2的外源基因与启动子连接。

作为启动子，只要能够在宿主的动物细胞中发挥作用而使SNAT2表达，则不受特别限定。作为启动子，优选CMV启动子(巨细胞病毒启动子)、EF1α启动子(人多肽链延伸因子基因的启动子)、SV40启动子(猿猴空泡病毒40启动子)、β-肌动蛋白启动子、MMLV-LTR启动子(莫洛尼小鼠白血病病毒的长末端重复启动子)或小鼠β珠蛋白启动子，更优选CMV启动子。

在本发明的动物细胞中，SNAT2过表达。过表达是指某一基因的表达超过宿主中的通常的表达量。通过将编码SNAT2的外源基因导入宿主并使上述外源基因在宿主中表达，能够获得SNAT2过表达的动物细胞。

本发明的动物细胞中的SNAT2的表达量相对于不具有编码SNAT2的外源基因的动物细胞，优选为3倍以上，更优选为3.5倍以上，进一步优选为4倍以上，更进一步优选为4.5倍以上，再进一步优选为5倍以上，尤其优选为5.5倍以上。可以没有上限，既可以为30000倍以下，也可以为10000倍以下。

SNAT2的表达量能够通过RT-PCR法(逆转录-聚合酶链反应)等来调查。SNAT2的表达量优选通过mRNA的逆转录和实时PCR来实施。异SNAT2的表达量优选为通过标准化而计算的相对表达量。标准化例如能够通过将β-肌动蛋白或HPRT1等管家基因的表达量作为内源性对照的比较定量来进行。

＜动物细胞＞

本发明中的细胞只要是动物细胞，则不受特别限定。作为动物细胞，能够举出中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、BHK细胞、293细胞、骨髓瘤细胞(NS0细胞等)、PerC6细胞、SP2/0细胞、杂交瘤细胞、COS细胞、3T3细胞、HeLa细胞、Vero细胞、MDCK细胞、PC12细胞、WI38细胞等。在上述之中，尤其优选CHO细胞、BHK细胞、293细胞、骨髓瘤细胞(NS0细胞等)、PerC6细胞、SP2/0细胞、杂交瘤细胞，进一步优选CHO细胞。CHO细胞产物蛋白例如被广泛用于细胞因子、凝血因子及抗体的产生。优选使用缺失了二氢叶酸还原酶(DHFR)的CHO细胞，作为DHFR缺陷型CHO细胞，例如能够使用CHO-DG44。

[动物细胞的制造方法]

根据本发明，提供一种本发明的动物细胞的制造方法，其包括：对动物细胞导入编码靶蛋白的基因和编码SNAT2的外源基因即与启动子连接的外源基因的工序。

编码靶蛋白的基因及编码SNAT2的外源基因优选分别以编入载体中的形式导入宿主即动物细胞中。

作为能够用于将基因导入宿主中的载体，例如能够使用来源于哺乳动物的表达载体，例如可以举出pCMV6-Entry(OriGene公司制造)、pcDNA3(Invitrogen公司制造)、pEGF-BOS(Nucleic Acids.Res.1990，18(17)，p5322)、pEF、pCDM8(Funakoshi公司制造)、INPEP4(Biogen-IDEC公司制造)等，但不受特别限定。

并且，已知有具有聚A的mRNA在细胞内稳定。编码靶蛋白的基因及编码SNAT2的外源基因可以具有用于将聚A添加到基因而所需要的聚A信号，例如小鼠β珠蛋白聚A信号、牛成长激素聚A信号、SV40聚A信号等。

将编码靶蛋白的基因及编码SNAT2的外源基因导入动物细胞中的方法不受特别限定，能够通过本领域技术人员公知的方法来进行。例如，能够利用电穿孔法、脂质转染、磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、使用阳离子脂质体DOTAP(Roche Life Science公司制造)的方法或使用病毒载体的方法来进行。在上述之中，优选为电穿孔法。

当将基因导入动物细胞时，根据所使用的表达载体的种类及基因导入法，将基因仅导入供于基因导入的细胞中的一部分细胞中。为了鉴定及选择已导入基因的细胞，例如可以将编码对抗生素抗性的选择标记的基因与目标基因一起导入宿主细胞内。优选的选择标记包括对药物赋予抗性的那些标记，例如G418、潮霉素及甲氨蝶呤等。

在本发明的细胞中，编码靶蛋白的基因可以在瞬时表达系统中表达，也可以在组成型表达系统中表达，但优选在组成型表达系统中表达。

在本发明的细胞中，编码SNAT2的外源基因可以在瞬时表达系统中表达，也可以在组成型表达系统中表达，但优选在组成型表达系统中表达。

瞬时表达系统是指通过磷酸钙法、电穿孔法、脂质转染法等将环状质粒取入细胞内并使其表达的方法。编码靶蛋白的基因及编码SNAT2的外源基因一般存在于染色体外部。

组成型表达系统是指通过磷酸钙法、电穿孔法、脂质转染法将环状质粒或通过限制性酶处理等制作的直链上质粒等取入细胞内并将一部分插入细胞的基因组中使靶蛋白表达的方法。编码靶蛋白的基因及编码SNAT2的外源基因的表达能够长期维持。并且，若将药剂抗性基因导入质粒中，则药剂挑选变得可能，能够有效选择编码靶蛋白的基因及编码SNAT2的外源基因维持在染色体上的细胞。

[靶蛋白的制造方法]

根据本发明，提供一种靶蛋白的制造方法，其包括如下工序：培养本发明的动物细胞。

通过培养本发明的动物细胞，能够制造靶蛋白。培养能够按照公知的方法来进行。

作为用于本发明的动物细胞的培养中的培养基，能够使用在通常的动物细胞的培养中使用的培养基。例如，能够使用OptiCHO(Lifetechnologies公司，12681011)培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、Eagle最低必须培养基(MEM)、RPMI-1640培养基、RPMI-1641培养基、F-12K培养基、Ham F12培养基、Iscob改良Dulbecco培养基(IMDM)、McCoy5A培养基、Leibovitz L-15培养基及EX-CELL(商标)300系列(JRH Biosciences公司)、CHO-S-SFMII(Invitrogen公司)、CHO-SF(Sigma-Aldrich公司)、CD-CHO(Invitrogen公司)、IS CHO-V(Irvine Scientific公司)、PF-ACF-CHO(Sigma-Aldrich公司)等。

培养基中可以添加胎牛血清(FCS)等血清，更优选在无血清培养基中培养，最优选为完全合成培养基。

培养基中可以补充氨基酸、盐、糖类、维生素、激素、生长因子、缓冲液、抗生素、脂质、微量元素、植物蛋白的水解物等追加成分。

培养基的pH根据所培养的细胞而不同，但一般为pH6.0～8.0，优选为pH6.8～7.6，更优选为pH7.0～7.4。

培养温度一般为30℃～40℃，优选为32℃～37℃，更优选为36℃～37℃，并且可以在培养过程中改变培养温度。

培养优选在CO

培养期间不受特别限定，但一般为12小时～90天，优选为24小时～60天，更优选为24小时～30天。

在培养中，根据需要能够施加培养基的更换、充气、搅拌。

本发明的动物细胞的培养能够在培养装置(也称为生物反应器)或除此以外的合适的容器内进行。作为培养装置，能够使用发酵槽型罐培养装置、气升型培养装置、培养瓶型培养装置、搅拌瓶型培养装置、微载体型培养装置、流化床型培养装置、中空纤维型培养装置、转瓶型培养装置、填充槽型培养装置等来进行培养。

培养规模一般为1L～20000L，优选为1L～10000L，更优选为200L～2000L，进一步优选为500L～2000L。

培养可以使用分批培养(batch culture)、补料分批培养(fed-batch culture；也称为加料分批培养)、灌注培养(perfusion culture)等任一种方法，但优选补料分批培养或灌注培养。

分批培养是指细胞在固定体积的培养基中短期间生长，然后完全回收的不连续的方法。使用分批法生长的培养物经历细胞密度的增加直至达到最大细胞密度，然后消耗培养基成分，随着代谢副产物(乳酸盐及氨等)的水平积聚而存活细胞密度衰退。回收典型地在实现最大细胞密度(典型地，5～10×10

补料分批培养为通过供给剂量(Bolus)或连续供给培养基以补充所消耗掉的培养基成分来改善分批工艺的培养方法。即，在补料分批培养中，培养形态为悬浮培养，在培养工艺开始后的一个以上的时间点在培养中提供追加成分。作为追加成分，可以举出在培养工艺中耗尽的细胞用的营养辅助成分，也可以包括其他辅助成分(例如，抑制细胞周期的化合物)。

在补料分批培养中，由于在整个培养期间添加追加养分，因此与分批培养相比，有可能实现更高的细胞密度及靶蛋白的高产生量。在补料分批培养中，与分批培养不同，能够通过操作供给时间表及培养基成分来制作及持续二相培养，以将用于实现所期望的细胞密度的细胞生长期间(生长期)与中止的或缓慢的细胞生长期间(产生期)区分。由此，与分批培养相比，补料分批培养有可能实现靶蛋白的更高产生量。

在补料分批培养中，细胞培养的接种细胞密度一般为0.2×10

在补料分批培养中，培养期间中的活细胞率在整个期间优选为60％以上且100％以下，更优选为70％以上且100％以下，进一步优选为75％以上且100％以下。

灌注培养为添加新鲜的培养基，同时去除使用完的培养基的培养法，有可能进一步改善分批培养及补料分批培养。灌注培养例如能够使用ATF(Alternating TangentialFlow Filtration：交替切向流细胞截留)泵或TFF(Tangential Flow Filtration：切向流过滤)泵来进行。根据灌注培养，能够实现超过1×10

灌注培养的优点是，与分批培养法或补料分批培养相比，产生靶蛋白的培养可维持更长期间。但是，为了维持长期的灌注培养、尤其维持高细胞密度的灌注培养，需要制备、使用、保存及废弃培养基。在灌注培养中，需要大量养分，与分批培养及补料分批培养相比，靶蛋白的生产成本趋于增高。并且，通过选择膜孔径，由于能够将抗体回收于系统外部的同时继续培养，因此缩短抗体在培养液中的停留时间并减少化学变化，由此能够将抗体的品质保持为较高。

也能够进行将补料分批培养及灌注培养组合的培养。作为一例，能够为了维持生长期的细胞的培养而使用伴有剂量供给的补料分批培养，接着，为了产生靶蛋白而使用灌注培养。

灌注可以为连续、阶段性、断续或这些的组合中的任意形态。动物细胞被保持于培养物中，且被去除的使用完的培养基实质上不包含细胞或者可以具有远远少于培养物的细胞。通过选择膜孔径，能够将通过细胞培养表达的靶蛋白保持或回收于培养物中。为了防止培养中的细胞密度变得过大，也可以通过将培养液的一部分与细胞一同抽取，并加入相同量的新鲜的培养基来减小细胞密度(细胞渗出)。

在灌注培养中，细胞培养的接种细胞密度一般为0.2×10

在灌注培养中，培养期间中的活细胞率在整个期间优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上。

在灌注培养中，最高达到细胞密度优选为2×10

作为灌注培养中的灌注比，优选为0.3vvd以上且5.0vvd以下，更优选为0.3vvd以上1.5vvd以下。其中，vvd表示以下。

vvd＝(volume of fresh medium/working volume of reactor/day，每天的供给培养液量/培养液量)

细胞培养的接种细胞密度及培养中的最高达到细胞密度能够通过利用常规方法测定细胞数并将细胞数除以培养液量来求出。

培养期间中的活细胞率(存活率)通过将活细胞数除以(活细胞数+死细胞数)来求出。例如，细胞数的测定能够使用Vi-CELL XR(Beckman Coulter公司)来测定。

通过上述培养而制造的靶蛋白能够进行纯化。靶蛋白的分离及纯化使用在通常的蛋白中使用的分离及纯化方法即可。例如，能够通过适当地选择及组合亲和色谱等色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析、十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦电泳等来分离及纯化靶蛋白，但不限定于这些。上述中所得到的靶蛋白的浓度测定能够通过吸光度测定或酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)等来进行。

作为用于亲和色谱中的柱，可以举出蛋白A柱、蛋白G柱。作为除亲和色谱以外的色谱，例如可以举出离子交换色谱、疏水性色谱、凝胶过滤、反相色谱、吸附色谱等。这些色谱能够使用HPLC(high performance liquid chromatography；高效液相色谱)或FPLC(fastprotein liquid chromatography：快速蛋白液相色谱)等液相色谱来进行。

另外，通过在纯化之前或纯化之后使适当的多肽修饰酶作用于靶蛋白，还能够修饰靶蛋白或者局部地去除肽。作为多肽修饰酶，例如使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶、蛋白激酶、葡萄糖苷酶等。

[靶蛋白的利用]

当通过本发明的方法制造的靶蛋白具有作为药物有用的生物学活性时，能够通过将靶蛋白与药学上可接受的载体或添加剂混合以进行制剂化来制造药物。

作为药学上可接受的载体及添加剂的例子，可以举出水、药学上可接受的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、药学上可接受的表面活性剂等。

例如，当用作注射用制剂时，能够使用将纯化的靶蛋白溶解于溶剂例如生理盐水、缓冲液、葡萄糖溶液等中并向其中加入抗吸附剂例如Tween80、Tween20、明胶、人血清白蛋白等而成的制剂。或者，靶蛋白也可以为了制成使用前溶解重构的剂形而进行冷冻干燥，作为用于冷冻干燥的赋形剂，例如能够使用甘露醇、葡萄糖等糖醇或糖类。

靶蛋白的给药方法可以为口服给药或非口服给药中的任意一种，但优选为非口服给药。例如，可以举出注射(例如，基于静脉内注射、肌内注射、腹腔注射、皮下注射等的全身或局部给药)、经鼻给药、经肺给药或经皮给药等。

靶蛋白的给药量可根据靶蛋白的种类、治疗或作为预防对象的疾病的种类、患者的年龄、疾病的严重程度等适当地选择。一般而言，在每次每1kg体重0.001mg至1000mg的范围内，但不受特别限定。

利用以下实施例对本发明进行进一步具体的说明，但本发明不受实施例的限定。

实施例

＜实施例1＞动物细胞的制作

购买编码人SNAT2基因的载体(OriGene公司、Cat#RC201892)，使用引物1(序列号3)及引物2(序列号4)并通过聚合酶链反应(PCR)来扩增了SNAT2基因的表达盒(启动子、开放阅读框、终止子)。

将扩增的SNAT2表达盒插入于共表达抗体1(Denosumab、https：//www.drugbank.ca/drugs/DB06643)、抗体2(Blosozumab、https：//www.drugbank.ca/drugs/DB12560)或抗体3(抗MUC1抗体、日本特表2016-517691号公报)的各抗体的L链及H链的载体。L链及H链共表达载体的构建及向细胞中的导入根据日本特表2016-517691号公报的实施例2来进行。

导入抗体及SNAT2基因之前的主CHO-DG44细胞全部在37℃、5％CO

通过上述方法，建立了强制表达人SNAT2基因及抗体1或抗体2或抗体3的抗体1-SNAT2细胞、抗体2-SNAT2细胞、抗体3-SNAT2细胞。并且，使用表达抗体L链及H链的载体，以相同的方法实施基因导入，构建了对照组的抗体1细胞、抗体2细胞、抗体3细胞。

引物1:CCGCGGTCATAGCTGTTTCCTGAAC(序列号3)

引物2：CAGCTATGACCGCGGTTAATGGCCACCTCCAGGTGCATTGTGT(序列号4)

＜实施例2＞培养实验

分别使用抗体1-SNAT2细胞、抗体2-SNAT2细胞、抗体3-SNAT2细胞及抗体1细胞、抗体2细胞、抗体3细胞各8个水平实施了补料分批培养实验。

将细胞以5×10

另外，通过以下方法测定了活细胞密度积分(IVCD)。在第0、3、7、10及14天，通过Vi-CELL XR(Beckman Coulter公司)测定活细胞密度(VCD)，将各值设为V0、V3、V7、V10及V14。通过以下式求出活细胞密度积分(IVCD)。

活细胞密度积分(IVCD)＝{(V0+V3)×(3-0)/2}+{(V3+V7)×(7-3)/2}+{(V10+V7)×(10-7)/2}+{(V14+V10)×(14-10)/2}

[表1]

[表2]

[表3]

[表4]

每个细胞的抗体生产率Qp[pg/cell/day]由以下式求出。

[数学式1]

Pti[g/L]＝培养日ti的纯化物的浓度

Xti[cell/day]＝培养日ti的活细胞密度

通过求出时间t1至t2的生长曲线下的面积作为梯形的面积来推算了积分的近似值。

[数学式2]

序 列 表

<110> 富士胶片株式会社

<120> 动物细胞、动物细胞的制造方法及靶蛋白的制造方法

<130> 18F11345W1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1518)

<400> 1

atg aag aag gcc gaa atg gga cga ttc agt att tcc ccg gat gaa gac 48

Met Lys Lys Ala Glu Met Gly Arg Phe Ser Ile Ser Pro Asp Glu Asp

1 5 10 15

agc agc agc tac agt tcc aac agc gac ttc aac tac tcc tac ccc acc 96

Ser Ser Ser Tyr Ser Ser Asn Ser Asp Phe Asn Tyr Ser Tyr Pro Thr

20 25 30

aag caa gct gct ctg aaa agc cat tat gca gat gta gat cct gaa aac 144

Lys Gln Ala Ala Leu Lys Ser His Tyr Ala Asp Val Asp Pro Glu Asn

35 40 45

cag aac ttt tta ctt gaa tcg aat ttg ggg aag aag aag tat gaa aca 192

Gln Asn Phe Leu Leu Glu Ser Asn Leu Gly Lys Lys Lys Tyr Glu Thr

50 55 60

gaa ttt cat cca ggt act act tcc ttt gga atg tca gta ttt aat ctg 240

Glu Phe His Pro Gly Thr Thr Ser Phe Gly Met Ser Val Phe Asn Leu

65 70 75 80

agc aat gcg att gtg ggc agt gga atc ctt ggg ctt tct tat gcc atg 288

Ser Asn Ala Ile Val Gly Ser Gly Ile Leu Gly Leu Ser Tyr Ala Met

85 90 95

gct aat act gga att gct ctt ttt ata att ctc ttg aca ttt gtg tca 336

Ala Asn Thr Gly Ile Ala Leu Phe Ile Ile Leu Leu Thr Phe Val Ser

100 105 110

ata ttt tcc ctg tat tct gtt cat ctc ctt ttg aag act gcc aat gaa 384

Ile Phe Ser Leu Tyr Ser Val His Leu Leu Leu Lys Thr Ala Asn Glu

115 120 125

gga ggg tct tta tta tat gaa caa ttg gga tat aag gca ttt gga tta 432

Gly Gly Ser Leu Leu Tyr Glu Gln Leu Gly Tyr Lys Ala Phe Gly Leu

130 135 140

gtt gga aag ctt gca gca tct gga tca att aca atg cag aac att gga 480

Val Gly Lys Leu Ala Ala Ser Gly Ser Ile Thr Met Gln Asn Ile Gly

145 150 155 160

gct atg tca agc tac ctc ttc ata gtg aaa tat gag ttg cct ttg gtg 528

Ala Met Ser Ser Tyr Leu Phe Ile Val Lys Tyr Glu Leu Pro Leu Val

165 170 175

atc cag gca tta acg aac att gaa gat aaa act gga ttg tgg tat ctg 576

Ile Gln Ala Leu Thr Asn Ile Glu Asp Lys Thr Gly Leu Trp Tyr Leu

180 185 190

aac ggg aac tat ttg gtt ctg ttg gtg tca ttg gtg gtc att ctt cct 624

Asn Gly Asn Tyr Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Val Val Ile Leu Pro

195 200 205

ttg tcg ctg ttt aga aat tta gga tat ttg gga tat acc agt ggc ctt 672

Leu Ser Leu Phe Arg Asn Leu Gly Tyr Leu Gly Tyr Thr Ser Gly Leu

210 215 220

tcc ttg ttg tgt atg gtg ttc ttt ctg att gtg gtc att tgc aag aaa 720

Ser Leu Leu Cys Met Val Phe Phe Leu Ile Val Val Ile Cys Lys Lys

225 230 235 240

ttt cag gtt ccg tgt cct gtg gaa gct gct ttg ata att aac gaa aca 768

Phe Gln Val Pro Cys Pro Val Glu Ala Ala Leu Ile Ile Asn Glu Thr

245 250 255

ata aac acc acc tta aca cag cca aca gct ctt gta cct gct ttg tca 816

Ile Asn Thr Thr Leu Thr Gln Pro Thr Ala Leu Val Pro Ala Leu Ser

260 265 270

cat aac gtg act gaa aat gac tct tgc aga cct cac tat ttt att ttc 864

His Asn Val Thr Glu Asn Asp Ser Cys Arg Pro His Tyr Phe Ile Phe

275 280 285

aac tca cag act gtc tat gct gtg cca att ctg atc ttt tca ttt gtc 912

Asn Ser Gln Thr Val Tyr Ala Val Pro Ile Leu Ile Phe Ser Phe Val

290 295 300

tgt cat cct gct gtt ctt ccc atc tat gaa gaa ctg aaa gac cgc agc 960

Cys His Pro Ala Val Leu Pro Ile Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Arg Ser

305 310 315 320

cgt aga aga atg atg aat gtg tcc aag att tca ttt ttt gct atg ttt 1008

Arg Arg Arg Met Met Asn Val Ser Lys Ile Ser Phe Phe Ala Met Phe

325 330 335

ctc atg tat ctg ctt gcc gcc ctc ttt gga tac cta aca ttt tac gaa 1056

Leu Met Tyr Leu Leu Ala Ala Leu Phe Gly Tyr Leu Thr Phe Tyr Glu

340 345 350

cat gtt gag tca gaa ttg ctt cat acc tac tct tct atc ttg gga act 1104

His Val Glu Ser Glu Leu Leu His Thr Tyr Ser Ser Ile Leu Gly Thr

355 360 365

gat att ctt ctt ctc att gtc cgt ctg gct gtg tta atg gct gtg acc 1152

Asp Ile Leu Leu Leu Ile Val Arg Leu Ala Val Leu Met Ala Val Thr

370 375 380

ctg aca gta cca gta gtt att ttc cca atc cgg agt tct gta act cac 1200

Leu Thr Val Pro Val Val Ile Phe Pro Ile Arg Ser Ser Val Thr His

385 390 395 400

ttg ttg tgt gca tca aaa gat ttc agt tgg tgg cgt cat agt ctc att 1248

Leu Leu Cys Ala Ser Lys Asp Phe Ser Trp Trp Arg His Ser Leu Ile

405 410 415

aca gtg tct atc ttg gca ttt acc aat tta ctt gtc atc ttt gtc cca 1296

Thr Val Ser Ile Leu Ala Phe Thr Asn Leu Leu Val Ile Phe Val Pro

420 425 430

act att agg gat atc ttt ggt ttt att ggt gca tct gca gct tct atg 1344

Thr Ile Arg Asp Ile Phe Gly Phe Ile Gly Ala Ser Ala Ala Ser Met

435 440 445

ttg att ttt att ctt cct tct gcc ttc tat atc aag ttg gtg aag aaa 1392

Leu Ile Phe Ile Leu Pro Ser Ala Phe Tyr Ile Lys Leu Val Lys Lys

450 455 460

gaa cct atg aaa tct gta caa aag att ggg gct ttg ttc ttc ctg tta 1440

Glu Pro Met Lys Ser Val Gln Lys Ile Gly Ala Leu Phe Phe Leu Leu

465 470 475 480

agt ggt gta ctg gtg atg acc gga agc atg gcc ttg att gtt ttg gat 1488

Ser Gly Val Leu Val Met Thr Gly Ser Met Ala Leu Ile Val Leu Asp

485 490 495

tgg gta cac aat gca cct gga ggt ggc cat 1518

Trp Val His Asn Ala Pro Gly Gly Gly His

500 505

<210> 2

<211> 506

<212> PRT

<213> 人

<400> 2

Met Lys Lys Ala Glu Met Gly Arg Phe Ser Ile Ser Pro Asp Glu Asp

1 5 10 15

Ser Ser Ser Tyr Ser Ser Asn Ser Asp Phe Asn Tyr Ser Tyr Pro Thr

20 25 30

Lys Gln Ala Ala Leu Lys Ser His Tyr Ala Asp Val Asp Pro Glu Asn

35 40 45

Gln Asn Phe Leu Leu Glu Ser Asn Leu Gly Lys Lys Lys Tyr Glu Thr

50 55 60

Glu Phe His Pro Gly Thr Thr Ser Phe Gly Met Ser Val Phe Asn Leu

65 70 75 80

Ser Asn Ala Ile Val Gly Ser Gly Ile Leu Gly Leu Ser Tyr Ala Met

85 90 95

Ala Asn Thr Gly Ile Ala Leu Phe Ile Ile Leu Leu Thr Phe Val Ser

100 105 110

Ile Phe Ser Leu Tyr Ser Val His Leu Leu Leu Lys Thr Ala Asn Glu

115 120 125

Gly Gly Ser Leu Leu Tyr Glu Gln Leu Gly Tyr Lys Ala Phe Gly Leu

130 135 140

Val Gly Lys Leu Ala Ala Ser Gly Ser Ile Thr Met Gln Asn Ile Gly

145 150 155 160

Ala Met Ser Ser Tyr Leu Phe Ile Val Lys Tyr Glu Leu Pro Leu Val

165 170 175

Ile Gln Ala Leu Thr Asn Ile Glu Asp Lys Thr Gly Leu Trp Tyr Leu

180 185 190

Asn Gly Asn Tyr Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Val Val Ile Leu Pro

195 200 205

Leu Ser Leu Phe Arg Asn Leu Gly Tyr Leu Gly Tyr Thr Ser Gly Leu

210 215 220

Ser Leu Leu Cys Met Val Phe Phe Leu Ile Val Val Ile Cys Lys Lys

225 230 235 240

Phe Gln Val Pro Cys Pro Val Glu Ala Ala Leu Ile Ile Asn Glu Thr

245 250 255

Ile Asn Thr Thr Leu Thr Gln Pro Thr Ala Leu Val Pro Ala Leu Ser

260 265 270

His Asn Val Thr Glu Asn Asp Ser Cys Arg Pro His Tyr Phe Ile Phe

275 280 285

Asn Ser Gln Thr Val Tyr Ala Val Pro Ile Leu Ile Phe Ser Phe Val

290 295 300

Cys His Pro Ala Val Leu Pro Ile Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Arg Ser

305 310 315 320

Arg Arg Arg Met Met Asn Val Ser Lys Ile Ser Phe Phe Ala Met Phe

325 330 335

Leu Met Tyr Leu Leu Ala Ala Leu Phe Gly Tyr Leu Thr Phe Tyr Glu

340 345 350

His Val Glu Ser Glu Leu Leu His Thr Tyr Ser Ser Ile Leu Gly Thr

355 360 365

Asp Ile Leu Leu Leu Ile Val Arg Leu Ala Val Leu Met Ala Val Thr

370 375 380

Leu Thr Val Pro Val Val Ile Phe Pro Ile Arg Ser Ser Val Thr His

385 390 395 400

Leu Leu Cys Ala Ser Lys Asp Phe Ser Trp Trp Arg His Ser Leu Ile

405 410 415

Thr Val Ser Ile Leu Ala Phe Thr Asn Leu Leu Val Ile Phe Val Pro

420 425 430

Thr Ile Arg Asp Ile Phe Gly Phe Ile Gly Ala Ser Ala Ala Ser Met

435 440 445

Leu Ile Phe Ile Leu Pro Ser Ala Phe Tyr Ile Lys Leu Val Lys Lys

450 455 460

Glu Pro Met Lys Ser Val Gln Lys Ile Gly Ala Leu Phe Phe Leu Leu

465 470 475 480

Ser Gly Val Leu Val Met Thr Gly Ser Met Ala Leu Ile Val Leu Asp

485 490 495

Trp Val His Asn Ala Pro Gly Gly Gly His

500 505

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 引物

<400> 3

ccgcggtcat agctgtttcc tgaac 25

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 引物

<400> 4

cagctatgac cgcggttaat ggccacctcc aggtgcattg tgt 43