分离测定3-溴利福霉素S及其有关物质的HPLC方法

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种分离测定3-溴利福霉素S及其有关物质的HPLC方法。

背景技术

利福霉素类抗生素由地中海链丝菌产生的一类抗生素，它具有广谱抗菌作用，对结核杆菌、麻风杆菌、链球菌、肺炎球菌等革兰氏阳性细菌，特别是耐药性金黄色葡萄球菌的作用都很强。溴利福霉素S作为利福布汀的中间体，通常采用地中海链霉菌发酵产物利福霉素B或者发酵氧化产物利福霉素O制备而来，如：美国专利申请US3933801A公开了一种用利福霉素O制备利福霉素S的方法，利福霉素S经溴酸反应得到中间体3-溴利福霉素S。由于地中海链霉菌发酵产物中主要成分的含量仅仅在90％左右，其他成分为蛋白质、多糖等杂质，因此，这种直接由发酵产物制备而来且不具有结晶形态的利福霉素S也不可避免的含有较多的杂质，采用这种纯度不高的利福霉素S制备的下游产品(如：利福平、利福昔明、利福布丁等)，其质量较难达到药典标准要求。并且由于3-溴利福霉素是生物发酵而提纯的代谢产物进行溴代反应得到的产物，该产品很不稳定，在生产中直接向下游产品进行生产。3-溴利福霉素的结构式如式Ⅰ所示。

申请号为CN202110176443.6的发明专利公开了一种分离测定3-氨基-4-亚氨基利福霉素S及其有关杂质的方法。有关杂质包括3-氨基利福霉素S、3-溴利福霉素S、利福霉素S等。虽然该发明方法可分离测定3-溴利福霉素S，但由于3-溴利福霉素S与3-氨基-4亚氨基利福霉素S的生产工艺路线不同，3-氨基-4亚氨基利福霉素S是3-溴利福霉素S经过氨化反应产生，因此该专利与本发明的杂质情况有很大区别，采用该方法无法将3-溴利福霉素S及其8个已知杂质进行有效分离。

针对3-溴利福霉素S及其相关杂质，目前未发现有专门的分析方法，因此开发一种能够有效分离和测定3-溴利福霉素S及其相关杂质的方法，可更好地控制3-溴利福霉素S的质量。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种分离3-溴利福霉素S及其1-8种杂质的方法，该分离方法在流动相中添加三氟乙酸，可同时分离测定3-溴利福霉素S及其8个已知物质。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

分离3-溴利福霉素S及其1-8种杂质的方法，所述3-溴利福霉素S结构式如式Ⅰ所示；所述杂质包括如式Ⅱ所示的利福霉素B、如式Ⅲ所示的利福霉素SV、如式Ⅳ所示的利福霉素S、如式Ⅴ所示的利福霉素O、如式Ⅵ所示的杂质Z1B、如式Ⅶ所示的杂质Z1C、如式Ⅷ所示的杂质Z1D、如式Ⅸ所示的杂质Z1E中的任一种或多种；所述方法为：采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂为固定相，采用流动相A、流动相B进行梯度洗脱；所述流动相A为三氟乙酸和有机溶剂的混合溶液，所述流动相B为三氟乙酸和磷酸盐缓冲液的混合溶液；采用所述方法同时分离8种杂质时，在60分钟内完成分离；

其中，杂质Z1B、杂质Z1C、杂质Z1D、杂质Z1E为本专利自主命名。

进一步，所述3-溴利福霉素S的性质为酸性，流动相中添加三氟乙酸，可有效防止溴脱落。

进一步，所述有机溶剂为乙腈、甲醇和乙醇中的任一种或多种。

进一步，所述有机溶剂为乙腈和甲醇中的任一种或多种。

更进一步，所述的流动相A中有机溶剂优选为乙腈和甲醇的混合溶液，所述乙腈和所述甲醇的体积比为100-50：0-50。

更进一步，所述的流动相A中有机溶剂更优选为乙腈。

进一步，所述流动相A中三氟乙酸的浓度为0.01～0.2％；所述流动相B中三氟乙酸的浓度为0.01～0.2％。

更进一步，流动相A和B中，所述三氟乙酸的浓度优选为0.05％～0.1％。

更进一步，流动相A和B中，所述三氟乙酸的浓度更优选为0.1％。

进一步，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵中的任一种或多种。

更进一步，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾。

进一步，所述三氟乙酸和磷酸盐缓冲液的混合溶液的浓度为0.05mol/L-0.12mol/L，优选为0.1mol/L。

进一步，所述磷酸盐缓冲液pH值为2.5～10.0；调节pH值的碱溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的任一种或多种。

进一步，所述磷酸盐缓冲液pH值优选为3.5～7.0；调节pH值的碱溶液优选为氢氧化钾溶液。

更进一步，所述磷酸盐缓冲液pH值更优选为4.0～5.0。

进一步，所述的流动相A与流动相B的体积比为300-500:500-700。

进一步，所述流动相A优选为乙腈和浓度为0.1％的三氟乙酸的混合溶液；所述流动相B优选为磷酸二氢钾溶液和浓度为0.1％的三氟乙酸的混合溶液，其中，所述磷酸二氢钾溶液用2mol/L NaOH调节pH至5.0±0.1。

在选定本发明流动相之前，还采用了其他流动相，甲醇-水，乙腈-水，乙腈-磷酸二氢钠，乙腈-磷酸二氢钾，有保留，但有拖尾且与杂质分析效果不佳。采用乙腈-磷酸二氢钾(pH调为3.0)，有保留，但是分离效果不理想。经过反复试验，综合考虑选用含适量三氟乙酸磷酸缓冲盐和含适量三氟乙酸的有机溶剂的混合物作为流动相。同时，采用等度洗脱出峰有保留，时间相当长，且拖尾严重，杂质分离度不佳，因此本专利采用梯度洗脱方法进行分离。

进一步，所述梯度洗脱的程序为：

在0分钟，设置流动相A体积分数为50-70％，流动相B体积分数为30-50％；

在10-15分钟，设置流动相A体积分数为60-70％，流动相B体积分数为30-40％；

在20-30分钟，设置流动相A体积分数为60-70％，流动相B体积分数为30-40％；

在40-50分钟，设置流动相A体积分数为50-70％，流动相B体积分数为30-50％；

在50-60分钟，设置流动相A体积分数为50-70％，流动相B体积分数为30-50％。

进一步，所述梯度洗脱的程序优选为：

在0分钟，设置流动相A体积分数为60％，流动相B体积分数为40％；

在15分钟，设置流动相A体积分数为70％，流动相B体积分数为30％；

在25分钟，设置流动相A体积分数为70％，流动相B体积分数为30％；

在45分钟，设置流动相A体积分数为60％，流动相B体积分数为40％；

在55分钟，设置流动相A体积分数为60％，流动相B体积分数为40％。

进一步，所述十八烷基键合硅胶色谱柱填料的颗粒粒径为3μm-5μm，流动相的流速为0.4ml/min-0.7ml/min。

进一步，所述色谱柱的柱长为150mm-250mm，柱温为30℃-50℃。

进一步，所述进样量为10μl-20μl。

本发明的目的之二在于提供一种定性鉴别3-溴利福霉素S及其1-8种杂质的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

定性鉴别3-溴利福霉素S及其1-8种杂质的方法，利用目的一所述方法分离3-溴利福霉素S及其8种杂质利福霉素B、利福霉素SV、杂质Z1B、杂质Z1C、利福霉素S、利福霉素O、杂质Z1D、杂质Z1E中的任一种或多种；分离后，进入波长为254nm±2nm的检测器进行检测。

进一步，所述检测器的检测波长优选为254nm。

进一步，所述检测器选用紫外检测器。

进一步，将检测得到的色谱图与已知对照品色谱图进行对比，鉴定检测物中是否含有所述3-溴利福霉素S及其1-8种杂质。

进一步，分离前，配制供试品溶液、杂质对照溶液、含量对照品溶液、系统适应性溶液和/或自身对照溶液。

进一步，配置待测样品的稀释剂为有机溶剂，优选为乙腈。

进一步，样品配置方法具体如下：

(1)配制空白溶液：取稀释剂作为空白溶液；

(2)配制系统适应性溶液：取利福霉素B、利福霉素O、利福霉素SV、杂质Z1B、杂质Z1C和利福霉素S适量经乙腈溶解后放置10分钟，用稀释剂稀释制成系统适应性溶液；

(3)配制杂质对照溶液；分别取3-溴利福霉素S、利福霉素O、利福霉素S、利福霉素B、杂质Z1B、杂质Z1C对照品溶液适量用稀释剂稀释制成杂质对照溶液；

(4)配制含量对照品溶液：取3-溴利福霉素S对照品适量，加适量稀释剂溶解并用稀释剂稀释制成3-溴利福霉素S对照品溶液；得含量对照品溶液；

(5)配制供试品溶液：取3-溴利福霉素S供试品经稀释剂溶解后用稀释剂稀释制成供试品溶液；

(6)自身对照溶液：移取1ml供试品溶液，用稀释剂稀释至100ml，即得自身对照溶液；

进一步，所述供试品溶液浓度为0.1mg/ml～1mg/ml，优选为0.4mg/ml。

进一步，若保留时间为5.816±1min，判定为含有杂质Z1D；若保留时间为8.464±1min，判定为含有利福霉素B；若保留时间为9.108±1min，判定为含有杂质Z1E；若保留时间为10.736±1min，判定为含有利福霉素SV；若保留时间为14.597±1min，判定为含有杂质Z1C；若保留时间为20.426±1min，判定为含有杂质Z1B；若保留时间为25.436±1min，判定为含有3-溴利福霉素S；若保留时间为27.063±1min，判定为含有利福霉素S；若保留时间为28.365±1min，判定为含有利福霉素O。

本发明的目的之三在于提供一种定量测定3-溴利福霉素S及其1-8种杂质的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

定量测定3-溴利福霉素S及其1-8种杂质的方法，包括以下步骤：

(1)分离：采用目的一所述方法分离3-溴利福霉素S及其8种杂质中的任一种或多种；

(2)定性鉴定：利用目的二所述方法定量鉴别3-溴利福霉素S及其8种杂质中的任一种或多种；

(3)计算含量：根据步骤(2)检测得到的所述3-溴利福霉素S和/或其任一杂质的峰面积，采用外标法计算3-溴利福霉素S的含量；采用加校正因子的主成分自身对照法计算供试品中利福霉素S、利福霉素B、利福霉素SV、利福霉素O、杂质Z1B、杂质Z1C的含量，采用不加校正因子的主成分自身对照法计算杂质Z1D、杂质Z1E和其它单个杂质的含量。

外标法计算3-溴利福霉素S的含量的公式如下：

式中：

m

A

A

m

LOD——供试品的干燥失重，％；

P

加校正因子/不加校正因子的主成分自身对照法的杂质含量的公式如下：

式中：

Ax——供试品溶液杂质峰峰响应值；

Ad——自身对照品溶液中主峰峰响应值；

RRF——杂质的校正因子，无校正因子的按照校正因子1.0计算。

具体为：分别取空白溶液、系统适应性溶液、杂质对照品溶液、含量对照品溶液、供试品溶液进样，自身对照溶液进样，记录色谱图；确定3-溴利福霉素S以及有关物质的保留时间；其中杂质对照品溶液为计算利福霉素B、利福霉素O、利福霉素SV、杂质Z1B、杂质Z1C和利福霉素S的杂质校正因子，通过计算得到3-溴利福霉素S和/或其任一杂质的含量。

进一步，所述利福霉素S的校正因子为0.90；所述利福霉素B的校正因子为1.07；所述利福霉素SV的校正因子为0.99；所述利福霉素O的校正因子为0.89；所述杂质Z1B的校正因子为1.15；所述杂质Z1C的校正因子为1.10；所述杂质Z1D、所述杂质Z1E和所述其它单个杂质的校正因子按照1.0计算。

本发明的目的之四在于提供一种用于分离测定3-溴利福霉素S及其有关杂质的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于分离测定3-溴利福霉素S及其有关杂质的试剂盒，所述有关杂质为利福霉素B、利福霉素SV、杂质Z1B、杂质Z1C、利福霉素S、利福霉素O、杂质Z1D、杂质Z1E中的任一种或多种；所述试剂盒由试剂A、试剂B和试剂C组成；所述试剂A为三氟乙酸和乙腈的混合溶液；所述试剂B为三氟乙酸和磷酸二氢钾的混合溶液，其浓度为0.05mol/L-0.12mol/L；所述试剂C为氢氧化钾溶液；所述试剂A和试剂B中，三氟乙酸的浓度为0.01～0.2％。

在药物分析中，所称的“有关物质”是指特定药物中不是主要组成物，但与成份相关的物质。在药物合成过程中，起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等，都有可能产生有关的物质。国内外对药物的研究，可允许含有一定限量的无害或低毒性的有关物质，但对毒性较大，能危害人体健康的、无效的或者能影响药物稳定性的有关物质则必须严格控制。因此，有关物质检测是控制药品质量的重要指标。

本发明的有益效果在于：

1.本发明提供了一个测定3-溴利福霉素S含量及其有关物质的新方法。该方法能同时分离测定3-溴利福霉素S及其有关物质，利福霉素S、杂质利福霉素B、利福霉素SV、利福霉素O、杂质Z1B、杂质Z1C、杂质Z1D、杂质Z1E等杂质，提高了分离检测的效率，确保3-溴利福霉素S中间体的质量可控；

2.本发明提供的HPLC方法能同时有效分离3-溴利福霉素S及其8种有关物质，杂质峰和主峰完全分离，并且有关物质的分离度大于1.5，该方法专属性强，灵明度高，操作简单；

3.本发明提供的HPLC方法分析时间短，在60分钟内，能将多种已知杂质和主峰基线分离；

4.本发明提供的HPLC方法能对3-溴利福霉素S有关物质利福霉素B、利福霉素SV、杂质Z1B、杂质Z1C和利福霉素S进行定量，其余杂质Z1D、杂质Z1E和其他单个杂质的校正因子按照1.0计算，进而可严格控制最终产品利福布汀的质量。

附图说明

图1为采用的含适量三氟乙酸的乙腈与含适量三氟乙酸的磷酸二氢钾溶液，pH为5.0，梯度洗脱的HPLC图；

图2为采用的甲醇与缓冲盐为磷酸二氢钠水溶液，pH为5.0，等度洗脱的HPLC图；

图3为采用的乙腈与缓冲盐为磷酸二氢钾水溶液，pH为4.0，等度洗脱的HPLC图；

图4为采用的乙腈与含适量三氟乙酸的磷酸二氢钾溶液，pH为5.0，梯度洗脱的HPLC图；

图5为本发明方法空白检测的HPLC图；

图6为本发明方法测定供试品有关物质的HPLC图；

图7为本发明方法6小时测定供试品有关物质的HPLC图；

图8为本发明方法系统适应性的HPLC图；

图9为本发明方法系统适应性溶液杂质加入供试品试验的HPLC图。

具体实施方式

下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。

以下实施例中：

(1)实施例所涉及的3-溴利福霉素S标准品以及利福霉素B、利福霉素SV和利福霉素S均从市售渠道获得。3-溴利福霉素S的供试品和杂质Z1B、杂质Z1C的标准品与供试品来源均为重庆华邦胜凯制药有限公司。杂质Z1D和Z1E为配制系统适应性溶液能够生成的杂质。

(2)使用的试验仪器均为岛津高效液相色谱仪(UV检测器)。

(3)试剂及试药：乙腈(色谱级)；甲醇(色谱级)；蒸馏水；氢氧化钠(分析纯)；氢氧化钾(分析纯)；磷酸二氢钠(分析纯)；磷酸二氢钾(分析纯)；磷酸二氢铵(分析纯)；三氟乙酸(分析纯)。

(4)实施例中使用测试的样品为3-溴利福霉素S(图例中标记为Z1)、利福霉素B(图例中标记为B)、利福霉素SV(图例中标记为SV)、杂质Z1B、杂质Z1C、杂质Z1D、杂质Z1E和利福霉素S(图例中标记为S)。

实施例1

色谱条件：

色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6×250mm，5-Micron；柱温35℃；进样量为10μl；流速为0.5ml/min；样品浓度为0.4mg/ml。流动相梯度条件如表1所示：

表1.梯度洗脱条件

流动相A为三氟乙酸和乙腈的混合溶液；流动相B为三氟乙酸和磷酸二氢钾的混合溶液；pH为5.0，进行梯度洗脱。

测试样品配制和检测：以乙腈为稀释剂，配制0.4mg/ml的3-溴利福霉素S、利福霉素B、利福霉素SV、杂质Z1B、杂质Z1C和利福霉素S溶液，各取2ml于100ml容量瓶中用稀释剂定容至刻度、摇匀，放置10分钟，过滤，即得。进样并记录色谱图。检测结果如图1所示，积分结果如表2所示。

通过不同缓冲溶液的液相色谱图比较，可知当缓冲盐为磷酸二氢钾时各峰的分离效果明显。由色谱图可见当缓冲盐pH调整在4.0～5.0之间时，且流动相均含适量的三氟乙酸的梯度洗脱时，主峰与各杂质峰的分离效果能达到要求。

表2.图1积分结果表

对比例1

采用的甲醇与缓冲盐为磷酸二氢钠水溶液(50:50)混合液，用磷酸调pH为5.0作为流动相，流速1.0ml/min进行检测；其他条件同实施例1。检测结果如图2所示，积分结果如表3所示。

表3.图2积分结果表

对比例1的结果表明：该方法不能对杂质进行有效的分离，而且峰型不对称。

对比例2

采用的乙腈与缓冲盐为磷酸二氢钾水溶液(50:50)混合液，用磷酸调pH为4.0作为流动相，流速1.0ml/min进行检测，其他条件同实施例1。检测结果如图3所示，积分结果如表4所示。

对比例2的结果表明：用乙腈与磷酸二氢钾缓冲盐能改善杂质的分离效果，有效提高各杂质峰的峰型，pH值对杂质之间的分离度有影响。

表4.图3积分结果表

对比例3

采用的流动相A为乙腈与流动相B为含适量三氟乙酸的磷酸二氢钾溶液，用磷酸调流动相B的pH为5.0，梯度洗脱；其他条件同实施例1。检测结果如图4所示，积分结果如表5所示。

对比例3的结果表明：加适量三氟乙酸更利于杂质的分离，用梯度洗脱更利于杂质的分离和峰型，需要调整合适的pH，不同pH值与不同酸以及不同流动相比例会对其杂质在色谱柱上的保留时间有所不同，可利用发现的这种现象进行合理调整以便得到最佳的分析方法。

表5.图4积分结果表

实施例2.稳定性

检测采用乙腈作为稀释剂，本发明方法的供试品稳定性。供试品溶液配制及检测：称取3-溴利福霉素S适量，用稀释剂溶解并配制成0.4mg/mL的溶液，摇匀，过滤，即得。进样并记录色谱图。

实验结果：

空白试验结果如图5所示；供试品溶液放置0小时，直接进样，实验结果如图6所示，图6对应积分结果如表6所示；供试品溶液放置6小时再进样检测，试验结果如图7所示，图7对应积分结果如表7所示。由色谱图可知该稀释剂配制的溶液稳定。

表6.图6积分结果表

表7.图7积分结果表

实施例3

配置系统适应性溶液和测试溶液，将系统适应性溶液加入供试品溶液中进行检测。

测试溶液配制：精密称取各杂质标准品配制成0.4mg/ml，再移取适量于供试品溶液中，摇匀，过滤，即得。

系统适应性实验结果如图8所示；测试溶液结果如图9所示，由图9可知，在供试品中各杂质的分离效果可以达到要求。

表8.图8积分结果表

表9.图9积分结果表

实施例4.定量限和检测限

采用本发明方法检测杂质利福霉素B、利福霉素SV、杂质Z1B、杂质Z1C和利福霉素S的定量限和检测限。其中，杂质Z1D和Z1E无标准品，采用无校正因子的自身对照法计算；

各杂质定量限溶液配制：分别称取各杂质对照品，精密称量，加稀释剂乙腈稀释至合适浓度，摇匀，即得，进样并记录色谱图。

3-溴利福霉素S中各杂质的定量限结果如表10所示。杂质利福霉素B、利福霉素SV、利福霉素O、杂质Z1B、杂质Z1C和利福霉素S的测定采用的是带校正因子的主成分自照法进行计算，其校正因子如表11所示。其余已知杂质和单个杂质的校正因子按照1.0计算。

表10.定量限结果

表11.校正因子

结果表明，本发明方法以含适量三氟乙酸的有机溶剂和含适量三氟乙酸的磷酸盐的水溶液为流动相，采用梯度洗脱能有效的对3-溴利福霉素S和其杂质进行分析。