一种降解邻苯二甲酸酯的PS06828酯酶及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种降解邻苯二甲酸酯的PS06828酯酶及其应用。

背景技术

邻苯二甲酸酯(PAEs)是一种典型的合成有机类化合物，由邻苯二甲酸酐和乙醇发生脱水反应而合成。PAEs已被广泛应用于食品包装、儿童玩具、医疗设备及农业薄膜等塑料制品中，是一种常见的塑料增塑剂。长期接触PAEs可能会引起人类生殖、神经及免疫系统等的功能障碍。研究发现，人体持续暴露于某些PAEs污染中，会导致男性生殖能力下降，启动新皮层神经元凋亡，甚至导致儿童肥胖和代谢紊乱及语言发育方面迟缓等。其中邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)是塑料中常用的增塑剂，在污染源和相关环境基质中检出率最高，分别是90.28％和93.75％，而且绝大部分地区检出的DBP含量以及少部分地区DEHP含量均已超出美国PAEs相关控制标准。鉴于微生物尤其是细菌对污染物降解和污染环境修复具有污染物降解完全，处理成本低，安全性高且对环境干扰少等优点，细菌驱动的生物降解被认为是最有前途的修复策略。

在细菌降解PAEs的初始阶段，主要涉及的是细菌水解酶对PAEs酯键的催化作用。细菌酸酯包括八大家族：“true”lipase(Ⅰ)、GDSL(Ⅱ)、Family(Ⅲ)、the hormone-sensitive lipase(HSL)(Ⅳ)、FamilyⅤ～Ⅷ，其中true lipase又包括六个亚家族，且各个水解酶都具有独特的保守的功能序列模块。降解酶功能验证过程，即是降解酶这一蛋白质大分子与底物(有机污染物)小分子相互结合与互作的过程，也是当今分子生物学研究热点之一。

目前为止，多株PAEs降解菌已被全基因组测序，相关功能也得到分析注释，但这些基因的序列与功能仍需进行全面的分析和验证。近年来，基于DNA文库构建、基因组测序和宏基因组挖掘的PAE水解酶基因克隆和表征受到广泛关注。与PAEs酯键水解相关的酯酶相关研究主要集中于基因克隆和重组表达、酶活性表征、蛋白质结构分析和功能验证。但PAEs与相关酯酶的相互作用机制尚不清楚，因此酯酶的人工修饰和进化方面的研究进程受阻，也不利于酯酶在环境修复中的应用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种降解邻苯二甲酸酯的PS06828酯酶及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种编码PS06828酯酶蛋白的基因。

本发明的第二个目的是提供一种PS06828酯酶蛋白。

本发明的第三个目的是提供一种重组载体。

本发明的第四个目的是提供一种重组工程菌。

本发明的第五个目的是提供所述编码PS06828酯酶蛋白的基因在降解邻苯二甲酸酯中的应用。

本发明的第六个目的是提供所述PS06828酯酶蛋白在降解邻苯二甲酸酯中的应用。

本发明的第七个目的是提供所述重组载体在降解邻苯二甲酸酯中的应用。

本发明的第八个目的是提供所述重组工程菌在降解邻苯二甲酸酯中的应用。

本发明的第九个目的是提供一种降解邻苯二甲酸酯的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种编码PS06828酯酶蛋白的基因，所述编码PS06828酯酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种PS06828酯酶蛋白，所述PS06828酯酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种重组载体，所述重组载体中含有所述编码PS06828酯酶蛋白的基因或表达所述PS06828酯酶蛋白。

一种重组工程菌，所述重组工程菌中含有所述重组载体。

所述编码PS06828酯酶蛋白的基因在降解邻苯二甲酸酯中的应用。

优选地，所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二丁酯。

所述PS06828酯酶蛋白在降解邻苯二甲酸酯中的应用。

优选地，所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二丁酯。

所述重组载体在降解邻苯二甲酸酯中的应用。

优选地，所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二丁酯。

所述重组工程菌在降解邻苯二甲酸酯中的应用。

优选地，所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二丁酯。

一种降解邻苯二甲酸酯的方法，用所述PS06828酯酶蛋白进行降解。

优选地，所述降解邻苯二甲酸酯的方法，降解温度为25℃～35℃，降解pH为7～8，降解时间小于5min。

更优选地，所述降解邻苯二甲酸酯的方法，降解温度为30℃，降解pH为7，降解时间为5min。

优选地，所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二丁酯。

PS06828酯酶蛋白对其他PAEs都有一定的降解能力，因为水解结构一致，但具有长侧链的PAEs化合物产生的空间位阻较大，因此PS06828酯酶蛋白对不同PAEs的降解效果会有差异。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种降解邻苯二甲酸酯的PS06828酯酶及其应用。编码PS06828酯酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，PS06828酯酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。PS06828酯酶属于第VI类脂肪酶家族中的羧酸酯酶，PS06828酯酶降解DBP的动力学曲线测定结果表明该酶在5min内降解能力极强，降解率达53.35％；此外，PS06828酯酶的最适温度为30℃，25℃～35℃范围内该酶的相对活力均在45％以上，其最佳pH值为7，且在pH值为7到8范围时表现出了较高的活性(>50％)，在广泛的温度和pH值范围内具有高活性和稳定性，适宜于在复杂自然环境中的实际应用。

附图说明

图1为pET-28a(+)质粒载体图谱。

图2为Kyte&Doolittle算法对PS06828酯酶氨基酸序列和隐马氏模型法(HMM)对PS06828酯酶进行跨膜区域预测分析。其中A为基于Kyte&Doolittle算法(ProScale)的蛋白疏水性分析结果；B为PS06828酯酶的跨膜区分析。

图3为PS06828酯酶的二级结构。

图4为基于PS06828酯酶氨基酸序列的系统发育树。

图5为PS06828酯酶与第VI家族其他酯酶氨基酸多重序列比对。

图6为PS06828酯酶的同源建模。其中A为数据库中模板PA3859的三级结构，B为PS06828酯酶三级结构建模结果，C为PS06828酯酶Ramachandran评估图。

图7为PCR扩增电泳图。其中M为D2000 Marker；泳道1为pET28a质粒；泳道为PS06828基因；泳道为阳性克隆。

图8为对PS06828酯酶蛋白进行诱导分析。其中A为不同温度下对PS06828酯酶蛋白进行诱导分析；B为在20℃诱导的上清液中纯化的PS06828酯酶蛋白；C为纯化的PS06828酯酶蛋白的Western Blot检测。泳道1为诱导前总蛋白；泳道2为在20℃下诱导的蛋白质上清液；泳道3为在20℃下诱导的蛋白质沉淀；泳道4为在37℃下诱导的蛋白质上清液；泳道5为在37℃下诱导的蛋白质沉淀；M为蛋白Marker。

图9为BSA标准曲线

图10为PS06828酯酶降解DBP的时间动力学测定。其中A为PS06828酯酶蛋白降解DBP的时间动力学曲线；B为温度对PS06828酯酶蛋白活性的影响；C为pH对PS06828酯酶蛋白活性的影响。

图11为PS06828酯酶的同源二聚体建模。其中A为PS06828酯酶的同源二聚体建模结果，B为Ramachandran评估图。

图12为基于Autodock对接模拟PS06828酯酶同源二聚体与DBP的互作。图A、B为DBP(红色结构式)处于蛋白结构中的位置；C为三维角度下DBP周围的关键氨基酸残基。

图13为二维角度下DBP周围的关键氨基酸残基，其中绿色虚线表示氢键及其长度。

图14为催化三联体介导PS06862酯酶水解DBP相关催化机制的推断。催化三分子氨基酸中的蓝色箭头表示亲核攻击的位点。

图15为野生型PS06828酯酶及其PS06828-Ser113突变型PS06828酯酶、PS06828-Asp166突变型PS06828酯酶、PS06828-His197突变型PS06828酯酶、PS06828-Asp167突变型PS06828酯酶、PS06828-Phe72突变型PS06828酯酶对底物DBP的催化活性。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

菌种与质粒载体：PAEs降解菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PS1，，所述铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PS1已于2021年10月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC No：62009。E.coli DH5α，E.coli BL21均购自天根生物科技(北京)有限公司；表达载体质粒pET-28a(+)为实验室保存，其载体图谱如图1所示。

主要试剂盒与酶：细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)；质粒DNA快速抽提纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)；EcoR科、Hind科限制性内切酶(NEB生物技术(北京)有限公司)；

主要试剂：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(Biosharp生物科技有限公司)；丙烯酰胺、亚甲丙烯酰胺、各类氨基酸等均由美国Sigma-Aldrich公司，其余分析纯无机试剂购自天津大茂化学试剂公司。

主要仪器：PCR仪(T100

实施例1PS06828酯酶的信息学分析

一、实验方法

对PAEs降解菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PS1的全基因组和转录组进行测序分析，挖掘出一个关键酯酶的完整基因序列，具有648个碱基，可编码215个氨基酸，命名该酯酶为PS06828。该酯酶具体的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。所述铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PS1已于2021年10月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC No：62009。

通过运用在线服务器或生物信息学相关分析程序，来预测PS06828酯酶的基本理化性质，并获得相应的结构信息。

(1)PS06828酯酶的一级、二级、三级结构预测

分别将PS06828酯酶的氨基酸序列输入ProtParam tool在线服务器、PSIPRED在线服务器和SWISS MODEL服务器，对PS06828酯酶的一级、二级及三级结构与理化性质进行预测与分析，并寻找合适的模板，最终建模生成三级结构。

(2)PS06828酯酶的分类鉴定

将PS06828酯酶氨基酸序列与先前文献报道过的经典酯酶和水解酶序列上传至ClustalX程序上进行多重比对，并将比对结果上传至MEGA 5.05程序，构建系统发育树，分析该酯酶的序列特征及所属家族分类。

二、实验结果

1、PS06828酯酶一级结构

PS06828酯酶分子式为C

表1 PS06828酯酶的氨基酸组成

利用Kyte&Doolittle算法对该酯酶氨基酸序列进行疏水性分析，结果如下图2A所示，图中疏水性和亲水性区域氨基酸分配较均匀，但是蛋白GRAVY结果为0.017，大于零，显示PS06828酯酶为疏水性蛋白。这个结果表明PS06828酯酶虽然呈现疏水性，但疏水力较弱。此外，利用在线软件TMHMM Server v.2.0，基于隐马氏模型法(HMM)对该酯酶进行跨膜区域预测，如图2B所示，未发现跨膜结构。

2、PS06828酯酶二级结构

经预测，PS06828酯酶蛋白二级结构如图3所示，结构中α-螺旋、β-折叠以及无规则卷曲的含量分别为39.07％，14.88％和46.05％。

3、PS06828酯酶的分类鉴定

PAEs的微生物降解通常始于酯键的水解，而酯酶作为关键酶参与其中。一般来说，细菌酯酶根据基本生物学特性和氨基酸序列比对分为八个家族。为查明PS06828酯酶属于哪种脂肪酶家族，通过将选定的来自八个不同家族的脂肪酶和已报道的PAEs水解酶氨基酸序列与该酯酶进行比对，并做系统发育树分析(图4)，结果表明PS06828酯酶属于第VI类脂肪酶家族。该家族酶蛋白分子量大小在23～26kDa之间，是目前已知分子量最小的酯酶家族。这类酶的活性形式一般是二聚体，其亚基有典型的α/β折叠结构以及经典的Ser-Asp-His催化三元组，其底物范围非常广泛，但目前对这类酯酶的研究还十分匮乏，其蛋白结构特征及催化机理尚未阐明。

4、PS06828酯酶的家族内同源性分析

由上述系统发育树分析可知PS06828酯酶属酯酶家族VI，因此我们选择传统的家族VI中的典型酯酶进行同源性分析。如图5所示，PS06828酯酶与其他五个来自第六家族的酯酶氨基酸序列均有“GFSQG”高度保守的五肽基序和“Ser-Asp-His”催化三联体。

5、PS06828酯酶的三级结构预测与同源建模

将PS06828酯酶的氨基酸序列上传至SWISS-MODEL蛋白结构同源建模服务器，通过序列比对，选择相似性较高的序列作为待测蛋白的模板，运用自动建模的方式对PS06828酯酶的三级结构进行预测。一般情况下，建模的目标序列与模板序列的相似性越高，其同源建模得到的结构模型越精准。因此根据模板的Blast搜索结果，PS06828酯酶与来自Pseudomonas aeruginosa的胞内羧酸酯酶PA3859的氨基酸序列相似度为61％。PA3859羧酸酯酶被报道可催化脂肪族和芳香族酯的水解，具有广泛的底物特异性，其中包括对硝基苯酯和α-萘酯，但并没有该酯酶对PAEs进行水解作用的报道。选取羧酸酯酶PA3859的晶体结构3CN7.1.A作为PS06828酯酶的结构预测模板(图6A)，利用SWISS-MODEL自动建模方法获得PS06828酯酶的三级结构(图6B)。对建模结构进行Ramachandran评估(图6C)，有96.1％的氨基酸残基二面角位于合理区域，意味该模型可靠。

实施例2 PS06828酯酶的异源表达与酶学性质

一、实验方法

(1)引物设计

在pET-28a(+)载体上选择合适的酶切位点，设计引物，引物序列见表2。

表2引物序列

(2)PCR扩增

扩大培养实施例1的PAEs降解菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PS1，用Omega基因组DNA提取试剂盒(E.Z.N.A TM Bacterial DNA Kit)提取所述铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PS1的DNA，并以此作为PCR模板，按照表3所示的PCR体系扩增PS06828酯酶基因序列，PS6838-F和PS06828-R引物序列见表2。

表3 PCR扩增反应体系

PCR扩增程序具体如下：

后将PCR产物做凝胶电泳检测，并做纯化回收，得到纯化后的PCR产物。

(3)构建重组载体

利用质粒DNA快速抽提纯化试剂盒提取pET28a质粒，使用内切酶EcoR I及Not I进行时长为4小时的酶切，其酶切体系(表4)由内切酶说明书提供，得到线性质粒。

表4质粒双酶切体系

将上述步骤(2)纯化后的PCR产物与步骤(3)线性质粒使用Infusion一步法进行连接，按照表5所示体系添加混匀后，置于37℃孵育30min，后将温度调节至80℃，反应20min，使体系内的内切酶彻底灭活。连接产物(即重组载体)保存于-20℃冰箱备用。

表5 Infusion连接反应体系

注：线性质粒和目的片段的体积根据其浓度确定，通常情况下是2μL。

(4)筛选阳性菌落

分别将步骤(3)的连接产物和空载(pET28a质粒)通过热激法转入至E.coli DH5α中，其中空载转入的设置为空白对照；加入1mLLB培养基，置于恒温摇床(37℃，200rpm)中孵育45min，使E.coli DH5α菌体复苏；将菌液离心，并将沉淀涂布于LB平板(含50μg/mL氨苄卡那霉素)上，倒置37℃培养12～16h；挑取阳性单菌落进行菌液PCR验证，体系见表6。

表6菌液PCR体系

注：引物T7与T7t序列分别为taatacgactcactatagg和gctagttattgctcagagg。

反应完毕后进行凝胶电泳跑胶，将产物条带与Marker比对，检验位置是否正确，并将转有步骤(3)的连接产物的E.coli DH5α菌落继续扩大培养后，抽提质粒，测序，测序正确的转有步骤(3)的连接产物的E.coli DH5α菌株经扩大培养后，放置-80℃冰箱备用。

(5)PS06828酯酶基因的诱导表达

将上述测序正确的转有步骤(3)的连接产物的E.coli DH5α菌株接种至50mL LB液体培养基中(1：100)，37℃，220rpm培养约3h至发酵液的OD

表7聚丙烯酰胺凝胶配方

(6)PS06828酯酶的纯化与Western Blot检测

将转有步骤(3)的连接产物的E.coli DH5α菌株的菌体用PBS溶解、冰浴超声破碎并离心收集上清液，将上清液通过镍柱进行纯化，并且对粗蛋白、洗杂流出、洗脱流出分别处理制样，得到纯化的PS06828酯酶蛋白，准备SDS-PAGE检测与Western Blot检测。WesternBlot检测步骤参见文献(Zeng X,Du H,Zhao H,et al.Insights into the bindinginteraction of substrate with catechol 2,3-dioxygenase from biophysics pointof view.Journal of Hazardous Materials,2020 391:122211.)。

(7)PS06828酯酶浓度的测定

按照SK3071非干扰型蛋白定量试剂盒说明书步骤对纯化的PS06828酯酶蛋白浓度进行测定。

(8)PS06828酯酶酶活性测定

将712μL Tris-Hcl(10m Mol/L)反应缓冲溶液、278μL邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准母液(100mg/L)以及10μL步骤(6)纯化的PS06828酯酶蛋白溶液混合均匀，得到反应混合物；将反应混合物放入恒温水浴锅中，30℃反应5min，反应完毕后，加入100μL三氯乙酸(TCA)(1mol/L)溶液终止反应，所得产物作为实验组。以添加100℃煮沸灭活处理的纯化的PS06828酯酶蛋白溶液作为空白对照组，每个处理三个重复。实验组和空白对照组的样品中DBP的提取方法及GC-MS测定条件如下：

1)DBP的提取

样品前处理的萃取方法具体如下：将20mL二氯甲烷加入到盛有培养液的培养瓶中，于室温条件下，120r/min振荡10min，使萃取剂二氯甲烷与培养瓶中剩余的DBP充分混匀；转移到分液漏斗中，静置10min后，收集下层的有机相二氯甲烷，将上层的水相再倒回原培养瓶中，反复萃取两次(二氯甲烷分别添加20mL和10mL)。将最终的有机相二氯甲烷过15cm的无水Na

2)GC-MS测定

GC-MS检测条件：色谱柱，DB-5ms；载气为高纯氦气，进样口温度为280℃，自动进样器进样；初始压力33.6kPa，流速为1.0mL/min；采用不分流进样，进样量为1.0μL。升温程序：初始温度为60℃保持1min；以60℃/min升至280℃后保持2min，再以10℃/min升至290℃，保持1min。质谱定性定量：质谱用EI离子源，温度为200℃；DBP的目标离子为149m/z，参考离子为41和150m/z，保留时间为5.393min；通过对样品与标准溶液参照目标离子、参考离子和保留时间对DBP进行定性，利用绘制的标准曲线对样品中DBP的浓度进行定量。

酶活单位(U)定义为在30℃条件下，每分钟水解1μmol DBP所需的酶量。

(9)PS06828酯酶降解DBP的时间动力学曲线测定

配置步骤(8)的反应混合物，混合均匀后，置于30℃水浴中，并分别在0、1、3、5、10、20、30和40min取样并测定样品中的DBP含量，测定方法与实施例2步骤(8)相同，每个时间点设置三个重复。最终以时间(min)为横坐标，以溶液中DBP剩余含量(mg/L)为纵坐标，绘制出PS06828酯酶降解底物DBP的时间动力学曲线。

(10)温度和pH对酶活力的影响

温度对酶活力的影响：配置步骤(8)的反应混合物，分别置于20、25、30、35、40和45℃的水浴中，反应5min后，测定溶液中DBP的含量，测定方法与实施例2步骤(8)相同，每个处理三个重复。计算不同温度下各自酶活力，酶活力计算方法与实施例2步骤(8)相同，以酶活力最高的温度处理组为100％，用相对酶活力来分析温度对PS06828酯酶酶活力的影响。

pH对酶活力的影响：将10mM/L的Tris-Hcl缓冲溶液的pH值分别调整为5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和9.0，配置步骤(8)的反应混合物，置于30℃水浴中，反应5min后，检测溶液中DBP含量，测定方法与实施例2步骤(8)相同，每个处理三个重复。计算不同pH情况下酶活力，酶活力计算方法与实施例2步骤(8)相同，以酶活力最高的温度处理组为100％，用相对酶活力来分析pH对PS06828酯酶酶活力的影响。

二、实验结果

1、重组载体的构建

阳性菌落PCR验证结果如图7所示，PCR扩增产物条带清晰且单一，与DNA Marker对比可知重组载体中插入目的片段的长度与PS06828酯酶基因大小相一致，将PCR产物测序，结果是插入目的片段序列为PS06828酯酶基因序列，证明连接产物(即重组载体)构建成功。

2、PS06828酯酶的表达与纯化

PS06828酯酶蛋白诱导表达与纯化的SDS-PAGE电泳图如图8所示，经IPTG过夜诱导下，PS06828酯酶蛋白在上清液中被表达，产生的重组蛋白大小为29kDa左右，与理论计算的重组蛋白分子量23.420KDa大体一致。其中图8A为不同温度下对PS06828酯酶蛋白进行诱导分析；图8B为在20℃诱导的上清液中纯化的PS06828酯酶蛋白。此外，通过Western Blot检测(图8C)也验证了PS06828酯酶蛋白被表达与纯化。

3、酶浓度与活力测定

按照非干扰型蛋白定量试剂盒说明书步骤，对标准品及待测样品的吸光度值进行分光光度法测定，并作标准曲线(图9)，算出纯PS06828酯酶蛋白浓度为1.08mg/mL。

4、酶学性质表征

(1)酶降解DBP动力学曲线测定

图10A显示PS06828酯酶在0～5min内对DBP降解能力极强，溶液中DBP迅速从初始浓度降至14.83(±0.84)mg/L，降解率达到53.35％；但5min之后，溶液中DBP浓度变化不显著，趋于稳定状态，说明该酶在5min后降解能力极弱，几乎没有降解能力。

(2)温度和pH对酶活性的影响

图10B显示PS06828酯酶的温度最适范围为30℃，25℃～35℃范围内该酶的相对活力均在45％以上；在20℃～30℃范围内，该酶的相对活力随着温度的增加而增加，而后迅速下降，在45℃时酶的相对活力仅为20.08％。图10C显示PS06828酯酶在pH值为7～8范围内表现出了较高的活性(>50％)，最佳pH值是7；而该酶的相对活性随着pH值进一步移至酸性或碱性末端而迅速下降。PS06828酯酶在广泛的温度和pH值范围内具有高活性和稳定性，适宜在复杂自然环境中的实际。

实施例3分子模拟与定点突变研究PS06828酯酶的催化机制

一、实验方法

(1)PS06828酯酶与DBP的分子对接

使用AutoDockTools来模拟PS06828酯酶与邻苯二甲酸二丁酯(DBP)结合过程中的分子对接情况。小分子DBP的3D结构可以在Protein Data Bank(PDB)在线网站下载获得，将PS06828酯酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)输入到Swiss-Model服务器中进行同源建模，得到的该酯酶单体结构与PDB网站中已报道的源自菌Pseudomonas aeruginosa菌株的羧酸酯酶PA3859相似度达61％(模板3CN7.1.A)，二聚体结构与源自菌Pseudomonas fluorescens的羧酸酯酶相似度达48％(模板1AUO1.B)。

分别用上述两种模板(模板3CN7.1.A和模板1AUO1.B)对PS06828酯酶进行同源建模，然后进行分子模拟对接实验：使用AutoDock软件对构建的蛋白模型进行前处理，包括去除水分子、添加氢原子和Gasteiger电荷等来获得PS06828酯酶的最佳构型。而配体DBP则通过高斯03W软件进行优化。最终将PS06828酯酶的最佳构型与优化后的配体DBP进行对接，过程中将包围PS06828酯酶的格栅x，y，z的坐标设置为

(2)定点突变

使用定点突变试剂盒进行PS06828酯酶基因的定点突变实验，分别将分子模拟结果中预测的活性位点的Ser113、Asp166、His 197、Asp167和Phe72共5个氨基酸残基突变为简单的丙氨酸(GCC)，因为丙氨酸具有不带电、疏水性和较小的空间位阻的特点，根据突变位点氨基酸不同，分别将各突变型命名为PS06828-Ser113、PS06828-Asp166、PS06828-His197、PS06828-Asp167、PS06828-Phe72，并根据突变试剂盒的操作说明以及所选的突变位点来设计引物，引物序列见表8所示。最终以实施例2步骤(3)的重组载体作为PCR扩增模板进行定点突变PCR。扩增完毕后加入DMT酶，37℃孵育1h，以消化非突变载体，测序。待确定突变成功后，将野生型和突变型的阳性载体分别转化至感受态的大肠杆菌体(E.ColiBL21)内，分别制备成PS06828酯酶野生型和突变型重组菌。将突变型重组菌进行IPTG诱导表达，菌体细胞经超声破碎获得目的蛋白，用于SDS-PAGE电泳分析。

表8 PS06828酯酶基因的定点突变位点及相关引物

(3)野生型PS06828酯酶与突变体酶催化性能研究

经诱导表达后，将突变型重组菌和野生型重组菌经细胞超声破碎获得其粗酶蛋白，随后测定野生型和各突变型重组菌的PS06828酯酶的活性。酶活性测定方法与实施例2相同，并以野生型PS06828酯酶活力为100％，突变型PS06828酯酶活力为相对酶活。

二、实验结果

催化过程中蛋白质的结构信息和构象变化是理解酶催化机理的基础。当底物与酶结合时，它成为大分子(酶-底物复合物)的组成部分。大分子构象变化的后续动力学就是催化过程本身，这将直接影响酶的催化功效。此外，这种相互作用不仅可以为酶的催化和识别过程提供一些有价值的信息，而且可以用于指导修改酶的催化特性，甚至可以用于设计和合成人工酶。

1、PS06828酯酶与DBP的分子对接模拟分析

PS06828酯酶属于酯酶VI家族，这类酶的活性形式一般是二聚体，其亚基有典型的α/β折叠结构以及经典的Ser-Asp-His催化三联体，而通过最佳模板羧酸酯酶PA3859的晶体结构3CN7.1.A构建的模型是单体结构。利用Auto dock软件对DBP与PS06828酯酶单体模型进行100次对接运行后，从能量簇分布图中选取最低自由能的结合构象作为最佳结合构象，用于PS06828酯酶和DBP相互作用的预测和分析，结果显示，虽然DBP与单体模型能够结合，但发现结合位点均远离催化三联体或者无催化三联体形成，这说明该酯酶(源自菌Pseudomonas aeruginosa菌株的羧酸酯酶PA3859)的单体可能无法催化DBP。基于此，用1AUO.1.B作为模板(序列相似度48％)重新对PS06828酯酶进行同源二聚体建模，结果如图11A所示，经Ramachandran评估(图11B)有97.89％的氨基酸残基二面角位于合理区域，说明该模型可靠性非常好。使用该酯酶(源自菌Pseudomonas fluorescens的羧酸酯酶)的二聚体模型与DBP进行分子对接模拟，在最优结合结果中发现两者能够很好的结合，其结合能为-4.03kcal/mol。

从DBP与PS06828酯酶结合的结构图(图12AB)可以看出，DBP分子与PS06828酯酶结合时，被完全包裹在蛋白二聚体中间的一个空腔中。图12C显示了DBP周围的关键氨基酸残基，由Leu22、Val57、Ile69、Phe72、Ser73、Ser113、Asp166、Asp167、Val168和His197这10个PS06828酯酶的氨基酸残基构成空腔，其中疏水氨基酸有Leu22、Val157、Ile69、Phe72和Val168共5个，占总氨基酸残基数的50％；进一步使用LIGPLOT+软件进行二维化处理，发现DBP处于催化三联体(Ser113-Asp166-His197)的核心位置，且与其中2个催化活性残基Ser113和His197形成氢键，键长分别为2.60和2.96，(图13)，有研究表明氢键的形成能够降低DBP亲水性，增加其疏水性，从而稳定DBP与酯酶结合作用力。此外，催化残基His197又与催化活性残基Asp166和周围残基Asp167形成氢键，键长分别为

2、PS06828酯酶蛋白催化DBP水解机理的推断

PS06828酯酶催化DBP水解机制(图14)：

(1)在Ser113-Asp166-His197催化三联体中，Asp166与His197以氢键结合，增加了His197中咪唑氮的pKa，使得His197可进一步将Ser113去质子化，使其羟基上的质子氢转移到His197的咪唑环上；

(2)被激活的Ser113-Oγ作为亲核基进攻DBP其中一个酯键的羰基碳原子，并使得羰基上的氧原子接受电子，构成一个四面体中间复合物；

(3)His197咪唑环上从Ser113羟基获得的质子氢转移到酯键的醇羟基上，导致酯键断裂并释放出醇部分，此时质子化的Ser113与羰基重新形成酯键，形成酰基-酶中间体；

(4)水分子进入活性中心，失去质子氢的His197咪唑环夺取水分子中的质子氢(去质子化)，使其氧原子进攻酰基-酶中间体的羰基碳原子；

(5)酰基-酶中间体的羰基碳原子被迫接受电子，再次形成另一个四面体中间复合物；

(6)His197咪唑环上从水分子获得的质子氢转移给Ser113的阴离子氧，使Ser113恢复到初始状态，同时释放出含羧基的MBP。

3、定点突变验证

由测序结果可知，分子模拟结果中预测的活性位点的Ser113、Asp166、His197、Asp167和Phe72共5个氨基酸残基被突变成功，因此成功获得了相对应的五个PS06828突变体重组质粒。

进一步将野生型与突变型PS06828酯酶对底物DBP的催化能力做了比较，发现各酶催化活性有显著差异(图15)。与野生型PS06828酯酶活性(100％)相比，PS06828-Ser113突变型PS06828酯酶相对酶活为0，完全丧失了催化能力；其他四种突变型PS06828酯酶底物催化活性均有不同程度地降低，其中PS06828-Asp166突变型PS06828酯酶(5.16828％)和PS06828-His197突变型PS06828酯酶(12.5828％)相对酶活极低，而PS06828-Asp167突变型PS06828酯酶(46.3828％)和PS06828-Phe72突变型PS06828酯酶(72.9828％)保留的相对酶活均大于45％。这一结果证实了分子对接模拟预测的结果，Ser113、Asp166和His197这三个活性位点残基在催化过程中起着决定性的作用，而残基Asp167和Phe72参与结合底物的过程。最终PS06828酯酶对DBP的催化机理成功被揭示和验证。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。