一种适用于预防乳腺癌的食用调和油及其应用

技术领域

本发明属于特殊医学用途配方食品技术领域，具体涉及到一种适用于预防乳腺癌的食用调和油及其应用。

背景技术

乳腺癌(Breast Cancer,BC)是发生于乳腺上皮或导管上皮的恶性肿瘤，世界女性最常见的恶性肿瘤之一。根据基因表达谱的差异把乳腺癌分为LuminalA、LuminalB、HER-2过表达和basal-like型。

目前，每年全球乳腺癌新增病例高达170万，发病率约占全身恶性肿瘤十分之一，是妇女恶性肿瘤发病之首。乳腺癌的发病机制至今不明，从大量研究可以总结出乳腺癌的发病涉及到多种原因，其中饮食习惯对乳腺癌的发生发展有着极为深远的影响。

橄榄油是地中海饮食的主要组成部分，由于特级初榨橄榄油富含酚类物质和单不饱和脂肪酸，经常食用可以降低乳腺癌的患病风险。一些长期饮食干预对乳腺癌发病率影响的随机临床试验，研究结果表明地中海饮食补充特级初榨橄榄油对乳腺癌的一级预防是有益的。刺激醛、羟基酪醇、橄榄苦苷具有强抗氧化性的多酚类化合物，具有良好的生物学效应，作为橄榄油中重要的酚类物质在预防和治疗乳腺癌肿瘤疾病方面发挥着重要的作用。

已有大量研究表明亚麻籽油中的亚麻酸、鱼油中的w-3脂肪酸、香榧籽油中的紫杉醇通过抑制乳腺癌细胞迁移侵袭能力的相关信号通路对乳腺癌细胞系恶性生物学行为有抑制作用。

因此，从膳食来源的脂质方面出发制备一种食用调和油，既能够在预防和/或延缓乳腺癌(Breast Cancer,BC)复发的方面发挥根本上的作用，同时，也不会给乳腺癌患者(Breast Cancer,BC)带来任何潜在的安全隐患，并且，成本低廉易获得。

目前，国内市场上针对乳腺癌病人的专用营养配方正处于研发的初级阶段，针对预防乳腺癌的脂肪的摄入量及种类的限定较为粗略。

因此，结合橄榄油的脂肪酸组成和有益的功能性成分，制备一种适用于预防乳腺癌的食用调和油是本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种适用于预防乳腺癌的食用调和油。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种适用于预防乳腺癌的食用调和油，所述食用调和油，以各原料重量百分比计算，中链甘油三酯20-40％、橄榄油20-60％、鱼油5-20％、石榴籽油2-10％、香榧籽油2.5-10％和亚麻籽油5-13％；

其中，所述食用调和油中刺激醛含量为40.2-120.5mg/kg，羟基酪醇含量为77.6-232.8mg/kg，橄榄苦苷含量为180-540mg/kg，安石榴苷4.2-20.03mg/kg，鞣花酸8.01-40.2mg/kg，槲皮素7.02-35.1mg/kg，生育酚113.6-162.8mg/kg，木酚素130.7-338mg/kg。

作为本发明所述食用调和油的一种优选方案，其中：所述食用调和油中刺激醛含量为85.4±0.22mg/kg，羟基酪醇含量为164.9±0.5mg/kg，橄榄苦苷含量为382.5±3.21mg/kg，安石榴苷10.1±0.04mg/kg，鞣花酸20.3±0.06mg/kg，槲皮素17.55±0.07mg/kg，生育酚142.7±0.3mg/kg，木酚素195.4±0.22mg/kg。

作为本发明所述食用调和油的一种优选方案，其中：所述食用调和油，其中，油酸含量17％-48％、石榴酸含量1.6-8％、金松酸含量0.33-1.3％、亚麻酸含量5.8-11％、EPA含量1-4％、DHA含量0.75-3％。

作为本发明所述食用调和油的一种优选方案，其中：油酸含量38.3％、石榴酸含量4％、金松酸含量0.65％、亚麻酸含量7％、EPA含量1.5％、DHA含量1.12％。

本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种适用于预防乳腺癌的食用调和油的制备方法，包括，将食用中链甘油三酯、橄榄油、鱼油、石榴籽油、香榧籽油和亚麻籽油混合，搅拌、过滤，得到所述食用调和油。

作为本发明所述食用调和油制备方法的一种优选方案，其中：所述搅拌，其中，搅拌温度为室温，搅拌时间为20～30min，搅拌速度为60～80r/min。

作为本发明所述食用调和油制备方法的一种优选方案，其中：所述过滤为以400目网过滤。

作为本发明所述食用调和油制备方法的一种优选方案，其中：所述食用调和油，以各原料重量百分比计算，中链甘油三酯20-40％、橄榄油20-60％、鱼油5-20％、石榴籽油2-10％、香榧籽油2.5-10％和亚麻籽油5-13％。

作为本发明所述食用调和油制备方法的一种优选方案，其中：所述食用调和油中刺激醛含量为40.2-120.5mg/kg，羟基酪醇含量为77.6-232.8mg/kg，橄榄苦苷含量为180-540mg/kg，安石榴苷4.2-20.03mg/kg，鞣花酸8.01-40.2mg/kg，槲皮素7.02-35.1mg/kg，生育酚113.6-162.8mg/kg，木酚素130.7-338mg/kg。

本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种食用调和油在制备预防乳腺癌发生发展的特殊医学用途配方食品中的应用，所述乳腺癌，包括三阴性乳腺癌、三阳性乳腺癌和Her-2过表达型乳腺癌。

本发明有益效果：

(1)本发明的脂肪组件良好的脂肪酸组成可以快速的提供能量、引起活性氧(ROS)的产生，促使细胞凋亡；本发明所述的调和油中含有丰富的橄榄多酚物质，如刺激醛、羟基酪醇，橄榄苦苷等酚类物质是橄榄油中的强抗氧化剂，会自氧化生成大量活性氧，直接攻击肿瘤细胞，通过PI3K/AKT通路抑制细胞增殖,促进细胞周期阻滞,启动凋亡的发生,最终达到抑制肿瘤生长的效果；石榴籽油中的鞣花酸、安石榴苷、槲皮素均有抗肿瘤和抗菌活性。但是只有当刺激醛含量在40.2-120.5mg/kg，羟基酪醇含量在116.4-194mg/kg，橄榄苦苷含量在180-540mg/kg mg/kg，安石榴苷4.2-20.03mg/kg，鞣花酸8.01-40.2mg/kg，槲皮素7.02-35.1mg/kg，生育酚113.6-162.8mg/kg，木酚素130.7-338mg/kg范围内才能有抑制乳腺癌细胞增长，抑制细胞周期的作用；超出该范围作用效果不佳，这可能是由于在一定浓度范围内的多酚与脂肪酸的产生了协同作用，而超出该范围协同效果可能消失或产生拮抗作用从而使得抑制乳腺癌细胞生长的效果不佳。

(2)本发明所述的调和油搭配合理，易于消化吸收，具有预防和/或延缓乳腺癌复发的特点，有助于乳腺癌病人术后恢复；本发明不含有任何抗氧化剂，为纯天然的食用油调和而成。

(3)本发明可作为乳腺癌病人特殊医学用途配方食品特定全营养配方食品脂肪组件部分，也可作为乳腺癌病人非全营养配方食品营养素组中的脂肪组件，与其他特殊医学用途配方食品或普通食品配合使用；使用本发明的调和油不会给乳腺癌患者带来任何潜在的安全隐患。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明实施例中调和油对MCF-7乳腺癌细胞活性的影响图。

图2为本发明实施例中调和油对MCF-7乳腺癌细胞内活性氧(ROS)产生的影响图。

图3为本发明实施例中调和油对MCF-7乳腺癌细胞周期分布的影响图。

图4为本发明实施例中调和油对MCF-7乳腺癌细胞凋亡的影响图。

图5为本发明实施例中调和油对MCF-7乳腺癌细胞周期通路的影响图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

下述实施例中涉及的检测细胞活性的MTT试剂盒、Annexin V-FITC/PI apoptosiskit细胞凋亡试剂盒、细胞周期试剂盒，购自联科生物科技有限公司。

本发明中原料，均为普通市售产品。

本发明中各有效成分及其作用：

中链甘油三酯的可通过门静脉快速高效地为机体提供能量；橄榄油中的油酸可以增加p27Kip1蛋白(肿瘤抑制蛋白)的表达；鱼油中的w-3多不饱和脂肪酸主要通过抑制糖酵解和谷氨酰胺代谢途径激活脂肪酸氧化途径继而引起ROS的积累，促使肿瘤细胞死亡；石榴籽油可显著下调细胞中Cox-2、Bcl-2的表达水平,上调Bax、胱天蛋白酶(caspase)-3(酶解)的表达水平来促进细胞的凋亡；亚麻籽油内含的亚麻酸对乳腺癌肿瘤的自发转移也有着抑制作用。

脂肪组件中含有丰富的多酚物质，刺激醛、羟基酪醇，橄榄苦苷、安石榴苷、鞣花酸、槲皮素、生育酚等酚类物质是食用油中的强抗氧化剂，会自氧化生成大量活性氧，直接攻击肿瘤细胞，通过PI3K/AKT通路抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞周期阻滞,启动凋亡的发生,最终达到抑制肿瘤的功效。富含橄榄油的地中海饮食与乳腺癌的发生有着负相关关系，一定程度上富含橄榄油的饮食可以对乳腺癌起到一级预防的作用。

实施例1

调和油：选用优质的食用中链甘油三酯40％、初榨橄榄油20％，鱼油20％，石榴籽油2％、香榧籽油10％、精炼亚麻籽油8％加入反应釜中。

在室温25℃条件下进行混合，搅拌20min，搅拌速度为50r/min，搅拌结束后400目网过滤得到混合油，进行体外消化后得到消化产物。

实施例2

调和油：选用优质的食用中链甘油三酯40％、初榨橄榄油20％，鱼油15％，石榴籽油3％、香榧籽油9％、精炼亚麻籽油13％加入反应釜中。

在室温25℃条件下进行混合，搅拌20min，搅拌速度为50r/min，搅拌结束后400目网过滤得到混合油，进行体外消化后得到消化产物。

实施例3

调和油：选用优质的食用中链甘油三酯35％、初榨橄榄油25％，鱼油10％，石榴籽油10％、香榧籽油10％、精炼亚麻籽油10％加入反应釜中。

在室温25℃条件下进行混合，搅拌20min，搅拌速度为50r/min，搅拌结束后400目网过滤得到混合油，进行体外消化后得到消化产物。

实施例4

调和油：选用优质的食用中链甘油三酯32.5％、初榨橄榄油42.5％，鱼油7.5％，石榴籽油5％、香榧籽油5％、精炼亚麻籽油7.5％加入反应釜中。

在室温25℃条件下进行混合，搅拌20min，搅拌速度为50r/min，搅拌结束后400目网过滤得到混合油，进行体外消化后得到消化产物。

实施例5

调和油：选用优质的食用中链甘油三酯32.5％、初榨橄榄油42.5％，鱼油5％，石榴籽油7.5％、香榧籽油7.5％、精炼亚麻籽油5％加入反应釜中。

在室温25℃条件下进行混合，搅拌20min，搅拌速度为50r/min，搅拌结束后400目网过滤得到混合油，进行体外消化后得到消化产物。

实施例6

调和油：选用优质的食用中链甘油三酯20％、初榨橄榄油60％，鱼油5％，石榴籽油5％、香榧籽油5％、精炼亚麻籽油5％加入反应釜中。

在室温25℃条件下进行混合，搅拌20min，搅拌速度为50r/min，搅拌结束后400目网过滤得到混合油，进行体外消化后得到消化产物。

实施例7

调和油：选用优质的食用中链甘油三酯20％、初榨橄榄油60％，鱼油5％，石榴籽油2.5％、香榧籽油2.5％、精炼亚麻籽油10％加入反应釜中。

在室温25℃条件下进行混合，搅拌20min，搅拌速度为50r/min，搅拌结束后400目网过滤得到混合油，进行体外消化后得到消化产物。

对比例1

调和油：如实施例4，不同之处在于：其中的调和油需经硅胶柱进行处理，去除调和油中的多酚。

硅胶柱：称取50g0.5-0.75mm硅胶于125℃烘箱中活化3h，干燥器中冷却至室温；固定层析柱(Φ25mm×300mm，100mL)下端与收集器相连。采用湿法填柱子，湿法上样。

体外消化参数：将5g油与5mL猪α-淀粉酶混合，在37℃摇床中孵育5min后加入10mL模拟胃液，用盐酸调pH至3.0，加入猪胃蛋白酶，摇床孵育120min。之后加入10mL肠液和5mL胆汁盐，调pH至7.0，并补充胰酶，摇床孵育120min,得消化产物。

对所得调和油的脂肪酸组成和油脂伴随物进行检测分析，如表1-1所示。

表1-1各实施例的主要脂肪酸的百分比和微量伴随物的含量(mg/kg)

ND代表未检出

本发明体外消化实验：

乳腺癌细胞的培养：

1.复苏：将细胞冻存管从液氮罐中迅速取出，置于37℃水浴中快速解冻，补加培养基，于37℃培养箱中培养；

2.传代：细胞融合度达到90％时进行传代。

乳腺癌细胞的给药方式与剂量：

在细胞培养24h后，分别将不同实施例消化产物处理细胞24h，设置为实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例4组、实施例5组、实施例6组、实施例7组、对比例1组。

采用MTT法测定细胞存活率、流式细胞仪测定细胞周期、流式细胞仪和倒置荧光显微镜测定细胞凋亡，倒置显微镜观察细胞迁移、ROS积累情况，q-PCR定量细胞周期通路相关基因的表达。

调和油对乳腺癌细胞活性的影响：

使用96孔板、MTT试剂盒、酶标仪进行测定。

每孔接入100μL的细胞培养液(≥10000个/100μL)置于37℃培养箱中培养24h后，加入受适浓度的消化产物，继续培养24h。培养24h后，避光向各孔加入50μL的MTT溶液，孵育4h后加入150μL的DMSO,在570nm下检测吸光度。

由图1可知，实施例4、实施例5影响了细胞的存活率，使得细胞的存活率为80％左右，对乳腺癌细胞有一定的毒性作用。相比之下，实施例1组、实施例7组、对比例1组对细胞的毒性作用较小，细胞存活率为93％左右。

调和油对乳腺癌细胞内活性氧(ROS)含量的影响：

将对数期细胞铺板于黑色底96孔板，待细胞长至70％-80％，弃去培养液，用PBS清洗两次。然后设置阳性对照组以及样品组，处理6h。弃上清并用PBS清洗2次后，用DMEM稀释DCFH-DA，使终浓度10μM，处理30min后，用荧光酶标仪(SpectraMax iD5)在激发波长488nm，发射波长525nm条件下检测荧光强弱。

活性氧是需氧细胞有氧呼吸、代谢后的天然副产物，对细胞信号转导以及维持细胞内在环境的稳定有重要的影响。

实施例4能够显著提高乳腺癌细胞内ROS水平，促使肿瘤细胞死亡，同时也反映了实施例4组调和油与细胞代谢、细胞周期阻滞、细胞凋亡存在紧密联系。

实施例8

调和油对乳腺癌细胞周期的影响：

各组MCF-7乳腺癌细胞经给药24h后，加入DNA Staining solution和Permeabilization solution，室温避光孵育5min，用流式细胞仪进行检测。

由图3可知，从MCF-7细胞周期实验得到实施例4组的细胞周期主要被阻滞在了G1期，而实施例1组、对比例1组的细胞周期G2期占比高于其他实施例组，说明细胞进程快于其他实施组；实施例3组、实施例6组、实施例7组更明显地将细胞阻滞在S期，其细胞周期的阻滞效果优于实施例1、对比例1，弱于实施例4组。

上述结果表明实施例4组可以通过将细胞阻滞在G0/G1期，阻止细胞进入S期，延缓细胞的进程，从而抑制乳腺癌细胞的增殖。

调和油对乳腺癌细胞凋亡的影响：

各组乳腺癌细胞经给药24h后，AnnexinV-FITC和PI染液，涡旋振荡5-10s，混匀后，室温避光孵育30min，用流式细胞仪进行检测。

由图4可知，MCF-7流式细胞凋亡图得到实施例4组与实施例5组的早期凋亡比例最大，分别为11.5％和20.4％，而对实施例1组、实施例7组、对比例1组的早期细胞凋亡比例分别为2.22％、3.16％、2.61％。由此可以得出，实施例4组、5组能够显著地促进细胞发生早期凋亡。荧光凋亡图也可以直观的看出实施例4、实施例5能够明显的促进细胞发生早期凋亡和晚期凋亡，而实施例1组、实施例7组、对比例1组只有少数细胞被染色，对细胞凋亡的影响不显著。

调和油对乳腺癌细胞周期通路的影响：

对MCF-7细胞进行传代，培养24h待细胞稳定分别给与不同实施例和对比例的消化产物，再培养24h后消化离心收集细胞，加入细胞RNA提取试剂，进行RNA的提取。提取出的RNA经逆转录为CDNA，再对关于细胞周期的CyclinD、CyclinE、CDK2、CDK4、E2F、Rb基因进行实时荧光定量PCR。

由图5可知，以阴性对照组基因表达量1为基准，实施例3、实施例4、实施例5、实施例6的CyclinD、CyclinE、CDK2、CDK4基因的相对表达量均下调。

而实施例1组、实施例7组、对比例1组与阴性对照组没有显著性区别。CyclinD与CDK4结合调控着细胞周期的G1期，CDK2与CyclinE结合能触发细胞进入S期。在肿瘤细胞中由于自身的快速增殖，细胞周期蛋白会异常活跃，细胞周期蛋白激酶与细胞周期蛋白结合发挥活性，共同加速了细胞周期的进程，使得细胞周期变短，从而细胞增殖的时间变短。

而通过给与实施例4、实施例5组的消化产物后细胞周期蛋白与细胞周期蛋白激酶基因的表达量均显著降低，表明实施例4组、实施例5组可以抑制MCF-7细胞周期通路中相关基因的表达，从而阻滞细胞周期的进程，抑制MCF-7细胞的增殖。

Rb是一种肿瘤抑制基因，通过与转录因子E2F形成复合物控制从G1期向S期的过渡。E2F基因本身与Rb蛋白结合，在细胞周期中不发挥作用，但当CyclinD与CDK4形成复合物后会促使Rb发生磷酸化，从而释放结合的E2F，而E2F便会激活S期基因，使细胞周期前进。与对照组相比，经给药后Rb基因的表达上调，E2F的活性也降低，表明实施例4、实施例5组在抑制细胞周期进入S期中发挥了作用。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。