作为衰老相关认知障碍的治疗的血浆级分

本申请是申请日为2017年4月27日申请号为201780057412.0发明名称为“作为衰老相关认知障碍的治疗的血浆级分”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及衰老相关疾病的预防和治疗。本发明涉及血液制品诸如血浆级分用于治疗和/或预防衰老相关病状，诸如神经认知障碍和神经退行性病症的用途。

背景技术

以下仅作为背景信息提供，并不承认是本发明的现有技术。

衰老是多种人类疾病的重要风险因素，包括认知受损、癌症、关节炎、视觉丧失、骨质疏松症、糖尿病、心血管疾病和中风。除自然衰老期间正常的突触损失外，突触损失是许多神经退行性病状常见的早期病理事件，并且与这些病状相关的神经元和认知受损有最佳关联。因此，对于痴呆相关神经退行性疾病诸如阿尔茨海默病(AD)而言衰老仍然是最主要的单一风险因素(Bishop,N.A.等人，Neural mechanisms of ageing and cognitivedecline.Nature 464(7288),529-535(2010)；Heeden,T.等人，Insights into the ageingmind:a view fromcognitive neuroscience.Nat.Rev.Neurosci.5(2),87-96(2004)；Mattson,M.P.,等人，Ageing and neuronal vulnerability.Nat.Rev.Neurosci.7(4),278-294(2006))。衰老会影响身体的所有组织和功能，包括中枢神经系统，并且认知等功能的衰退可以严重影响生活质量。对认知衰退和神经退行性病症的治疗在预防和逆转损害方面取得了有限的成功。因此，重要的是通过防御、抵抗或逆转衰老的影响来确定维持认知完整性的新型治疗。

发明内容

本发明基于血液制品的生产和使用，所述血液制品用于治疗和/或预防年龄相关性病症，诸如认知受损病状、年龄相关性痴呆和神经退行性疾病。除其它以外，本发明认识到需要用于治疗和/或预防认知受损、年龄相关性痴呆和神经退行性疾病的新疗法。本发明的组合物，源自血液和血浆，涉及通过利用在治疗和/或预防认知受损、年龄相关性痴呆和神经退行性疾病中表现出功效的血浆级分来解决当前疗法的失败和缺点的解决方案。另外，本发明涉及在血浆级分中鉴定的蛋白质，其本身可以表现出作为认知受损和年龄相关性痴呆的治疗或预防剂的功效，或是其它药剂抑制的靶标。

本发明还认识到不同血浆级分(例如级分、流出物、“血浆级分”、血浆蛋白质级分、人白蛋白溶液)之间蛋白质含量的差异可负责预防和/或改善某些认知受损和减轻神经退行性疾病。作为实例而非限制，本发明的实施方案证明仅仅是人白蛋白溶液(HAS)制剂较高的白蛋白浓度不是与白蛋白浓度较低的血浆蛋白质级分(PPF)制剂相关的认知改善的驱动力。

来自年轻供体的血液和血浆已经表现出预先存在的脑衰老作用的改善和逆转，包括在分子、结构、功能和认知水平上。(Saul A.Villeda等人，Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity inmice.Nature Medicine 20 659-663(2014))。本发明涉及血浆级分和流出物，其中一些传统上用于治疗患者休克，并且发现它们作为治疗衰老相关认知受损的方法是有效的。

然后，根据本发明的方面，提供了使用血液制品血浆级分治疗衰老相关认知受损、年龄相关性痴呆和/或神经退行性疾病的方法。该方法的各方面包括向患有衰老相关认知受损或神经退行性疾病或有发展衰老相关认知受损或神经退行性疾病风险的个体施用血浆级分。该方法的其它方面包括向患有衰老相关认知受损或有发展衰老相关认知受损风险的个体施用源自一群特定年龄范围的供体的血浆级分。还提供了可用于实践本发明方法的试剂、装置和试剂盒。

在一个实施方案中，血浆级分可以是，例如，从血液分级分离过程诸如下述Cohn分级分离过程获得的几种血浆级分之一。在另一个实施方案中，血浆级分可以是本文称为“血浆级分”的类型，其是由正常人白蛋白、α和β球蛋白、γ球蛋白和其它蛋白质单独或作为复合物组成的溶液。在另一个实施方案中，血浆级分可以是本领域技术人员称为“血浆蛋白质级分”(PPF)的血浆级分类型。在另一个实施方案中，血浆级分可以是“人白蛋白溶液”(HAS)级分。在另一个实施方案中，血浆级分可以是其中基本上所有凝血因子都被去除以便保持级分功效并降低血栓形成风险的血浆级分。本发明的实施方案还可包括施用例如源自一群年轻供体或多群幼龄供体的级分。本发明的另一个实施方案可以包括监测用血浆级分治疗的受试者的认知改善。

通过引用并入

本说明书中提到的所有公开案和专利申请案均通过引用并入本文，其程度如同特别且单独地指出将每个单独的公开案或专利申请通过引用并入一样。

附图说明

附图说明了本发明的实施方案，并且与说明书一起用于解释本发明。这些附图是以说明而非限制的方式提供的：要强调的是附图的各种特征可能不是按比例的。

图1.图1显示了对照、PPF1或HAS1处理的3月龄或13月龄NSG小鼠的饲养时间，所述NSG小鼠置于旷场腔室中15分钟。

图2.图2显示了对照、PPF1或HAS1处理的3月龄或13月龄NSG小鼠的运动速度，所述NSG小鼠置于旷场腔室中15分钟。

图3.图3显示了对照、PPF1或HAS1处理的3月龄或13月龄NSG小鼠的运动行进距离，所述NSG小鼠置于旷场腔室中15分钟。

图4.图4显示了在暗示性Y型迷宫测试中用对照、PPF1或HAS1处理的3月龄或13月龄NSG小鼠在新臂中花费的时间。

图5.图5显示了在暗示性Y型迷宫的新臂与熟悉臂中3月龄或13月龄NSG小鼠花费的时间比率(新臂:熟悉臂的比率)，小鼠已经用对照、PPF1或HAS1进行处理。

图6.图6显示了在暗示性Y型迷宫中对照、PPF1或HAS1处理的3月龄或13月龄NSG小鼠的运动速度。

图7.图7显示了在暗示性Y型迷宫中3月龄或13月龄NSG小鼠的运动行进距离，小鼠已经用对照、PPF1或HAS1进行处理。

图8A.图8A显示了用对照、PPF1或HAS1处理的3月龄或13月龄NSG小鼠在情境条件性恐惧记忆测试(contextual fear conditioning test for memory)中僵直(freezing)时间的百分比。

图8B.图8B显示了用对照、PPF1或HAS1处理的3月龄或13月龄NSG小鼠在听觉暗示条件性恐惧记忆测试(auditory cued fear conditioning test for memory)中僵直时间的百分比。

图9.图9量化了用对照、PPF1或HAS1处理的3月龄或13月龄NSG小鼠在暗示条件性恐惧记忆测试的最后90秒期间僵直时间的百分比。

图10A.图10A绘制了空间记忆测试的巴恩斯迷宫(Barnes maze)潜伏期。报道了用对照、PPF1或HAS1处理的3月龄或13月龄NSG小鼠到达目标孔洞的潜伏期。

图10B.图10B量化了图10A中描绘的最后3次试验的平均值。

图11A.图11A量化了双皮质素(Doublecortin,Dcx)阳性染色细胞的数量，双皮质素(Dcx)是用对照、PPF1或HAS1每周两次处理长达6个月的3月龄或13月龄NSG小鼠的齿状回中新生神经元的标志物。

图11B.图11B量化了用对照、PPF1或HAS1每周两次处理长达6个月的3月龄或13月龄NSG小鼠的齿状回中，Ki67阳性染色细胞的数量，Ki67是增殖细胞的标志物。

图12.图12量化了用对照、PPF1、1X浓缩HAS1或5X浓缩HAS1每周三次处理五周的13月龄NSG小鼠中Dcx阳性染色细胞的数量。

图13.图13量化了用对照、PPF1、1X浓缩HAS1或5X浓缩HAS1每周三次处理五周的13月龄NSG小鼠中Ki67阳性染色细胞的数量。

图14A.图14A显示了从6月龄开始每周两次经尾静脉注射盐水(对照)或PPF1处理的NODscid小鼠在旷场腔室中的饲养次数。一旦将小鼠置于旷场腔室中，就对饲养进行测量，时间跨度为15分钟。

图14B.图14B报告了从6月龄开始每周两次经尾静脉注射盐水(对照)或PPF1处理的小鼠在旷场腔室中的运动速度。一旦将小鼠置于旷场腔室中，就对速度进行测量，时间跨度为15分钟。

图14C.图14C报告了从6月龄开始每周两次经尾静脉注射盐水(对照)或PPF1处理的小鼠在旷场腔室中的行进距离。一旦将小鼠置于旷场腔室中，就对速度进行测量，时间跨度为15分钟。

图15.图15描绘了巴恩斯迷宫潜伏期和海马依赖性空间学习和记忆。报告了用150μL盐水对照、幼龄血浆、流出物I或流出物II/III处理的老龄NSG小鼠(12月龄)到达目标孔洞的潜伏期。

图16.图16报告了幼龄人血浆、PPF1和盐水对照对雄性老龄NSG小鼠(12月龄)的海马依赖性空间学习和记忆的影响。小鼠用150μL澄清的幼龄人血浆(幼龄血浆)、PPF1或盐水处理，每周三次(i.v.)，持续4周，然后在第5周和第6周每周处理两次，第5周和第6周是进行测试的几周。报告了每个治疗组到达巴恩斯迷宫孔洞的潜伏期。

图17.图17报告了幼龄人血浆、PPF1和盐水对照对每天测试的最后三次试验中找到巴恩斯迷宫目标孔洞的平均潜伏期的影响。老龄NSG小鼠(12月龄)用150μL澄清的幼龄人血浆(幼龄血浆)、PPF1或盐水每周三次(i.v.)处理4周，随后在第5周和第6周每周处理两次，第5周和第6周是进行测试的几周。

图18.图18报告了通过BrdU检测确定的幼龄人血浆、PPF1和盐水对照对细胞存活的影响。老龄NSG小鼠(12月龄)用150μL澄清的幼龄人血浆(幼龄血浆)、PPF1或盐水每周三次(i.v.)处理4周，随后在第5周和第6周每周处理两次，第5周和第6周是进行行为测试的几周。处死后分析海马切片。

图19.图19显示了对照、PPF1和HAS1对皮质培养物中的神经球增殖的影响。该图显示了体外21天后来自皮质培养物的神经球的示例图像，其对Tuj1、DAPI或Tuj1和DAPI成像。

图20.图20显示了对照、PPF1和HAS1对皮质培养物中净神经突长度的影响。

图21.图21显示媒介物、PPF1和HAS1对皮质培养物中球体和过程生长的影响。黄色阴影突出显示球体，粉色阴影突出显示通过IncuCyte软件算法(Essen BioScience,Inc.,Ann Arbor,MI)确定的神经突。

图22A.图22A显示了来自E14-15小鼠胚胎的皮质的神经球数量占媒介物百分比的量化，所述小鼠胚胎悬浮在补充有B27和2mM Glutamax(媒介物)、PPF1(10％的5％原液)或HAS1(10％的5％原液)的神经基础培养基中。

图22B.图22B显示了来自E14-15小鼠胚胎的皮质的神经突长度占媒介物百分比的量化，所述小鼠胚胎悬浮在补充有B27和2mM Glutamax(媒介物)、PPF1(10％的5％原液)或HAS1(10％的5％原液)的神经基础培养基中。

图22C.图22C显示了来自E14-15小鼠胚胎的皮质的神经突分支点占媒介物百分比的量化，所述小鼠胚胎悬浮在补充有B27和2mM Glutamax(媒介物)、PPF1(10％的5％原液)或HAS1(10％的5％原液)的神经基础培养基中。

图22D.图22D显示了来自E14-15小鼠胚胎的皮质的神经球大小占媒介物百分比的量化，所述小鼠胚胎悬浮在补充有B27和2mM Glutamax(媒介物)、PPF1(10％的5％原液)或HAS1(10％的5％原液)的神经基础培养基中。

图23.图23显示了用对照媒介物(补充有B27和2mM Glutamax的神经基础培养基)、PPF1(10％的5％原液)或HAS1(10％的5％原液)处理的Sox2染色阳性的神经球数量的量化。Sox2染色是神经球神经发生潜力的指标。

具体实施方式

1.介绍

本发明涉及用于治疗和/或预防认知受损的方法和组合物的鉴定和发现，所述认知受损包括年龄相关性痴呆和神经退行性疾病。本文描述了用于治疗患有此类病症的受试者的方法和组合物，其是本发明的方面。本文所述的方法和组合物可用于：预防认知受损、年龄相关性痴呆和神经退行性疾病；改善认知受损、年龄相关性痴呆和神经退行性疾病的症状；减缓衰老相关认知受损、年龄相关性痴呆和神经退行性疾病的进展；和/或逆转衰老相关认知受损、年龄相关性痴呆和神经退行性疾病的进展。本发明的实施方式包括使用血浆级分，诸如从血液分级分离过程，例如，如下所述的Cohn分级分离过程获得的一种或多种级分或流出物作为治疗。本发明的一个实施方案包括使用血浆级分(由正常人白蛋白、α和β球蛋白、γ球蛋白和其它蛋白质单独或作为复合物组成的溶液，下文称为“血浆级分”)。本发明的另一个实施方案包括使用血浆蛋白质级分(PPF)作为治疗。本发明的另一个实施方案包括使用人白蛋白溶液(HAS)级分作为治疗。又一个实施方案包括使用来自血液分级分离过程的流出物，例如下文描述的流出物I或流出物II/III。另外的实施方案包括从中去除了基本上所有的凝血因子以保持功效同时降低血栓形成风险的血浆级分(例如，参见美国专利申请第62/236,710号，其通过引用整体并入本文)。

在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的特定方法或组合物，因此当然可以改变。还应理解，本文所用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而非旨在为限制性，因为本发明的范围将仅受所附权利要求限定。

本文讨论的出版物仅仅是为了它们在本申请的提交日期之前的公开而提供的。本文的任何内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于此类出版物。此外，提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要独立确认。

在提供值的范围时，应当理解，除非上下文另外明确指出，否则还明确公开了介于该范围上限与下限之间的每个居间值(至下限单位的十分之一)。介于规定范围内的任何规定值或居间值与规定范围内的任何其它规定值或居间值之间的每个较小范围均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除，并且在任一个限值、两个限值都不或两个限值都包括在较小范围内的情况下，每个范围也涵盖在本发明内，以规定范围内任何特别排除的限值为依据。当规定范围包括一个或两个限值时，排除了那些所包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。

注意，可以起草权利要求以排除任何任选要素。同样，该声明旨在作为与权利要求要素的叙述一起使用此类排他性术语如“只”、“仅”等，或使用“否定性”限制的前置基础。

正如对于本领域技术人员而言在阅读本公开后将显而易见的，本文描述和说明的每个单独实施方案具有分立组分和特征，其在不脱离本发明的范围或精神的前提下，可以容易地与任何其它几个实施方案的特征分离或组合。列举的任何方法均可按照列举事件的顺序或按逻辑上可能的任何其它顺序进行。

2.定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料也可用于本发明的实践或试验，但现在描述的是一些潜在和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与所引用的出版物有关的方法和/或材料。应理解，在存在矛盾的方面来说，本公开取代所并入的出版物的任何公开内容。

必须注意，如本文和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一种(个)”和“所述(该)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞，并且提及“该肽”包括提及一种或多种肽及其等同物，例如本领域技术人员已知的多肽，等等。

在描述本发明的方法时，术语“宿主”、“受试者”、“个体”和“患者”可互换使用，并且是指根据所公开的方法需要此类治疗的任何哺乳动物。此类哺乳动物包括例如人、绵羊、牛、马、猪、犬、猫、非人灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，受试者是非人哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是农场动物。在其它实施方案中，受试者是宠物。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在某些情况下，受试者是人。其它受试者可以包括家养宠物(例如，狗和猫)、家畜(例如，牛、猪、山羊、马等)、啮齿动物(例如，小鼠、豚鼠和大鼠，例如，如在动物疾病模型中)，以及非人灵长类动物(例如，黑猩猩和猴子)。因此，本发明的受试者包括但不限于哺乳动物，例如人和其它灵长类动物，例如黑猩猩和其它猿和猴物种；等等，其中在某些实施方案中，受试者是人。术语受试者还意在包括任何年龄、体重或其它身体特征的人或生物，其中受试者可以是成人、儿童、婴儿或新生儿。

“幼龄”或“幼龄个体”意指日历年龄为40岁或更小的个体，例如35岁或更小，包括30岁或更小，例如25岁或更小或22岁或更小。在一些情况下，用作含有幼龄血浆的血液制品的来源的个体是10岁或更小，例如5岁或更小，包括1岁或更小的人。在一些情况下，受试者是新生儿，血浆制品的来源是脐带，其中血浆制品是从新生儿的脐带收获的。因此，“幼龄”和“幼龄个体”可以指年龄在0到40岁之间的受试者，例如0、1、5、10、15、20、25、30、35或40岁。在其它情况下，“幼龄”和“幼龄个体”可以指生物学年龄(与日历年龄相对)，诸如未表现出相对老龄个体中所表现出的血浆炎性细胞因子水平的个体。相反，这些“幼龄”和“幼龄个体”可以指生物学年龄(与日历年龄相对)，例如表现出比相对老龄个体中的水平更高的血浆抗炎细胞因子水平的个体。作为实例而非限制，炎性细胞因子是嗜酸性粒细胞活化趋化因子(Eotaxin)，并且幼龄受试者或幼龄个体与老龄个体之间的倍数差异为至少20％。类似地，老龄个体和幼龄个体之间其它炎性细胞因子的倍数差异可用于指生物学年龄。(参见美国专利申请第13/575,437号，其通过引用并入本文)。通常，个体是健康的，例如，个体在收获时没有血液恶性肿瘤或自身免疫性疾病。

用“遭受衰老相关认知受损或有遭受衰老相关认知受损风险的个体”意指约超过其预期寿命的50％，诸如超过60％，例如超过70％，诸如超过其预期寿命的75％、80％、85％、90％、95％或甚至99％的个体。个体的年龄将取决于所讨论的物种。因此，该百分比基于所讨论物种的预测预期寿命。例如，在人类中，此类个体为50岁或以上，例如60岁或以上，70岁或以上，80岁或以上，90岁或以上，并且通常不超过100岁，诸如90岁，即介于约50岁和100岁之间，例如50...55...60...65...70...75...80...85...90...95...100岁或以上，或介于50-1000岁之间的任何年龄，患有如下文进一步描述的衰老相关病状，例如与自然衰老过程相关的认知受损；约50岁或以上，例如60岁或以上，70岁或以上，80岁或以上，90岁或以上，并且通常不超过100岁，即介于约50岁和100岁之间，例如50...55...60...65...70...75...80...85...90...95...100岁，尚未开始显示出衰老相关病状的症状，例如认知受损的个体；如下文进一步描述，由于衰老相关疾病而遭受认知受损的任何年龄的个体，以及已经诊断患有通常伴有认知受损的衰老相关疾病的任何年龄的个体，其中所述个体尚未开始显示出认知受损的症状。非人类受试者的相应年龄是已知的并且旨在适用于本文。

如本文所用，“治疗”是指(i)预防疾病或病症，或(ii)减轻或消除疾病或病症的症状中的任何一种。治疗可以预防性地(在疾病发作之前)或治疗性地(在疾病发作之后)实现。该作用就完全或部分预防疾病或其症状而言，可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的副作用而言，可以是治疗性的。因此，如本文所用的术语“治疗”包括对哺乳动物衰老相关疾病或病症的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易患该疾病但尚未诊断为患有该疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)缓解疾病，即引起疾病消退。治疗可以导致各种不同的物理表现，例如基因表达的调节，组织或器官的再生等。治疗剂可以在疾病发作之前、期间或之后施用。在治疗稳定或减少患者的不良临床症状的情况下，对持续性疾病的治疗特别令人感兴趣。可以在受影响组织中完全丧失功能之前进行此类治疗。主题疗法可以在疾病症状期期间施用，并且在一些情况下在疾病症状期之后施用。

在一些实施方案中，所治疗的衰老相关病状是个体中衰老相关的认知能力损害。用认知能力或“认知”意指心理过程，其包括注意力和专注力，学习复杂的任务和概念，记忆(短期和/或长期获取、保留和检索新信息)，信息处理(处理五种感官收集的信息)，视觉空间功能(视觉感知、深度感知、使用心理图像、复制图纸、构建物体或形状)，生成和理解语言，

语言流利度(找词)，解决问题，做出决定和执行功能(计划和优先排序)。用“认知衰退”意指这些能力中的一种或多种逐渐降低，例如记忆力、语言、思维、判断力等降低。用“认知能力损害”和“认知受损”意指认知能力相对于健康个体例如年龄匹配的健康个体，或相对于该个体在较早时间点，例如2周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年、5年或10年或更长时间前的能力而言下降。用“衰老相关认知受损”意指通常与衰老相关的认知能力损害，包括例如与自然衰老过程相关的认知受损，例如轻度认知受损(M.C.I.)；与衰老相关病症相关的认知受损，即随着老年化增加而所见频率增加的病症，例如阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)、帕金森病(Parkinson's disease)、额颞叶痴呆、亨廷顿病(Huntington disease)、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化、青光眼、肌强直性营养不良症、血管性痴呆等神经退行性病状。

包含血浆组分的血液制品

收集包含血浆组分的血液制品

在一个实施方案中，通过静脉穿刺获得捐献品。在另一个实施方案中，静脉穿刺仅是单次静脉穿刺。在另一个实施方案中，不采用盐水体积替代物。在一个实施方案中，血浆分离术(plasmapheresis)的过程用于获得包含血浆的血液制品。血浆分离术可包括去除经体重调整体积的血浆，细胞组分返回供体。在该实施方案中，在血浆分离术期间使用柠檬酸钠以防止细胞凝结。在施用柠檬酸盐后，从供体收集的血浆体积优选介于690至880mL之间，并且优选与供体的体重协调。

3.血浆级分

在第二次世界大战期间，需要一种稳定的血浆扩容剂，当士兵失去大量血液时，可用于战场上。因此，开发了制备冷冻干燥血浆的方法。然而，在战斗情况下使用冷冻干燥血浆很困难，因为重构需要无菌水。作为替代方案，E.J.Cohn博士建议可以使用白蛋白，制备一种可以立即引入治疗休克的即用型稳定溶液。(参见Johan Vandersande,CurrentApproaches to the Preparation of Plasma Fractions in(Biotechnology of Blood)165(Jack Goldstein编辑，第1版，1991))。Cohn博士纯化血浆级分的程序利用了冷乙醇的变性作用，并采用pH和温度的变化来实现分离。

本文所述的方法的一个实施方案包括向受试者施用血浆级分。分级分离是将某些蛋白质亚群与血浆分离的过程。分级分离技术在本领域中是已知的，并且依赖于Cohn等人在20世纪40年代开发的步骤。(E.Cohn,Preparation and properties of serum andplasma proteins.IV.A system for the separation into fractions of the proteinand lipoprotein components of biological tissues and fluids.68J Am Chem Soc459(1946)，其通过引用并入本文)。该过程涉及几个步骤，每个步骤均涉及特定的乙醇浓度以及导致蛋白质选择性沉淀pH、温度和渗透压浓度变化。沉淀物也通过离心或沉淀分离。最初的“Cohn分级分离过程”涉及通过沉淀将蛋白质分成五个级分，称为级分I、级分II+III、级分IV-1、级分IV-4和级分V。白蛋白是这个过程最初鉴定的终点(级分V)产物。根据本发明的实施方案，每个级分(或来自先前分离步骤的流出物)含有或可能含有治疗上有用的蛋白质级分。(参见Thierry Burnouf,Modern Plasma Fractionation,21(2)TransfusionMedicine Reviews 101(2007)；Adil Denizli,Plasma fractionation:conventional andchromatographic methods for albumin purification,4J.Biol.&Chem.315,(2011)；和T.Brodniewicz-Proba,Human Plasma Fractionation and the Impact of NewTechnologies on the Use and Quality of Plasma-derived Products,5Blood Reviews245(1991)，及美国专利第3869431、5110907、5219995、7531513和8772461号，其通过引用并入本文)。可以调整上述实验参数以获得特定的蛋白质级分。

最近，分级分离已变得更加复杂，因此包括本发明另外的实施方案。最近这种复杂性的增加是通过以下方式发生的：引入色谱法，导致从现有级分如冷沉淀物、无冷冻沉淀物(cryo-poor)血浆和Cohn级分中分离出新蛋白质；通过整合色谱法和乙醇分级分离过程而增加IgG回收率；和病毒减少/灭活/去除。(同上。)为了在生理pH和离子强度下捕获蛋白质，可以利用阴离子交换色谱法。这保留了蛋白质和/或蛋白质级分的功能活性。肝素和单克隆抗体也用于亲和色谱法。本领域的普通技术人员将认识到，可以调整上述参数以获得特别需要的含血浆蛋白的级分。

在本发明的一个实施方案中，血浆在工业环境中分级分离。将冷冻血浆在1℃至4℃下解冻。对解冻血浆应用连续冷冻离心并分离冷沉淀物。将回收的冷沉淀物在-30℃或更低温度下冷冻并储存。将无冷冻沉淀物(“cryo-poor”)血浆立即加工用于捕获(通过例如初级色谱法)不稳定凝结因子，诸如因子IX复合物及其组分以及蛋白酶抑制剂，诸如抗凝血酶和C1酯酶抑制剂。可以在后续步骤中应用连续离心和沉淀分离。此类技术是本领域普通技术人员已知的，并且例如在美国专利第4624780、5219995、5288853和美国专利申请第20140343255和20150343025号中有描述，其公开内容通过引用整体并入本文。

在本发明的一个实施方案中，血浆级分可包含含有大量浓度的白蛋白的血浆级分。在本发明的另一个实施方案中，血浆级分可包含含有大量浓度的IgG或静脉内免疫球蛋白(IGIV)的血浆级分(例如

4.白蛋白制品

对于本领域普通技术人员来说，白蛋白血浆制品(“APP”)有两大类：血浆蛋白质级分(PPF)和人白蛋白溶液(HAS)。PPF源自产率比HAS更高的方法，但最低白蛋白纯度比HAS更低(PPF>83％，HAS>95％)。(Production of human albumin solution:a continuallydeveloping colloid,P.Matejtschuk等人，British J.of Anaesthesia 85(6):887-95,at888(2000))。另外，一些人已经注意到PPF具有缺点，因为存在蛋白质“污染物”，例如PKA。同上。因此，PPF制剂失去了与白蛋白血浆制品一样的普及性，甚至已经从某些国家的药典中除名。同上。与这些问题相反，本发明有益地利用了这些“污染物”。除了α、β和γ球蛋白以及上述PKA之外，本发明的方法还利用了“污染物”中促进诸如神经发生、神经元细胞存活和改善认知的过程的其它蛋白质或其它因子。

本领域技术人员将认识到存在或已经存在几个PPF的商业来源(“商业PPF制剂。”)这些包括Plasma-Plex

本领域技术人员将认识到存在或已经存在几个HAS的商业来源(“商业HAS制剂”)。这些包括Albuminar

A.血浆蛋白质级分(人)(PPF)

根据美国食品和药物管理局(“FDA”)，“血浆蛋白质级分(人类)”或PPF，是定义为“由源自人类血浆的白蛋白和球蛋白组成的蛋白质无菌溶液”的产品的专有名称。(美国联邦法规“CFR”21CFR 640.90，其通过引用并入本文)。PPF的源材料是从21CFR 640.1-640.5(通过引用并入本文)中所规定的那样制备的全血中回收的血浆，或如21CFR 640.60-640.76(通过引用并入本文)中所规定的那样制备的源血浆。

根据21CFR 640.92(通过引用并入本文)测试PPF以确定其符合以下标准：

(a)最终产品应为5.0+/-0.30％的蛋白质溶液；并且

(b)最终产品中的总蛋白质应由至少83％的白蛋白和不超过17％的球蛋白组成。不超过总蛋白质的1％应为γ球蛋白。蛋白质组成通过食品和药物管理局，生物制品评估和研究中心主任为每个制造商批准的方法确定。

如本文所用，“血浆蛋白质级分”或“PPF”是指由源自人血浆的白蛋白和球蛋白及其它血浆蛋白组成的无菌蛋白质溶液，白蛋白含量为至少83％，球蛋白不超过17％(包括α1、α2、β和γ球蛋白)，并且通过电泳测定γ球蛋白不超过1％。(Hink,J.H.,Jr.等人，Preparation and Properties of a Heat-Treated Human Plasma Protein Fraction,Vox Sanguinis 2(174)(1957))。PPF也可以指固体形式，其在悬浮于溶剂中时具有类似的组成。可以通过从总蛋白质中减去白蛋白来确定总球蛋白分数。(Busher,J.,SerumAlbumin and Globulin,Clinical Methods:The History,Physical,and LaboratoryExaminations,Chapter 10,Walker HK,Hall WD,Hurst JD编辑(1990))。

B.白蛋白(人)(HAS)

根据FDA，“白蛋白(人)”(在本文中也称为“HAS”)是定义为“源自人血浆的白蛋白无菌溶液”的产品的专有名称。(美国联邦法规“CFR”21CFR 640.80，其通过引用并入本文)。白蛋白(人)的源材料是从21CFR 640.1-640.5(通过引用并入本文)中所规定的那样制备的全血中回收的血浆，或如21CFR640.60-640.76(通过引用并入本文)中所规定的那样制备的源血浆。21CFR640.80–640.84(通过引用并入本文)中列出了白蛋白(人)的其它要求。

根据21CFR 640.82测试白蛋白(人)以确定其符合以下标准：

(a)蛋白质浓度.最终产品应符合下列浓度之一：蛋白质溶液的4.0+/-0.25％；5.0+/-0.30％；20.0+/-1.2％；和25.0+/-1.5％。

(b)蛋白质组成.通过食品和药物管理局，生物制品评估和研究中心主任为每个制造商批准的方法确定，最终产品中总蛋白质的至少96％应为白蛋白。

如本文所用，“白蛋白(人)”或“HAS”是指由源自人血浆的白蛋白和球蛋白及其它血浆蛋白组成的无菌蛋白质溶液，白蛋白含量为至少95％，球蛋白不超过5％(包括α1、α2、β和γ球蛋白)。HAS也可以指固体形式，其在悬浮于溶剂中时具有类似的组成。可以通过从总蛋白质中减去白蛋白来确定总球蛋白分数。

如本领域普通技术人员可以认识到的，PPF和HAS级分也可以是冷冻干燥的或呈其它固体形式。例如，此类含有适当添加剂的制剂可用于制备片剂、粉剂、粒剂或胶囊剂。通过将固体形式溶解、悬浮或乳化在水性或非水性溶剂，例如植物油或其它类似油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇中，可将固体形式配制成注射用制剂；并且如果需要，可用常规添加剂如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂配制。

5.凝血因子减少的级分

本发明的另一个实施方案使用血浆级分，从中去除了基本上所有的凝血因子以便保持级分功效并降低血栓形成的风险。方便地，血液制品可以源自幼龄供体或一群幼龄供体，并且可以使其缺乏IgM以提供ABO相容的幼龄血液制品。目前，输注的血浆与ABO血型匹配，因为A和B抗原的天然抗体的存在可引起输血反应。当给予患者不与ABO匹配的血浆时，IgM似乎是造成输血反应的原因。从血液制品或级分中去除IgM有助于消除施用本发明的血液制品和血浆级分的受试者的输血反应。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及治疗或预防受试者中的衰老相关病状诸如认知受损或神经变性的方法。该方法包括：向受试者施用源自来自一个个体或一群个体的全血的血液制品或血液级分，其中血液制品或血液级分基本上不含(a)至少一种凝血因子和/或(b)IgM。在一些实施方案中，血液制品或血液部分所来源的个体是幼龄个体。在一些实施方案中，血液制品基本上不含至少一种凝血因子和IgM。在某些实施方案中，血液制品基本上不含纤维蛋白原(因子I)。在另外的实施方案中，血液制品基本上缺乏红细胞和/或白细胞。在其它实施方案中，血液制品基本上是无细胞的。在其它实施方案中，血液制品源自血浆。本发明的此类实施方案受2016年8月18日提交的美国专利申请第62/376,529号进一步支持，该申请通过引用整体并入本文。

6.富含蛋白质的血浆蛋白制品

本发明另外的实施方案使用与PPF相比白蛋白浓度降低，但球蛋白和其它血浆蛋白(一些人称之为“污染物”)的量增加的血浆级分。如同PPF、HAS、流出物I和流出物II/III一样，这些实施方案都有效缺乏凝血因子。以下将此类血浆级分称为“富含蛋白质的血浆蛋白制品”。例如，本发明的一个实施方案可以使用由82％白蛋白和18％α、β和γ球蛋白及其它血浆蛋白组成的富含蛋白质的血浆蛋白制品。本发明的另一个实施方案可以使用由81％白蛋白和19％α、β和γ球蛋白和/或其它血浆蛋白组成的富含蛋白质的血浆蛋白制品。本发明的另一个实施方案可以使用由80％白蛋白和20％α、β和γ球蛋白和/或其它血浆蛋白组成的富含蛋白质的血浆蛋白制品。本发明另外的实施方案可以使用由70-79％白蛋白和相应的21-30％α、β和γ球蛋白及其它血浆蛋白组成的富含蛋白质的血浆蛋白制品。本发明另外的实施方案可以使用由60-69％白蛋白和相应的31-40％α、β和γ球蛋白及其它血浆蛋白组成的富含蛋白质的血浆蛋白制品。本发明另外的实施方案可以使用由50-59％白蛋白和相应的41-50％α、β和γ球蛋白及其它血浆蛋白组成的富含蛋白质的血浆蛋白制品。本发明另外的实施方案可以使用由40-49％白蛋白和相应的51-60％α、β和γ球蛋白及其它血浆蛋白组成的富含蛋白质的血浆蛋白制品。本发明另外的实施方案可以使用由30-39％白蛋白和相应的61-70％α、β和γ球蛋白及其它血浆蛋白组成的富含蛋白质的血浆蛋白制品。本发明另外的实施方案可以使用由20-29％白蛋白和相应的71-80％α、β和γ球蛋白及其它血浆蛋白组成的富含蛋白质的血浆蛋白制品。本发明另外的实施方案可以使用由10-19％白蛋白和相应的81-90％α、β和γ球蛋白及其它血浆蛋白组成的富含蛋白质的血浆蛋白制品。本发明另外的实施方案可以使用由1-9％白蛋白和相应的91-99％α、β和γ球蛋白及其它血浆蛋白组成的富含蛋白质的血浆蛋白制品。本发明的再一个实施方案可以使用由0-1％白蛋白和99-100％α、β和γ球蛋白及其它血浆蛋白组成的富含蛋白质的血浆蛋白制品。

上述本发明的实施方案还可具有0-5％的总γ球蛋白浓度。

血浆级分中蛋白质的具体浓度可以使用相关领域中普通技术人员熟知的技术来确定。作为实例而非限制，此类技术包括电泳、质谱法、ELISA分析和蛋白质印迹分析。

7.血浆级分的制备

制备PPF和其它血浆级分的方法是本领域普通技术人员所熟知的。本发明的一个实施方案允许将用于制备人血浆蛋白质级分的血液收集在具有柠檬酸盐或抗凝剂柠檬酸盐葡萄糖溶液的烧瓶中以抑制凝结，并根据Hink等人公开的方法进一步分离级分I、II+III、IV和PPF(参见Hink,J.H.,Jr.等人，Preparation and Properties of a Heat-Treated Human Plasma Protein Fraction,Vox Sanguinis2(174)(1957)，通过引用并入本文。)根据该方法，可将混合物收集至2-8℃。随后可以通过在7℃下离心分离血浆，取出并储存在-20℃下。然后可以将血浆在37℃下解冻并分级分离，优选在从-20℃储存取出后8小时内分级分离。

可以使用pH 7.2的8％乙醇和-2至-2.5℃的温度将血浆与级分I分离，蛋白质浓度为5.1至5.6％。可以在将血浆温度降至-2℃期间，使用喷射器以例如450mL/分钟的速率添加53.3％冷乙醇(176mL/L血浆)与乙酸盐缓冲液(200mL4M乙酸钠、230mL冰醋酸，加适量H

通过流出物调节可以将级分II+III从流出物I分离至pH 6.8的21％乙醇中，温度为-6℃，蛋白质浓度为4.3％。可以在将流出物I的温度降至-6℃期间，使用喷射器以例如500mL/分钟的速率添加95％冷乙醇(176mL/L流出物I)和用于pH调节的10M乙酸。可以通过在-6℃下离心去除所得沉淀物(级分II+III)。可以使用本领域普通技术人员熟知的方法从级分II+III获得γ球蛋白。

通过流出物调节，可以将级分IV-1从流出物II+III(“流出物II/III”)分离至pH5.2的19％乙醇中，温度为-6℃且和蛋白质浓度为3％。H

可以将回收的蛋白质(稳定的血浆蛋白质级分)干燥(例如通过冷冻干燥)以去除醇和H

本领域普通技术人员将认识到，上述每种不同的级分和流出物可以与本发明的方法一起用于治疗疾病。例如但不限于，流出物I或流出物II/III可用于治疗疾病诸如认知和神经退行性病症，并且是本发明的实施方案。

制备血浆级分和血浆蛋白质级分(PPF)的前述方法仅是示例性的，仅涉及本发明的实施方案。本领域普通技术人员将认识到这些方法可以改变。例如，在本发明的不同实施方案和方法中，除了其它方面外，可以调节pH、温度和乙醇浓度以产生血浆级分和血浆蛋白质级分的不同变化。在另一个实例中，本发明另外的实施方案考虑使用纳米过滤从血浆级分和血浆蛋白质级分中去除/灭活病原体。

本发明的另一个实施方案考虑使用和/或包含另外的血浆级分的方法和组合物。例如，除了其它方面外，本发明证明白蛋白的具体浓度对于改善认知活动并不重要。因此，本发明考虑了白蛋白浓度降低的级分，诸如低于白蛋白83％的那些级分。

8.治疗

本文描述的本发明方法的方面包括用包含血浆的血液制品，诸如血浆级分(例如如上所述的)治疗受试者。一个实施方案包括用包含血浆的血液制品治疗人类受试者。本领域技术人员将认识到，用包含血浆的血液制品治疗受试者的方法是本领域公认的。作为实例而非限制，本文描述的本发明方法的一个实施方案包括向受试者施用新鲜冷冻血浆以治疗和/或预防认知受损和/或年龄相关性痴呆。在一个实施方案中，向患有认知受损和/或年龄相关性痴呆或处于其风险中的个体立即施用包含血浆的血液制品，例如在从供体收集约12-48小时内。在此类情况下，制品可以冷藏储存，例如0-10℃。在另一个实施方案中，新鲜冷冻血浆是在-18℃或更冷的温度下冷冻储存(冷冻保护)的血浆。在施用之前，将新鲜冷冻血浆解冻并且一旦解冻，就在解冻过程开始后60-75分钟施用给受试者。每个受试者优选接受单个单位的新鲜冷冻血浆(200-250mL)，新鲜冷冻血浆优选源自预定年龄范围的供体。在本发明的一个实施方案中，新鲜冷冻血浆由(源自)幼龄个体捐献。在本发明的另一个实施方案中，新鲜冷冻血浆由(源自)相同性别的供体捐献。在本发明的另一个实施方案中，新鲜冷冻血浆由(源自)年龄范围在18-22岁之间的供体捐献。在一个实施方案中，受试者每周治疗两次，输注间隔3-4天。在本发明的一个实施方案中，治疗持续直至达到特定终点。

在本发明的一个实施方案中，在通过血型捐献后筛选包含血浆的血液制品。在本发明的另一个实施方案中，根据21CFR 640.33的要求和FDA指导文件中所含的建议，筛选包含血浆的血液制品用于感染性疾病因子，诸如HIV I和II、HBV、HCV、HTLV I和II、抗HBc。

在本发明的另一个实施方案中，受试者用“血浆级分”治疗。在本发明的一个实施方案中，血浆级分为PPF或HAS。在本发明的另一个实施方案中，血浆级分是商业PPF制剂或商业HAS制剂之一。在本发明的另一个实施方案中，血浆级分是源自一群特定年龄范围的个体诸如幼龄个体的PPF或HAS，或者是经过额外分级分离或加工的改良PPF或HAS级分(例如，其一种或多种特定蛋白质部分或基本上去除的PPF或HAS)。在本发明的另一个实施方案中，血浆级分是IGIV血浆级分，其基本上已经耗尽免疫球蛋白(IgG)。“基本上耗尽”或“基本上去除”特定蛋白质(诸如IgG)的血液级分，是指正如使用本领域熟知的标准测定法测量的那样，含有少于参照制品或全血浆中存在的量的约50％，例如低于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、.25％、.1％、不可检测水平或介于这些值之间的任意整数的血液级分。

9.监测

本发明的另一方面涉及监测药物对受试者治疗认知受损和/或年龄相关性痴呆的效果的方法，该方法包括比较治疗前后的认知功能。本领域普通技术人员认识到存在评价认知功能的熟知方法。例如但不限制，该方法可以包括基于医学史、家族史评价认知功能，由专门研究痴呆和认知功能的临床医生进行身体和神经学检查，实验室试验和神经心理学评估。本发明考虑的其它实施方案包括：意识评估，诸如使用格拉斯哥昏迷量表(EMV)；精神状态检查，包括简易心理测试分数(AMTS)或简短精神状态检查(MMSE)(Folstein等人，J.Psychiatr.Res 1975；12:1289-198)；高级功能整体评估；诸如通过眼底镜检查进行的颅内压估计。

在一个实施方案中，可以使用周围神经系统检查来评价认知功能，包括以下任一项：嗅觉、视野和视敏度、眼球运动和瞳孔(交感神经和副交感神经)、面部感觉功能、面部和肩带肌肉力量、听觉、味觉、咽部运动和反射、舌头运动，其可以单独测试(例如视敏度可以通过斯内伦视力表(Snellen chart)测试；反射锤用于测试包括咬肌、肱二头肌和肱三头肌腱、膝腱、足踝反射和足底(即巴宾斯基征(Babinski sign))的反射；肌肉力量，常常按MRC量表1至5；肌肉张力和僵硬体征。

10.施用

在实践本发明的方法中，将血浆级分施用给受试者。在一个实施方案中，血浆级分通过静脉内输注施用。输注速率可以变化，但在本发明的一个实施方案中，输注速率为5-8mL/分钟。本领域普通技术人员将认识到输注速率可取决于受试者的状况和对施用的反应。

在向成年哺乳动物施用有效量的活性剂的那些实施方案中，该量或剂量在施用一段合适的时间，诸如一周或更长，包括两周或更长，诸如3周或更长，一个月或更长，2个月或更长，3个月或更长，4个月或更长，5个月或更长，6个月或更长，1年或更长等，以证明成年哺乳动物中病状例如认知障碍减轻，或认知受损延迟和/或认知改善时是有效的。例如，有效剂量是在施用一段合适的时间时将减缓例如约20％或更多，例如30％或更多，40％或更多，或50％或更多，在一些情况下减缓60％或更多，70％或更多，80％或更多，或90％或更多的剂量。例如，遭受自然衰老或衰老相关病症的患者中将会停止认知衰退。在一些情况下，有效量或剂量的血液制品不但会减缓或停止疾病状况的进展，而且还会诱导病状逆转，即，会引起认知能力改善。例如，在一些情况下，有效量是在施用一段合适的时间，通常至少约一周并且可能约两周或更长，取决于个人施用约3周、4周、8周或更长时间时，将会使遭受衰老相关认知受损的个体的认知能力相对于施用血液制品或级分之前的认知改善，例如1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍，在一些情况下改善6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍。在一些情况下，有效量或剂量的活性剂不但会减缓或停止疾病状况的进展，而且还会诱导病状逆转，即，会引起认知功能改善。例如，在一些情况下，有效量是在施用一段合适的时间时，将会使遭受认知衰退或损害的个体的症状相对于该试剂施用之前的未治疗个体改善，例如1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍，在一些情况下改善6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍。

在其它实施方案中，血浆级分或血浆级分根据美国专利申请第62/490,519号中描述的一种或多种给药方案施用，该专利申请通过引用整体并入本文。因此，本发明的一个实施方案包括通过向受试者施用有效量的血浆或血浆级分来治疗经诊断有认知受损的受试者，其中血浆或血浆级分施用的方式是在达到血浆蛋白质或血浆级分蛋白质的平均或中值半衰期后，相对于最近施用的剂量引起认知功能或神经发生改善(本文称为“脉冲给药”或“脉冲给药的”)。本发明的另一个实施方案包括通过至少连续两天的给药方案施用血浆或血浆级分，并在最后一次施用日期后至少3天监测受试者的认知功能改善。本发明的另一个实施方案包括通过至少连续3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天的给药方案施用血浆或血浆级分，并在最后一次施用日期后至少3天监测受试者的认知功能改善。本发明的再一个实施方案包括通过至少连续2天的给药方案施用血浆或血浆级分，并在最后一次施用日期之后，监测超过达到血浆或血浆级分中蛋白质的平均半衰期时的认知改善。本发明的另一个实施方案包括通过2至14天非连续的给药方案施用血浆或血浆级分，其中剂量间的每个间隔可为各0-3天。在一些情况下，根据本发明的脉冲给药包括施用第一组剂量(例如，如上所述的)，然后是一段无给药时期，例如“无给药期”，其后接着施用另一剂量或另一组剂量。该“无剂量”期的持续时间可以变化，但在一些实施方案中，可以是7天或更长，诸如10天或更长，包括14天或更长，其中一些情况下无剂量期的范围为15至365天，诸如30至90天，并且包括30至60天。因此，该方法的实施方案包括非长期(即非连续)给药，例如血液制品的非长期施用。在一些实施方案中，根据需要，脉冲给药后是无剂量期的模式根据需要重复多次，其中在一些情况下，该模式持续1年或更长，例如2年或更长，达到并包括受试者的寿命。本发明的另一个实施方案包括通过连续5天的给药方案施用血浆或血浆级分，有2-3天的无剂量期，接着连续施用2-14天。

在生物化学上，活性剂的“有效量”或“有效剂量”意指抑制、拮抗、降低、减少或阻遏约20％或更多，例如30％或更多，40％或更多，或50％或更多，在一些情况下60％或更多，70％或更多，80％或更多，或90％或更多，在一些情况下约100％，即可忽略的量，并且在一些情况下，逆转认知受损或与年龄相关性痴呆进展的活性剂的量。

11.血浆蛋白质级分

在实践本发明的方法中，将血浆级分施用给受试者。在一个实施方案中，血浆级分是血浆蛋白质级分(PPF)。在另外的实施方案中，PPF选自商业PPF制剂。

在另一个实施方案中，通过电泳测定，PPF由88％正常人白蛋白、12％α和β球蛋白和不超过1％的γ球蛋白组成。用于实践本发明方法的该实施方案的实施方案包括，例如，该实施方案为5％用碳酸钠缓冲并用0.004M辛酸钠和0.004M乙酰色氨酸稳定的PPF溶液。其它调配物，包括那些改变溶液中的PPF百分比(例如约1％至约10％，约10％至约20％，约20％至25％，约25％至30％)以及溶剂和稳定剂浓度的调配物，可用于实践本发明的方法。

12.特定供体年龄的血浆级分

本发明的一个实施方案包括施用源自某些年龄范围的个体的血浆的血浆级分或血浆级分。另外的实施方案包括施用源自某些年龄范围的个体的血浆的血浆蛋白质级分。一个实施方案包括施用源自幼龄个体的血浆的PPF或HAS。在本发明的另一个实施方案中，幼龄个体具有单一特定年龄或特定年龄范围。再一个实施方案中，供体的平均年龄小于受试者的平均年龄或小于受治疗受试者的平均年龄。

本发明的某些实施方案包括汇集来自特定年龄范围的个体的血液或血浆，并如上所述分级分离血浆以获得血浆蛋白质级分制品，诸如PPF或HAS。在本发明的替代实施方案中，血浆蛋白质级分或特定血浆蛋白质级分是从适合特定年龄范围的特定个体获得的。在本发明的另一个实施方案中，血浆级分、血浆级分或特定血浆蛋白质级分制品是从一群幼龄个体获得的，其中“幼龄”可以通过如上所述的日历或生物学年龄来确定，并且个体年龄可以是具体年龄或年龄范围。

13.适应症

本发明方法和含有血浆的血液制品和级分可用于治疗(包括预防)衰老相关病状，诸如个体认知能力损害，例如认知障碍，包括(但不限于)年龄相关性痴呆、免疫学病状、癌症，以及身体和功能衰退。遭受或有风险发展衰老相关认知受损，将受益于用本发明的含血浆的血液制品，例如通过本文公开的方法进行治疗的个体，包括约50岁或以上，例如60岁或以上，70岁或以上，80岁或以上，90岁或以上和100岁或以上，即年龄介于50至100岁之间，例如50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁、90岁、95岁或约100岁，并且遭受与自然衰老过程相关的认知受损，例如轻度认知受损(M.C.I.)的个体；及约50岁或以上，例如60岁或以上，70岁或以上，80岁或以上，90岁或以上，并且通常不超过100岁，即年龄介于约50岁和90岁之间，例如50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁、90岁、95岁或约100岁，尚未开始显示出认知受损症状的个体。自然衰老导致的认知受损的实例包括：

A.轻度认知受损(M.C.I.)是一种适度的认知破坏，其表现为记忆力或其它心理功能的问题，诸如计划、遵循指示或决策能力随时间推移而恶化，而整体心理功能和日常活动不受损害。因此，尽管通常不会发生明显的神经元死亡，但衰老大脑中的神经元易受结构、突触完整性和突触分子处理的亚致死性年龄相关改变的影响，所有这些都会损害认知功能。

遭受或有风险发展衰老相关认知受损，将受益于用本发明的含血浆的血液制品或级分，例如通过本文公开的方法进行治疗的个体，还包括遭受衰老相关病症引起的认知受损的任何年龄的个体；及已经被诊断出患有通常伴有认知受损的年龄相关病症的任何年龄的个体，其中个体尚未开始呈现认知受损症状。此类衰老相关病症的实例包括以下：

B.阿尔茨海默病.阿尔茨海默病是一种与大脑皮质和皮质下灰质中过多的老年斑块相关的进行性、不可避免的认知功能丧失，大脑皮质和皮质下灰质还包含b-淀粉样蛋白和由tau蛋白组成的神经原纤维缠结。常见形式影响>60岁的人，其发病率随着年龄的增长而增加。占老年人痴呆症的65％以上。

阿尔茨海默病的病因尚不清楚。在家庭中该病占约15％至20％的病例。其余所谓的散发病例有一些遗传决定因素。该疾病在大多数早发病例和一些晚发病例中具有常染色体显性遗传模式，但具有可变的晚年外显率。环境因素是积极调查的重点。

在疾病过程中，在大脑皮质、海马和皮质下结构(包括Meynert基底核中的选择性细胞损失)、蓝斑核和背侧缝际核中突触和最终神经元损失。在大脑的某些区域(早期疾病的顶叶和颞叶皮质，晚期疾病的前额叶皮质)，大脑葡萄糖的使用和灌注减少。神经炎性斑块或老年斑块(由神经突、星形胶质细胞和淀粉样蛋白核周围的神经胶质细胞组成)和神经原纤维缠结(由成对的螺旋丝组成)在阿尔茨海默病的发病机理中起作用。老年斑块和神经原纤维缠结在正常衰老时发生，但它们在阿尔茨海默病患者中更为普遍。

C.帕金森病.帕金森病(PD)是一种特发性、缓慢进行性、退行性CNS病症，其特征在于运动缓慢和减少，肌肉僵直，静止性震颤和姿势不稳定。PD最初被认为主要是运动障碍，现在还被认为会影响认知、行为、睡眠、自主神经功能和感觉功能。最常见的认知受损包括注意力和专注力、工作记忆、执行功能、生成语言和视觉空间功能损害。

在原发性帕金森病中，黑质、蓝斑核和其它脑干多巴胺能细胞群的色素神经元损失。原因尚不清楚。投射到尾状核和壳核的黑质神经元的损失导致这些区域中神经递质多巴胺的消耗。发病通常在40岁以后，老年人群的发病率增加。

继发性帕金森病是由于其它特发性退行性疾病、药物或外源性毒素引起的基底神经节中多巴胺作用的损失或干扰所致。继发性帕金森病最常见的原因是服用抗精神病药物或利血平(reserpine)，其通过阻断多巴胺受体而产生帕金森病。不太常见的原因包括一氧化碳或锰中毒、脑积水、结构性病变(肿瘤，影响中脑或基底神经节的梗塞)、硬膜下血肿和退行性病症，包括纹状体黑质变性。

D.额颞叶痴呆.额颞叶痴呆(FTD)是由大脑额叶逐渐恶化引起的病状。随着时间的推移，退化可能进展至颞叶。仅次于阿尔茨海默病(AD)患病率，FTD占早老性痴呆病例的20％。根据受影响的额叶和颞叶的功能将症状分为三类：

行为变异FTD(bvFTD)，其症状一方面包括嗜睡和无自发性，另一方面包括解除抑制；进行性迟滞型失语症(PNFA)，其中观察到由于发音困难、语音和/或句法错误而导致的语言流利度下降，但保持了词汇理解力；和语义性痴呆(SD)，患者在正常语音和语法上保持流畅，但在命名和词汇理解方面的难度越来越大。所有FTD患者常见的其它认知症状包括执行功能和专注能力受损。其它认知能力，包括感知、空间技能、记忆和实践通常保持完好。FTD可以通过观察结构MRI扫描中显露的额叶和/或前颞叶萎缩来诊断。

存在多种形式的FTD，其中任何一种都可以使用本发明的方法和组合物来治疗或预防。例如，一种形式的额颞叶痴呆是语义性痴呆(SD)。SD的特征在于言语和非言语领域中语义记忆力丧失。SD患者常常出现抱怨找词困难。临床体征包括流畅失语症、命名不能、词义理解力受损以及相关的视觉失认症(无法匹配语义上相关的图片或物体)。随着疾病的进展，行为和人格的变化常常与额颞叶痴呆中所见的变化相似，尽管已经描述了后期行为症状很少的“纯粹”语义性痴呆症的情况。结构MRI成像显示颞叶(主要在左侧)萎缩的特征模式，下部牵连高于上部牵连且前颞叶萎缩高于后部。

再如，另一种形式的额颞叶痴呆是皮克氏病(Pick's disease)(PiD，也是PcD)。该疾病的一个定义性特征是神经元中tau蛋白积累，积聚成银染色球形聚集体，称为“皮克体(Pick bodies)”。症状包括失去语言能力(失语症)和痴呆。眶额功能障碍患者可能变得具有攻击性和社交不和谐。他们可能会偷窃或表现出强迫性或重复性刻板行为。背内侧或背外侧额叶功能障碍患者可能表现出缺乏关心、冷漠或自发性降低。患者可表现出缺乏自我监控、自我意识异常以及无法理解含义。双侧后外侧眶额皮质和右前岛叶中灰质损失的患者可能表现出进食行为变化，例如病理性喜好甜食。前外侧眶额皮质中焦灰质损失较多的患者可能出现饮食过量。虽然一些症状最初可以缓解，但疾病进展并且患者常在2到10年内死亡。

E.亨廷顿病.亨廷顿病(HD)是一种遗传进行性神经退行性病症，其特征在于情绪、行为和精神异常的发展；丧失智力或认知功能；和运动异常(运动障碍)。HD的典型体征包括发展舞蹈病-可能影响面部、手臂、腿部或躯干的无意识、快速、不规则、急跳运动-以及认知衰退，包括逐渐丧失思维处理和获得性智力能力。可能存在记忆、抽象思维和判断力受损；对时间、地点或身份的不正确认知(迷失方向)；激动；和人格变化(人格解体)。尽管症状通常在生命的第四十年或第五十年中变得明显，但发病年龄是可变的并且范围从儿童早期到成年晚期(例如，70岁或80岁)。

HD作为常染色体显性性状在家庭内传播。该病症是由于染色体4(4p16.3)上基因内编码指令的异常长序列或“重复”而引起的。与HD相关的神经系统功能进行性丧失是由于脑部某些区域(包括基底神经节和大脑皮层)中神经元的丧失引起的。

F.肌萎缩侧索硬化.肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种快速进行性，总是致命的神经疾病，可攻击运动神经元。肌无力和萎缩以及前角细胞功能障碍的体征最初最常在手部被注意到而在足部较少发生。发病部位是随机的，并且进展是不对称的。痉挛很常见，可能继发无力。很少有患者存活30年；50％死于发病3年，20％死于5年，10％死于10年。

诊断特征包括成年中期或晚期发作以及没有感觉异常的进行性、全身性运动牵连。神经传导速度在疾病晚期之前是正常的。最近的研究也记录了认知受损的表现，特别是直接言语记忆、视觉记忆、语言和执行功能降低。

已经报道了在ALS患者表现正常的神经元中胞体面积、突触数量和总突触长度的减少。有人提出，当活性区的可塑性达到极限时，持续性突触损失可导致功能损害。促进形成或新的突触或预防突触损失可以维持这些患者的神经元功能。

G.多发性硬化.多发性硬化(MS)的特征在于CNS功能障碍的各种症状和体征，伴有缓解和反复出现恶化。最常见的主要症状是一个或多个肢体、躯干或面部一侧的感觉异常；腿或手无力或笨拙；或视力障碍，例如，一只眼睛部分失明和疼痛(球后视神经炎)、视力模糊或暗点。常见的认知受损包括记忆损害(获取、保留和检索新信息)、注意力和专注力(特别是分散注意力)、信息处理、执行功能、视觉空间功能和言语流畅性。常见的早期症状是导致双视(复视)的眼麻痹，一个或多个肢体短暂无力，肢体轻微僵硬或不寻常疲劳，轻微的步态紊乱，膀胱控制困难，眩晕和轻度情绪紊乱；所有这些都表明分散的CNS牵连并且通常发生在疾病被识别之前数月或数年。过多的热量可能会加重症状和体征。

该过程高度变化，难以预测，并且在大多数患者中，具有间歇性。最初，数月或数年的缓解可以分开发作，尤其是在疾病以球后视神经炎开始时。然而，一些患者经常发作并迅速丧失能力；对于一些过程而言可以是快速进行性的。

H.青光眼.青光眼是一种常见的神经退行性疾病，其影响视网膜神经节细胞(RGC)。证据支持在突触和树突中(包括在RGC中)存在区室化的退化程序。最近的证据也表明老年人的认知受损与青光眼之间存在相关性(Yochim BP等人，Prevalence ofcognitive impairment,depression,and anxiety symptoms among older adults withglaucoma.J Glaucoma.2012；21(4):250-254)。

I.肌强直性营养不良症.肌强直性营养不良症(DM)是一种常染色体显性多系统疾病，其特征为营养不良性肌无力和肌强直。分子缺陷是在染色体19q上的肌强蛋白激酶基因的3'非翻译区中扩增的三核苷酸(CTG)重复序列。症状可在任何年龄出现，临床严重程度范围广泛。肌强直在手部肌肉中很突出，即使在轻微情况下下垂也很常见。在严重情况下，出现明显的外周肌肉无力，常伴有白内障、过早秃顶、斧头状面容、心律失常、睾丸萎缩和内分泌异常(例如，糖尿病)。精神发育迟滞在严重的先天性形式中很常见，而在该病症较轻微的成人形式中观察到衰老相关的额颞认知功能衰退，特别是语言和执行功能衰退。严重受影响的人在50岁出头时死亡。

J.痴呆.痴呆描述了一类具有影响思维和社交能力的症状的病症，其严重程度足以干扰日常功能。除了在上文讨论的衰老相关病症的晚期阶段中观察到的痴呆外，痴呆的其它情况包括如下所述的血管性痴呆和路易体痴呆。

在血管性痴呆或“多发梗塞性痴呆”中，认知受损是因向大脑供血的问题引起的，所述问题通常是一系列轻微中风，或有时是大中风，之前或之后是较小中风。血管病变可能是弥漫性脑血管疾病，诸如小血管疾病或局灶性病变或两者的结果。患有血管性痴呆的患者在急性脑血管事件后急性或亚急性地呈现出认知受损，之后观察到进行性认知衰退。认知受损与阿尔茨海默病中观察到的相似，包括语言、记忆、复杂性视觉处理或执行功能的损害，尽管脑部相关变化不是由AD病理所引起的，而是由脑部血流量慢性减少所引起的，最终导致痴呆。单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和正电子发射断层扫描(PET)神经成像可用于确认多梗塞性痴呆的诊断以及涉及精神状态检查的评估。

路易体痴呆(DLB，也以多种其它名称所知，包括路易体失智症、弥散性路易体病、皮质路易体病和路易型老年性痴呆)，是解剖学特征在于神经元中存在路易体(α-突触核蛋白和泛素蛋白团块)，在死后脑组织学中可检测到的一种痴呆症。其主要特征是认知衰退，尤其是执行功能。警觉性和短期记忆力会起伏不定。

持续或反复出现的幻视与生动细致的画面往往是早期诊断症状。在早期阶段常常将DLB与阿尔茨海默病和/或血管性痴呆混淆，尽管阿尔茨海默病通常开始很慢，而DLB常常发作快速或急性。DLB症状还包括类似于帕金森病的运动症状。DLB与痴呆症的区别在于，痴呆症状相对于帕金森症状出现的时间范围内有时发生在帕金森病中。伴有痴呆症(POD)的帕金森病是帕金森症发病后一年以上痴呆症发病时的诊断。当认知症状在帕金森症状的同一时间或一年内开始时，诊断出DLB。

K.进行性核上性麻痹.进行性核上性麻痹(PSP)是一种脑部病症，可引起控制步态和平衡的严重和进行性问题，以及复杂的眼球运动和思维问题。该疾病的一个典型体征是眼睛无法瞄准，这是因为协调眼球运动的脑部区域中的病变而发生。有些个体将这种效果描述为模糊。受影响的个体常常表现出情绪和行为改变，包括抑郁和冷漠以及进行性轻度痴呆。该病症的长名称表明疾病开始缓慢并继续恶化(进行性)，并且通过损伤脑部某些部分而导致虚弱(麻痹)，这些部分在控制眼球运动的称为核的豌豆大小的结构上(核上性)。PSP在1964年首次被描述为一种独特病症，当时有三位科学家发表了将该病状与帕金森病区分开的论文。有时被称为Steele-Richardson-Olszewski综合征，其反映了定义该病症的科学家的组合名称。尽管PSP逐渐恶化，但没有人死于PSP本身。

L.

M.多系统萎缩.多系统萎缩(MSA)是一种退行性神经障碍。MSA与脑部特定区域的神经细胞变性有关。这种细胞变性引起身体运动、平衡和其它自主功能，诸如膀胱控制或血压调节的问题。

MSA的原因尚不清楚，也未发现具体的危险因素。大约55％的病例发生在男性中，典型发病年龄在50岁后期至60岁早期。MSA常常呈现一些与帕金森病相同的症状。然而，MSA患者通常对用于帕金森氏症的多巴胺药物的反应很小。

N.衰弱.衰弱综合征(“衰弱”)是一种老年综合征，其特征在于功能和体力衰退，包括活动能力下降、肌无力、身体缓慢、耐力不足、身体活动量低、营养不良和无意识的体重减轻。此类衰退常常伴有认知功能障碍和癌症等疾病后果。然而，即使没有疾病，也可能发生衰弱。患有衰弱的个体骨折、意外跌倒、残疾、合并症和过早死亡预后不良的风险增加。(C.Buigues等人，Effect of aPrebiotic Formulation on Frailty Syndrome:ARandomized,Double-Blind Clinical Trial,Int.J.Mol.Sci.2016,17,932)。另外，患有衰弱的个体的医疗保健支出更高的发生率也增加。(同上。)

衰弱的常见症状可通过某些类型的测试来确定。例如，无意识的体重减轻涉及至少10磅或高于前一年体重的5％的减轻；肌无力可以通过握力降低，为基线时最低20％来确定(根据性别和BMI调整)；身体缓慢可以基于步行15英尺的距离所需要的时间；耐力不足可以通过个体的自我疲惫报告来确定；并且身体活动量低可以使用标准化问卷来测量。(Z.Palace等人，The Frailty Syndrome,Today’s Geriatric Medicine 7(1),at 18(2014)).

在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于减缓衰老相关认知受损的进展。换言之，在通过所公开的方法进行治疗之后，个体认知能力将比通过所公开的方法治疗之前或没有治疗之前衰退更慢。在一些此类情况下，本发明的治疗方法包括测量治疗后认知衰退的进展，以及确定认知衰退的进展减少。在一些此类情况下，通过与参考，例如治疗之前个体认知衰退的速率进行比较来进行确定，例如，通过在施用本发明的血液制品之前的两个或更多个时间点之前测量认知来确定。

本发明的方法和组合物还可用于稳定个体的认知能力，例如遭受衰老相关认知衰退的个体或有遭受衰老相关认知衰退风险的个体。例如，个体可以展现出一些衰老相关的认知受损，并且在通过公开的方法治疗之后，在用公开的方法治疗之前观察到的认知受损的进展将停止。再如，个体可能有发展衰老相关认知衰退的风险(例如，个体可能年龄在50岁或以上，或者可能已被诊断患有衰老相关病症)，并且与使用所公开的方法治疗之前相比，在通过所公开的方法进行治疗之后，个体的认知能力基本上没有变化，即，无法检测到认知衰退。

本发明的方法和组合物也可用于减少遭受衰老相关认知受损的个体的认知受损。换言之，通过本发明的方法治疗后个体的认知能力得到改善。例如，相对于在用本发明的方法治疗之前在个体中观察到的认知能力，在用本发明的方法治疗之后，个体的认知能力增加，例如，2倍或更多，5倍或更多，10倍或更多，15倍或更多，20倍或更多，30倍或更多或40倍或更多，包括50倍或更多，60倍或更多，70倍或更多，80倍或更多，90倍或更多，或100倍或更多。在一些情况下，通过本发明的方法和组合物治疗使得遭受衰老相关认知衰退的个体的认知能力恢复，例如，达到个体约40岁或更小时的水平。换言之，认知受损消除。

14.诊断和监测神经认知相关疾病改善的方法

在一些情况下，在诊断和监测疾病进展和神经认知相关疾病的改善的各种方法中，根据需要，单独使用或与患有神经退行性疾病的受试者组合使用以下类型的评估。以下类型的方法作为示例呈现，并且不限于所述方法。根据需要，任何方便的监测疾病的方法都可用于实践本发明。本发明的方法还考虑了那些方法。

A.总体认知

本发明方法的实施方案还包括监测药物或治疗对受试者治疗认知受损和/或年龄相关性痴呆的效果的方法，该方法包括比较治疗前后的认知功能。本领域普通技术人员认识到存在评价认知功能的熟知方法。例如但不限制，该方法可以包括基于医学史、家族史评价认知功能，由专门研究痴呆和认知功能的临床医生进行身体和神经学检查，实验室试验和神经心理学评估。本发明考虑的其它实施方案包括：意识评估，诸如使用格拉斯哥昏迷量表(EMV)；精神状态检查，包括简易心理测试分数(AMTS)或简短精神状态检查(MMSE)(Folstein等人，J.Psychiatr.Res 1975；12:1289-198)；高级功能整体评估；诸如通过眼底镜检查进行的颅内压估计。

在一个实施方案中，可以使用周围神经系统检查来评价认知功能，包括以下任一项：嗅觉、视野和视敏度、眼球运动和瞳孔(交感神经和副交感神经)、面部感觉功能、面部和肩带肌肉力量、听觉、味觉、咽部运动和反射、舌头运动，其可以单独测试(例如视敏度可以通过斯内伦视力表(Snellen chart)测试；反射锤用于测试包括咬肌、肱二头肌和肱三头肌腱、膝腱、足踝反射和足底(即巴宾斯基征(Babinski sign))的反射；肌肉力量，常常按MRC量表1至5；肌肉张力和僵硬体征。

15.试剂、装置和试剂盒

还提供了用于实践一种或多种上述方法的试剂、装置和试剂盒。本发明的试剂、装置和试剂盒可以有很大变化。

目标试剂和装置包括上述关于制备包含血浆的血液制品的方法，所述血液制品用于向有需要的受试者输注，例如抗凝剂、冷冻保护剂、缓冲剂、等渗溶液等。

试剂盒还可包括采血袋、管、针、离心管等。在还有其它实施方案中，如本文所述的试剂盒包括两个或更多个血浆制品诸如血浆蛋白质级分的容器，诸如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个，包括六个或更多个血浆制品容器。在一些情况下，试剂盒中血浆制品的不同容器的数量可以是9个或更多个，12个或更多个，15个或更多个，18个或更多个，21个或更多个，24个或更多个，30个或更多个，包括36个或更多个，例如48个或更多个。每个容器可以具有与之相关联的识别信息，包括关于其中所含血浆制品的各种数据，该识别信息可以包括以下一项或多项：血浆制品的供体年龄，关于血浆制品的加工详情，例如，是否加工血浆制品以去除高于平均分子量的蛋白质(如上所述)，血型详情等。在一些情况下，试剂盒中的每个容器包括关于其中所含血浆的识别信息，并且识别信息包括关于血浆制品的供体年龄的信息，例如，识别信息提供确认血浆制品供体的年龄相关数据(其中此类识别信息可以是收获时供体的年龄)。在一些情况下，试剂盒的每个容器含有来自基本上相同年龄的供体的血浆制品，即，所有容器均包括来自如果不相同也基本上相同年龄的供体的产品。基本上相同的年龄意指从中获得试剂盒的血浆制品的各个供体在一些情况下各自相差5岁或更少，诸如4岁或更少，例如3岁或更少，包括2岁或更少，诸如1岁或更少，例如9岁或更少，6个月或更少，3个月或更少，包括1个月或更少。识别信息可以存在于容器的任何方便组件上，诸如标签、RFID芯片等。根据需要，识别信息可以是人类可读的、计算机可读的等。容器可以具有任何方便的配置。虽然容器的体积可以变化，但在一些情况下，体积范围为10ml至5000mL，诸如25mL至2500mL，例如50ml至1000mL，包括100mL至500mL。容器可以是刚性或柔性的，并且可由任何方便的材料制成，例如聚合材料，包括医用级塑料材料。在某些情况下，容器具有包或袋配置。除容器外，此类试剂盒还可包括施用装置，例如，如上所述。此类试剂盒的组件可以以任何合适的包装提供，例如盒子或类似结构，配置成容纳容器和其它套件组件。

除了上述组分之外，本发明试剂盒还将包括用于实践本发明方法的说明书。这些说明书可以呈各种形式存在于本试剂盒中，其中试剂盒中可以存在一种或多种形式。这些说明书可以存在的一种形式是作为合适介质或衬底上的印制信息，例如将信息打印在上面的一张或多张纸，在试剂盒的包装内，在包装插页上等。另一种方式是计算机可读介质，例如磁盘、CD、便携闪存驱动器等，其上已经记录有信息。可能存在的另一种方式是网址，其可以经由因特网用于访问远离站点的信息。试剂盒中可以存在任何方便的方式。

16.实验程序

提出下列实施例以便为本领域的普通技术人员提供如何制作和使用本发明的完整公开内容和描述，并非旨在表示以下实验是进行的全部或唯一实验。已努力确保有关所用数字(例如量、温度等)的准确性，但应对一些实验误差和偏差进行说明。除非另有说明，否则份为重量份，分子量为重均分子量，温度是以摄氏度计且压力为大气压或接近大气压。

分子和细胞生物化学中的一般方法可以在诸如以下的标准教科书中找到Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版(Sambrook等人，HaRBor LaboratoryPress 2001)；Short Protocols in Molecular Biology，第4版(Ausubel等人编辑，JohnWiley&Sons 1999)；Protein Methods(Bollag等人，John Wiley&Sons 1996)；NonviralVectors for Gene Therapy(Wagner等人编辑，Academic Press 1999)；Viral Vectors(Kaplift&Loewy编辑，Academic Press 1995；Immunology Methods Manual(I.Lefkovits编辑，Academic Press 1997)；及Cell and Tissue Culture:Laboratory Precedures inBiotechnology(Doyle&Griffiths,John Wiley&Sons 1998)，其公开内容通过引用并入本文。本公开中提到的用于遗传操作的试剂、克隆载体和试剂盒可从商业供应商获得，诸如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和Clontech。

A.材料和试剂。

USP盐水购自Hospira(Lake Forest,IL)。用27.5G或30G针头进行注射，每次注射体积为150μL。将可商购的PPF(“PPF1”)诸如上述那些商业PPF制剂于5％溶液中储存在4℃下。将可商购的HAS(“HAS1”)诸如上述那些商业HAS制剂于5％溶液中储存在4℃下。

B.动物供给和饲养。

使用小鼠品系NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl(“NODscid,”品系代码394，CharlesRiver,MA)(Bosma,M.等人,The scid mouse mutant.137Curr Top Microbiol Immunol197(1988))和NOD scid gamma(“NSG,”品系代码005557，The Jackson Laboratory,BarHarbor,ME)。每只小鼠都耳朵打孔以指定唯一标识号。所有小鼠在12小时光照、12小时黑暗循环下在无特定病原体条件下单独饲养，并且所有动物处理和使用均符合IACUC批准的标准指南。

C.施用。

除非下文有不同的描述，NSG和NODscid小鼠通过静脉内尾静脉注射每周两次注射USP盐水、5％ PPF1或5％ HAS1(每次注射150μL)长达6个月。

D.旷场

利用旷场试验来确定受试小鼠的探索行为。旷场试验是一个空的测试场所，通常为圆形或正方形。将小鼠置于50cm x 50cm旷场场所内15分钟并测量小鼠的活动水平。通过跟踪前爪处于盒壁上的持续时间来测量饲养时间。还在测试持续时间内测量了总覆盖距离和速度。用CleverSys TopScan V3.0(Reston,VA)跟踪旷场中的小鼠行为。通过CleverSys构建旷场腔室。

E.Y型迷宫

使小鼠探索Y型迷宫的两条臂(开始+熟悉)5分钟。一小时后，使小鼠探索所有三条臂，并记录进入臂中的总时间和次数。

F.巴恩斯迷宫

在改良的巴恩斯迷宫中连续四天训练小鼠并且给予最多120秒来找到逃逸孔洞。(参见Barnes,C.A.,Memory deficits associated with senescence:Aneurophysiological and behavioral study in the rat,J.Comparative andPhysiological Psychology,93(1):74-104(1979)；并且对于改良迷宫，参见Faizi,M.等人，Thy1-Happ(Lond/Swe+)mouse model of Alzheimer’s disease displays broadbehavioral deficits in sensorimotor,cognitive and social function.,BrainBehav.2(2):142-54,(2012))。在训练日的四次试验中，逃逸孔洞保持不变，但在训练日间隔改变。在四个单独的训练日记录每个小鼠群组到达逃逸孔洞的潜伏期。

G.DCX-和Ki67-阳性细胞

双皮质素(DCX)是一种由神经元前体细胞表达的微管相关蛋白。它也由胚胎和成人皮质结构中的未成熟神经元表达。当它们活跃分裂时，神经元前体细胞表达DCX。两周后蛋白质下调。由于这种关联，它可用作神经发生的标志物。

脑组织处理和免疫组织化学是在自由浮动切片上进行的充分描述的技术(Luo,J.等人，Glia-dependent TGF-b signaling,acting independently of the TH17pathway,is critical for initiation of murine autoimmune encephalomyelitis.J.Clin.Invest.117,3306-3315(2007))。将小鼠麻醉并灌注0.9％盐水。取出脑部，随后用磷酸盐缓冲的4％多聚甲醛(pH 7.4)在4℃下固定，然后通过30％蔗糖沉降进行冷冻保护。随后在-22℃下用低温切片机将脑部按30μm切片。将切片储存在细胞保护介质中。使用的一抗是山羊抗Dcx(Santa Cruz Biotechnology，每周两次的给药实验为1:500或每周三次的给药实验为1:200)或兔抗Ki67(1:500Abcam)。使用生物素化二抗和ABCkit(Vector)与二氨基联苯胺(DAB，Sigma-Aldrich)或荧光偶联二抗显示一抗染色。为了估计每个齿状回的Dcx阳性细胞的总数，在通过海马的三个冠状半脑切片中对齿状回的颗粒细胞和颗粒下细胞层中的免疫阳性细胞计数并取平均值。

H.用幼龄血浆、流出物I或流出物II/III处理的老龄NSG小鼠的巴恩斯迷宫测试

将老龄NSG小鼠(12月龄)分成几组(均为n＝14)，并在开始行为测试之前通过尾静脉注射接受150μL盐水、幼龄血浆、流出物I或流出物II/III。将每个单独的组分成3个群组，每个群组在不同的周开始行为测试。

I.在每周用幼龄血浆或PPF1处理三次的老龄NSG小鼠中的巴恩斯迷宫和细胞存活(BrdU染色)

老龄(12个月)雄性NSG小鼠通过尾静脉注射用150μL澄清的年轻人血浆(幼龄血浆)、PPF1或盐水经静脉内处理，每周三次，持续四周。在第5周和第6周(这是行为测试周)，该方案改为每周两次。

在处理之前，将小鼠分成三个群组，各13-15只小鼠。如上所述，在开始幼龄血浆、PPF1或盐水处理之前，每个群组经腹膜内(i.p.)进行5天BrdU注射。

在第5周和第6周期间，进行行为测试，并且在巴恩斯迷宫测试中测量每只小鼠到达目标孔洞的潜伏期。每个测试阶段持续最多120秒。使用软件记录找到目标孔洞的事件，该软件确定小鼠鼻子进入定义为目标孔洞的区域的时间。

在行为测试结束时，将动物处死，并使用亮视野显微镜定量每个海马的六个切片以确定齿状回颗粒细胞层内BrdU阳性细胞的存在。作为遍及海马不同区域的代表性切片，将BrdU阳性细胞的平均数乘以72，其为每只动物海马的切片总数，以便估计BrdU阳性细胞的总数。

J.神经球和皮质培养物测定

1.Tuj1和DAPI染色

将小鼠C57 E14,15皮质(Lonza：M-CX-300)悬浮于12ml补充有B27，2mM Glutamax(Sigma-Aldrich)的神经基础培养基中。向预先涂有胶原蛋白I(Corning,Inc.)的96孔板的每个孔中添加200μL。16小时后，用预热(37℃)对照培养基(具有B27，2mM Glutamax(Gibco)的神经基础培养基)替换平板培养基。在体外第4天(“体外天数”或“DIV”)，将培养基替换为新鲜对照培养基、对照培养基和10％PPF1，对照培养基和10％ HAS1、媒介物和10％ PPF1或媒介物和10％ HAS1。保持培养21天，每3天将75％的培养基更换为新鲜培养基。在21DIV，将培养物用PBS洗涤3次，然后在室温(RT)下用4％多聚甲醛固定20分钟。固定后，将培养物用PBS洗涤2次，然后用0.1％ Triton X100透化5-20分钟。透化后，将培养物在室温下用3％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)封闭60分钟。60分钟后，吸出封闭溶液，用抗Tuj1抗体(AbCam-1:500)在4℃标记培养物过夜。标记后，将培养物用PBS+0.1％ BSA洗涤3次，然后在4℃下用A647偶联的驴抗小鼠抗体染色过夜(1:1000)。然后用PBS洗涤培养物2次，并用Hoechst33342(1:1000)标记20分钟。在Hoechst标记后，用PBS洗涤样品3次。使用GE InCell分析仪2000(GE Healthcare Life Sciences)，使用10X放大倍数获得每个孔的二十五(25)个视野。结果示于图19中。

2.净神经突长度

如前一部分所述，从培养物中确定净神经突长度。使用由GE InCellInvestigator Developer Toolbox生成的自定义算法进行神经突分析。来自经对照和媒介物处理的样品的结果几乎相同，因此将其组合用于统计分析。结果示于图20中。

3.皮质培养球的数量和大小；嵴突(Process)长度和分支

将小鼠C57 E14,15皮质(Lonza：M-CX-300)悬浮于12mL补充有B27，2mM Glutamax(Sigma-Aldrich)的神经基础培养基中。向预先涂有聚赖氨酸和层粘蛋白的96孔板的每个孔中添加200μL。四天后，将50％的培养基更换为新鲜培养基并用测试物(媒介物、PPF1或HAS1)处理，达到10％的最终浓度。三天后重复这一过程。在处理第7天，用IncuCyte(AnnArbor,MI)以10X放大倍数对细胞进行相衬成像，并用标准“Neurite和Cell-Body”算法分析。分析六次重复，每次重复拍摄四张图像。显示标准误差。显示双尾T检验的显著性为P<0.5。结果显示在图21和22中。

4.Sox2神经球染色

将小鼠C57 E14,15皮质神经元(Lonza：M-CX-300)按100-200K细胞/ml悬浮于补充有B27，2mM Glutamax(Sigma-Aldrich)的神经基质培养基中。向预先涂有胶原蛋白I(Corning,Inc.)的96孔板的每个孔中添加200μL。16小时后，用预热(37℃)对照培养基(具有B27，2mM Glutamax(Gibco)的神经基础培养基)替换平板培养基。在体外第4天(“体外天数”或“DIV”)，将培养基替换为新鲜对照培养基、含有HAS媒介物(媒介物)的对照培养基、对照培养基和10％PPF1、对照培养基和10％ HAS1。保持培养21天，每3-4天将75％的培养基更换为新鲜培养基。在21DIV，将培养物用PBS洗涤3次，然后在室温(RT)下用4％多聚甲醛固定20分钟。固定后，将培养物用PBS洗涤2次，然后用0.1％ Triton 100X透化5-20分钟。透化后，将培养物在室温下用3％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)封闭60分钟。60分钟后，吸出封闭溶液，用抗Tuj1抗体(AbCam-1:500)和兔抗SOX2(AbCam：1:5000)在4℃标记培养物过夜。标记后，将培养物用PBS+0.1％ BSA洗涤3次，然后用驴抗小鼠-647(AbCam)和绵羊抗兔-德克萨斯红在4℃下染色过夜(1:1000)。然后用PBS洗涤培养物2次，并用Hoechst(1:1000)标记20分钟。在Hoechst标记后，用PBS洗涤样品3次。使用InCell分析仪2000(GE HealthcareLife Sciences)的10X放大倍数获得每个孔的二十五(20或25)个视野。使用GE InCellInvestigator Developer Toolbox生成的自定义算法完成神经球和神经突分析。来自经对照和媒介物处理的样品的结果几乎相同，因此将其组合用于统计分析。结果显示在图23中。

K.体内实验结果

1.用3月龄和13月龄NSG小鼠进行旷场试验

将3月龄(幼龄)或13月龄(老龄)NSG小鼠置于旷场腔室中15分钟。测量了饲养时间(图1)、速度(图2)和距离(图3)。图1显示13月龄小鼠比3月龄小鼠花费更少的时间饲养，但PPF1和HAS1处理的小鼠与幼龄小鼠没有显著差异。图2显示盐水(对照)和PPF1处理的13月龄小鼠显著慢于3月龄小鼠。然而，HAS1处理的小鼠显著快于盐水处理的小鼠，并且与幼龄小鼠没有显著差异。图3显示盐水(对照)和HAS1处理的老鼠比幼龄小鼠具有更少的运动活性，并且PPF1处理的小鼠比盐水处理的小鼠覆盖更多的距离。显示的所有数据均为平均值±s.e.m；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；t检验；n＝20、18、18、19。(SAL＝盐水)。

2.用3月龄和13月龄NSG小鼠进行Y型迷宫测试

在暗示性Y型迷宫中测试幼龄(3月龄)和老龄(13月龄)的NSG小鼠作为记忆测试。图4显示所有小鼠在新(N)臂中花费的时间明显多于熟悉(F)臂。图5显示，与幼龄小鼠相比，经HAS1处理的老龄小鼠对于熟悉臂的记忆显著受损，而经PPF1处理的小鼠趋向于对熟悉臂的记忆改善。图6显示经盐水和PPF1处理而非HAS1处理的老龄小鼠，显著慢于幼龄小鼠。图7显示经盐水和PPF1处理而非HAS1处理的老龄小鼠，比幼龄小鼠覆盖的距离更小。显示的所有数据均为平均值±s.e.m；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；配对t检验；n＝20、18、18、19。(SAL＝盐水)。

3.用3月龄和13月龄NSG小鼠进行条件性恐惧记忆测试

在条件性恐惧记忆测试中测试幼龄(3月龄)和老龄(13月龄)NSG小鼠。图8A显示13月龄小鼠趋向于比3月龄小鼠僵直花费更少的时间，而经HAS1处理的小鼠僵直花费几乎与3月龄小鼠一样多的时间。图8B显示在对听觉暗示记忆的暗示性测试中，经对照处理的13月龄小鼠表现最差并且僵直时间最短。经HAS1处理的小鼠趋向于僵直花费更多的时间，表明对音色的记忆得到改善。图9显示了暗示性记忆测试最后90秒的量化，并且显示经HAS1处理的小鼠趋向于僵直花费更多的时间，表明记忆改善。n＝20、16、17、19。(SAL＝盐水)。

4.用3月龄和13月龄NSG小鼠进行巴恩斯迷宫空间记忆测试

在巴恩斯迷宫空间记忆测试中测试幼龄(3月龄)和老龄(13月龄)NSG小鼠。图10A显示3月龄小鼠表现最好，并且在最后一次试验中到达目标孔洞的潜伏期最快。图10B显示了最后3次试验平均值的量化，这些试验证明与幼龄小鼠相比，经盐水和HAS1处理的老龄小鼠对目标孔洞的记忆显著受损，但经PPF1处理的小鼠与幼龄小鼠没有显著差异。**P<0.01；***P<0.001；非配对t检验；n＝20、18、18、19。(SAL＝盐水)。

5.用3月龄和13月龄NSG小鼠进行免疫染色

将脑切片对双皮质素(Dcx)或Ki67进行染色，在每周两次用盐水、PPF1或HAS1处理的3月龄和13月龄NSG小鼠中，双皮质素是新生神经元的标志物，Ki67是增殖细胞的标志物。在幼龄和老龄NSG小鼠的齿状回中对Dcx-和Ki67-阳性细胞计数。图11A和11B分别显示所有老龄小鼠具有显著较低数量的Dcx-或Ki67-阳性细胞。与盐水处理的小鼠相比，经PPF1和HAS1处理的小鼠趋向于Dcx-和Ki67-阳性细胞数量增加。

6.用PPF1和HAS1每周处理三次的3月龄和13月龄NSG小鼠进行免疫染色

将脑切片对双皮质素(Dcx)或Ki67进行染色，在13月龄小鼠中，双皮质素是新生神经元的标志物，Ki67是增殖细胞的标志物。每周用盐水、PPF1、1X浓HAS1或5X浓HAS1处理小鼠三次。在齿状回中对Dcx-和Ki67-阳性细胞计数。图12显示，与盐水对照处理的动物相比，用PPF1处理的小鼠趋向于神经发生增加(如Dcx染色所示)。还显示与盐水处理的动物相比，更浓的HAS1倾向于神经发生增加。

图13显示，与盐水对照处理的动物相比，用PPF1处理的小鼠的细胞增殖显著增加(如Ki67染色所示)。还显示与盐水处理的动物相比，更浓的HAS1倾向于神经发生增加。*P<0.05；对盐水组进行非配对t检验；显示的所有数据均为平均值±s.e.m。

7.用NODscid小鼠进行旷场试验

NODscid小鼠从6月龄开始每周两次通过静脉内尾静脉注射用盐水或PPF1处理。每个组的小鼠起始数量为20只。将小鼠置于旷场腔室中15分钟并记录运动活性。图14A显示与盐水处理的小鼠相比，PPF1处理的小鼠趋向于饲养活动增加。图14B和14C分别显示与盐水处理的小鼠相比，PPF1处理的小鼠也趋向于速度和覆盖距离改善。

8.用幼龄血浆、流出物I和流出物II/III处理的老龄(12月龄)NSG小鼠的巴恩斯迷宫测试

将老龄NSG小鼠(12月龄)分成几组(大小均为n＝14)，并在开始行为测试之前通过尾静脉注射接受150μL盐水、幼龄血浆、流出物I或流出物II/III。将每个单独的组进一步分成3个群组，每个群组在不同的周开始行为测试。在改良的巴恩斯迷宫(如上所述)中对小鼠进行测试以评估空间学习和记忆。图15显示用幼龄血浆、流出物I或流出物II/III进行处理趋向于显著改善老龄NSG小鼠到达目标孔洞的潜伏期。

9.用幼龄血浆和PPF1处理的老龄NSG小鼠的巴恩斯迷宫和细胞存活测试

如上所述，老龄雄性NSG小鼠(12月龄)用150μL澄清的幼龄人血浆(幼龄血浆)、PPF1或盐水处理，每周三次(i.v.)，持续4周，然后在第5周和第6周每周处理两次，第5周和第6周是进行测试的几周。

图16报告了每个处理群组到达巴恩斯迷宫孔洞的潜伏期。与对照相比，用PPF1处理显著改善了老龄小鼠的空间记忆，而与对照相比，用幼龄血浆处理倾向于改善空间记忆。(n：盐水＝12，PPF1＝14，幼龄血浆＝11)。*P<0.05；平均值±s.e.m；非配对T检验。

图17报告了每天测试最后三次试验找到目标孔洞的平均潜伏期。同样，与对照相比，用PPF1处理显著改善了老龄小鼠的空间记忆，而与对照相比，用幼龄血浆处理倾向于改善空间记忆。*P<0.05；平均值±s.e.m；非配对T检验。

图18报告了幼龄人血浆和PPF1对细胞存活的影响，如通过老龄(12个月)NSG小鼠齿状回的颗粒层内的BrdU阳性标记细胞(即增殖细胞)的数量所确定的。如上所述，在开始静脉注射幼龄血浆、PPF1或盐水对照之前，施用BrdU五天(腹膜内)。与盐水对照相比，在幼龄人血浆和PPF1处理的小鼠中均观察到细胞存活的显著增加。在PPF1和幼龄人血浆之间使用单因素ANOVA和Dunnett多重比较事后分析来测定与盐水处理相比的统计学显著性。(n：盐水＝13；PPF1＝13；幼龄血浆＝11，****P>0.0001，PPF1或幼龄人血浆与盐水处理之间的非配对T检验)。

L.体外神经球和皮质培养测定的结果

图19显示PPF1和HAS1差异性调节皮质培养物中的神经球增殖。将来自E14-15 C57小鼠的皮质在胶原蛋白I涂覆的96孔板上在含有单独媒介物、PPF1(10％)或HAS1(10％)的培养基中培养。显示了体外21天后来自皮质培养物的神经球的示例图像，其是针对Tuj1(神经元特异性III类β-微管蛋白)、DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)或TuJ1和DAPI两者成像的。图19显示PPF1增加了表达Tuj1或DAPI的神经球的量。Tuj1表达的增加证明PPF1处理的皮质培养物产生更多的神经球，其已经分化成更像神经元的表型。

图20描绘了C57小鼠E14-15皮质神经元(Lonza：M-CX-300)的三种培养物，其按100-200K细胞/mL悬浮在补充有B27，2mM Glutamax(Sigma-Aldrich)的神经基础培养基中，涂覆于经胶原蛋白I涂覆的96孔板上含有媒介物、PPF1(10％)或HAS1(10％)的培养基中。与对照或HAS1处理的培养物相比，在PPF1处理的培养物中出现指示神经发生的净神经突长度。

图21描绘了C57小鼠E14-15皮质神经元(Lonza：M-CX-300)的三种培养物，其按100-200K细胞/mL悬浮在补充有B27，2mM Glutamax(Sigma-Aldrich)的神经基础培养基中，涂覆于经胶原蛋白I涂覆的96孔板上含有媒介物、PPF1(10％)或HAS1(10％)的培养基中。可从Essen BioSciences(Ann Arbor,MI)获得的IncuCyte软件算法检测皮质培养球(以黄色突出显示)和嵴突(以粉色突出显示)。在PPF1处理的培养物中观察到更多的球体和嵴突，并且在PPF1处理的培养物中也观察到增加的球体尺寸和嵴突分支。比例尺各为300μm。

图22.图22A-D分别报告了球体数量、嵴突长度、嵴突分支点和球体尺寸。使用可从Essen BioSciences(Ann Arbor,MI)获得的IncuCyte软件算法进行定量。显示标准误差。使用双尾T检验显示显著性。图22A显示与载体或HAS1处理的培养物相比，PPF1处理的培养物的球体数量增加。(P＝0.0006，PPF1 vs.媒介物；P＝0.0007，PPF1 vs.HAS1)。图22B显示与媒介物或HAS1处理的培养物相比，PPF1处理的培养物显示出嵴突长度增加。(P＝4e

图23显示了Sox2染色阳性的神经球的数量，Sox2是一种在维持胚胎和神经干细胞中起重要作用的转录因子。使用GE InCell Investigator Toolbox算法进行定量。PPF1处理的培养物产生显著增加的Sox2染色阳性的神经球数量，表明PPF1处理与具有神经发生潜力的细胞数量的增加相关。

前面仅说明了本发明的原理。应当认识到，本领域技术人员将能够设计各种排列，这些排列虽然未在本文中明确描述或示出，但体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外，本文叙述的所有实例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为增进本领域所贡献的概念，并且应被解释为不限于此类具体叙述的实例和条件。而且，本文中叙述本发明的原理、方面和实施方案及其具体实例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物。另外，其意图是此类等同物包括当前已知的等同物和未来开发的等同物，即开发的执行相同功能的任何元件，而不管结构如何。因此，本发明的范围并非旨在限于本文示出和描述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。