一种基于光纤传感器的食源性致病菌检测方法

技术领域

本发明属于致病菌检测技术领域，涉及食源性致病菌检测方法，具体涉及一种基于光纤传感器的食源性致病菌检测方法。

背景技术

目前食源性致病菌检测技术领域中，采用生物发光发或化学发光法等生物分析技术进行检测，其中生物发光法的原理是在荧光素酶的催化作用下，细菌释放的三磷酸腺苷(ATP)与D-荧光素及分子氧(O

发明内容

为了解决上述存在的技术问题，本发明提供一种基于光纤传感器的食源性致病菌检测方法，采用双发光法即结合生物发光及化学发光的总发光强度定量分析致病菌，提高检测范围，灵敏高，实现食源性致病菌的现场快速检测。

本发明所采取的技术方案是：

一种基于光纤传感器的食源性致病菌检测方法，具体包括如下步骤：

S1、通过物理吸附法向空心套管表面修饰噬菌体；

S2、将光纤传感器嵌入表面修饰有噬菌体的空心套管中；

S3、将光纤传感器套有空心套管的嵌入端放置于待测致病菌和噬菌体-HRP混合液中孵育，空心套管的外壁形成噬菌体-致病菌-噬菌体-HRP复合物；

S4、洗涤空心套管的外壁除去非特异性吸附的杂质，以降低干扰；

S5、将经步骤S4处理后的所述光纤传感器的嵌入端放置于PBS缓冲液中由噬菌体进行菌体裂解，菌体裂解释放出ATP；

S7、向上述PBS缓冲液中分别加入生物发光底物和化学发光底物：菌体裂解释放的ATP将诱导生物发光底物产生生物发光信号,空心套管的外壁附着的HRP将诱导化学发光底物产生化学发光信号，利用光子计数器检测并记录生物发光信号和化学发光信号的总强度，然后对待测致病菌进行定量分析。

进一步地，所述步骤S1中的噬菌体通过分离及筛选可得，具体包括如下步骤：

1)将10mL采集的湖水样本用0.22μm滤膜过滤；

2)在恒温37℃的摇床中，将分离的靶菌使用TSB液体培养基进行过夜复苏培养；

3)将10mL滤液与40mL过夜培养的靶菌液加入至10mLTSB液体培养基中，静置30min后，在37℃恒温培养箱中静置培养24h；

4)将培养液在4℃下10000rpm离心30min，取上清液用0.22μm滤膜过滤，制成噬菌体原液，重复该操作3次以富集样品中可能存在的噬菌体；

5)采用点样法测试噬菌体：将100μL对数期的菌均匀涂布在单层平板上，取10μL噬菌体原液进行点样，将单层培养基在37℃恒温培养箱中静置培养12h，若有明显空斑，则证明有噬菌体存在；

6)在双层平板中挑取相对独立的噬菌斑，接种于1mLTSB培养基中，37℃下培养8h；

7)将混合液在10000rpm下离心30min，并取上清液用0.22μm滤膜过滤，利用双层平板法测定得到的噬菌体的效价约为3×10

进一步地，所述步骤S3中的噬菌体-HRP可通过生物素化噬菌体、生物素化HRP及链霉亲和素反应制备，具体包括如下步骤：

1)将分离纯化的噬菌体用NaHCO

2)将噬菌体溶液和生物素溶液按照1:10的比例混合，室温下混匀孵育60min，随后将前述的混合溶液使用PBS缓冲液进行透析24h；

3)将上述生物素化的噬菌体和10μg/mL的生物素化HRP等体积混合，同时加入2μg/mL的链霉亲和素，室温下混匀孵育30min，并放置于-20℃保存备用；

4)利用双层平板法测定得到的噬菌体-HRP的效价约为8×10

进一步地，所述步骤S1中的物理吸附时间为15-60min。

进一步地，所述空心套管材质为聚苯乙烯或聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酸甲酯或聚二甲基硅氧烷或聚对苯二甲酸乙二醇酯。

进一步地，所述步骤S5中的菌体裂解时间为5-30min,裂解温度为37℃。

进一步地，所述光纤传感器长度为5-50cm，其纤芯直径为0.3-5mm。

进一步地，所述空心套管的长度设置为5-30mm，内径为0.3-5mm，外径为3-8mm。

进一步地，所述生物发光底物为荧光素酶或D-荧光素或Mg

进一步地，所述荧光素酶的浓度为10μg/mL，所述D-荧光素浓度为20μg/mL,所述Mg

本发明的有益效果是：

1)采用生物发光底物和化学发光底物的双发光检测，在不增加实验复杂性的前提下，可以有效地进行信号放大，提高检测灵敏度,降低检测下限；

2)空心套管采用聚合物，修饰方便快速，成本极低，可批量生产；

3)光纤传感器与空心套管的嵌入式设置，保证发光信号的高效收集，且空心套管即用即抛，更换方便；

4)操作简单、分析速度快，本发明所涉及的致病菌捕获、菌体裂解、发光检测过程可在30min内完成，且不涉及繁复的样品前处理。

附图说明

图1是本发明一种基于光纤传感器的食源性致病菌检测方法的流程示意图；

图2是本发明一种基于光纤传感器的食源性致病菌检测方法的工作原理图；

图3是本发明中实施例2的单增李斯特菌噬菌体效价的优化图。

图4是本发明中实施例2的单增李斯特菌噬菌体修饰空心PS套管的物理吸附时间的优化图；

图5是本发明中实施例2的单增李斯特菌噬菌体-HRP效价的优化图；

图6是本发明中实施例2的单增李斯特菌菌体裂解时间的优化图；

图7是本发明中实施例2的生物及化学双发光检测单增李斯特菌的标准曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

需要说明的是，在本发明的描述中，需要说明的是，如出现术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

实施例1

如图1至图2、图7所示，一种基于光纤传感器的食源性致病菌检测方法，具体包括如下步骤：

S1、通过物理吸附法向空心套管表面修饰噬菌体；

其中，噬菌体通过分离及筛选可得，具体包括如下步骤：

1)将10mL采集的湖水样本用0.22μm滤膜过滤；

2)在恒温37℃的摇床中，将分离的靶菌使用TSB液体培养基进行过夜复苏培养；

3)将10mL滤液与40mL过夜培养的靶菌液加入至10mLTSB液体培养基中，静置30min后，在37℃恒温培养箱中静置培养24h；

4)将培养液在4℃下10000rpm离心30min，取上清液用0.22μm滤膜过滤，制成噬菌体原液，重复该操作3次以富集样品中可能存在的噬菌体；

5)采用点样法测试噬菌体：将100μL对数期的菌均匀涂布在单层平板上，取10μL噬菌体原液进行点样，将单层培养基在37℃恒温培养箱中静置培养12h，若有明显空斑，则证明有噬菌体存在；

6)在双层平板中挑取相对独立的噬菌斑，接种于1mLTSB培养基中，37℃下培养8h；

7)将混合液在10000rpm下离心30min，并取上清液用0.22μm滤膜过滤，利用双层平板法测定得到的噬菌体的效价约为3×10

S2、将光纤传感器嵌入表面修饰有噬菌体的空心套管中；

S3、将光纤传感器套有空心套管的嵌入端放置于待测致病菌和噬菌体-HRP混合液中孵育，空心套管的外壁形成噬菌体-致病菌-噬菌体-HRP复合物；

其中，噬菌体-HRP可通过生物素化噬菌体、生物素化HRP及链霉亲和素反应制备，具体包括如下步骤：

1)将分离纯化的噬菌体用NaHCO

2)将噬菌体溶液和生物素溶液按照1:10的比例混合，室温下混匀孵育60min，随后将前述的混合溶液使用PBS缓冲液进行透析24h；

3)将上述生物素化的噬菌体和10μg/mL的生物素化HRP等体积混合，同时加入2μg/mL的链霉亲和素，室温下混匀孵育30min，并放置于-20℃保存备用；

4)利用双层平板法测定得到的噬菌体-HRP的效价约为8×10

S4、洗涤空心套管的外壁除去非特异性吸附的杂质，以降低干扰；

S5、将经步骤S4处理后的所述光纤传感器的嵌入端放置于PBS缓冲液中由噬菌体进行菌体裂解，菌体裂解释放出ATP；

S7、向上述PBS缓冲液中分别加入生物发光底物和化学发光底物：菌体裂解释放的ATP将诱导生物发光底物产生生物发光信号,空心套管的外壁附着的HRP将诱导化学发光底物产生化学发光信号，利用光子计数器检测并记录生物发光信号和化学发光信号的总强度，然后对待测致病菌进行定量分析。

本实施例的进一步，所述步骤S1中的物理吸附时间为15-60min。

本实施例的进一步，所述空心套管材质为聚苯乙烯(PS)或聚丙烯酰胺(PAM)或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚二甲基硅氧烷(PDMS)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)。

本实施例的进一步，所述步骤S5中的菌体裂解时间为5-30min,裂解温度为37℃

本实施例的进一步，所述光纤传感器长度为5-50cm，其纤芯直径为0.3-5mm。

本实施例的进一步，所述空心套管的长度设置为5-30mm，内径为0.3-5mm，外径为3-8mm。

本实施例的进一步，所述生物发光底物为荧光素酶或D-荧光素或Mg

本实施例的进一步，所述荧光素酶的浓度为10μg/mL，所述D-荧光素浓度为20μg/mL,所述Mg

实施例2

在实施例1的基础上对猪肉中的单增李斯特菌进行检测和验证准确度和精密度。

如图1至图2、图7所示，一种基于光纤传感器的食源性致病菌检测方法，具体包括如下步骤：

在检测前分别分析出单增李斯特菌噬菌体效价、物理吸附时间、噬菌体-HRP效价、单增李斯特菌菌体裂解时间的最佳条件，具体如下：

如图3至图6所示，单增李斯特菌噬菌体的最佳效价为10

S2、建立单增李斯特菌标准曲线，具体如下：

1)通过物理吸附法向材质为PS的空心套管的外壁修饰单增李斯特菌对应的噬菌体，并采用牛血清蛋白(BSA)加以封闭：将空心套管置于浓度为10

2)将光纤传感器嵌入上述空心套管，将其嵌入端置于不同浓度的单增李斯特菌与10

3)洗涤空心套管的外壁除去非特异性吸附的杂质；

4)将上述光纤传感器嵌入端置于PBS缓冲液中37℃孵育15min，进行菌体裂解；

5)向上述PBS缓冲液中分别加入10μg/mL的荧光素酶、20μg/mL的荧光素、20μg/mL的Mg

6)利用光子计数器检测生物发光信号和化学发光信号的总强度，然后对待测致病菌进行定量分析：以单增李斯特菌浓度的对数值为横坐标，以生物发光信号及化学发光信号的总发光强度为纵坐标，作出标准曲线。

如图7所示，对于单一的生物发光，其线性范围为10

从上述结果可以得出，本发明的检测方法采用生物/化学双发光总强度运用于食源性致病菌的现场快速检测具有更宽的线性范围，使得其检测下限较单一发光法降低1个数量级，灵敏度也提高了1.6-1.8倍。

本实施例中检测猪肉中的单增李斯特菌进行标准浓度添加测试以验证本发明的检测方法的准确性和精密性，具体包括如下步骤：

1)对单增李斯特菌进行平板计数，得出菌液的浓度。

2)取1g猪肉样品使用绞肉机制成肉糜，将1mL浓度为0、1000、10000、100000cfu/mL单增李斯特菌菌液与肉糜混合，并使用等体积的无菌生理盐水重悬混合液，涡旋2min后过滤，滤液即可作为待测样品直接进行测试；

3)将滤液和2×10

4)将上述光纤传感器嵌入端置于PBS中37℃孵育15min，进行菌体裂解；

5)向上述PBS缓冲液中分别加入10μg/mL的荧光素酶、20μg/mL的荧光素、20μg/mL的Mg

如表1所示，描述的是猪肉样品中单增李斯特菌的检测结果。采用本发明对猪肉中单增李斯特菌进行检测，其回收率均在80.31％～128.54％范围内，相对标准偏差均低于10.36％，表明该方法对于猪肉中致病菌的检测具有极高的准确度和精密度。

表1猪肉样品中单增李斯特菌的检测结果

本实施例的工作原理：菌体裂解将释放出ATP，释放量与单增李斯特菌菌体数量呈正相关；同时HRP的量也与单增李斯特菌菌体数量呈正相关。将生物发光底物和化学发光底物加入到上述缓冲体系中。ATP将诱导产生生物发光信号，HRP将诱导产生化学发光信号。二者的强度均与单增李斯特菌菌体数量呈正相关。通过光子计数器检测生物/化学双发光信号的总强度，即可对单增李斯特菌进行定量分析。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明原理和实质的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。