丹酚酸B在制备用于治疗心肌梗死患者PCI围术期的心肌保护作用的药物上的应用

技术领域

本发明涉及注射用丹酚酸B药物新用途，具体地涉及丹酚酸B在制备用于治疗心肌梗死患者PCI围术期的心肌保护作用的药物上的应用。

背景技术

丹酚酸B是丹参中含量最多、生物活性最强的化合物，是由三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成。药典表明该品具有活血化瘀、通经活络之功效。

心肌梗死是由于心肌持久严重缺血而引起的部分心肌坏死的病症，心肌缺血还会损害舒张功能。心肌收缩不良和舒张不良相结合，易导致心室充盈压升高，引起肺充血，还可能引起复杂的物质代谢和心肌电活动失常。

自从首次经皮穿刺桡动脉进行冠状动脉球囊成形术和支架置入术成功以来，以经桡动脉途径进行冠状动脉介入治疗(PCI)的优越性被越来越多的心脏介入医师所认识。随着PCI手术治疗的广泛开展，其并发的缺血再灌注损伤日益引起心血管科医生的重视。缺血再灌注损伤往往会引起冠脉短暂缺血甚至闭塞，导致心肌损伤，预后差。如何改善心肌梗死患者PCI围术期的心肌功能仍是需要解决的问题。

现有技术中尚未见报道丹酚酸B对心肌梗死患者PCI围术期的心肌保护的应用。

发明内容

本申请发现了丹酚酸B能够改善心肌梗死患者PCI围术期的心肌损伤，具体表现为：(1)明显减轻心肌缺血损伤，同时增加缺血再灌注犬的冠脉流量；(2)丹酚酸B可以在心肌缺血-再灌注损伤时发挥抗氧化能力，降低心脏的氧耗，增加血氧供应；(3)丹酚酸B可以在心肌缺血-再灌注损伤时调节NO/ET的平衡，有利于增加心肌供血；(4)丹酚酸B可以在心肌缺血-再灌注损伤时抑制血小板聚集；(5)丹酚酸B可以在心肌缺血-再灌注损伤时改善血液流变学特性。这些作用可以明显减轻缺血-再灌注所致的心肌病理损伤，使心肌细胞变性程度、心肌间质水肿程度及炎细胞浸润均明显减轻。因此，丹酚酸B具有一定的抗心肌缺血-再灌注损伤作用，可以改善心肌梗死患者PCI围术期的心肌损伤。

本发明为心肌梗死患者PCI围术期的心肌保护提供了一种行之有效的处理方式。

附图说明

本发明附图中，显著性标记的含义为：与模型组比较用*表示，其中*代表p<0.05，**代表p<0.01；与缺血60min比较用#表示，其中，#代表p<0.05，##代表p<0.01。

图1为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的心率(HR)的影响；

图2为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的平均动脉压(MAP)的影响；

图3为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬Σ-ST的影响；

图4为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬N-ST的影响；

图5为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的心输出量(CO)的影响；

图6为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的冠脉流量(CBF)的影响；

图7为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的每搏输出量(SV)的影响；

图8为丹酚酸B(注射)对心肌缺血-再灌注损伤犬的心脏指数的影响；

图9为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的心搏指数的影响；

图10为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的射血时间的影响；

图11为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的左室内压的影响；

图12为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的左室舒张末期压的影响；

图13为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的dp/dtmax的影响；

图14为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的左室做功指数的影响；

图15为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的总耗氧指数的影响；

图16为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的血管总外周阻力的影响；

图17为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的Po

图18为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的Pco

图19丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤120min时犬的血清CK-MB的影响；；

图20丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤120min时犬的血清cTnI的影响；

图21丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤120min时犬的血清LDH的影响；

图22丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤120min时犬的血清MDA的影响；

图23为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤120min时犬的血清SOD的影响；

图24为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的心肌组织ET浓度的影响；

图25丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的血浆ET浓度的影响；

图26为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的血清中NOS活性的影响；

图27为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的血清中NO浓度的影响；

图28为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬血浆6-Keto-PGF1α的含量的影响；

图29为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬血浆TXB2的含量的影响；

图30为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬红细胞变形能力、红细胞聚集的影响；

图31为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬血浆粘度的影响；

图32为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬全血粘度的影响；

图33丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬APTT、TT、PT的影响；

图34为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬FIB的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中使用的材料和方法如下：

材料和试剂：

丹酚酸B，南京虹桥医药技术研究所有限公司提供；肌酸激酶(CK)试剂盒，Sysmex济南希森美康医用电子有限公司产品；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒，Sysmex济南希森美康医用电子有限公司产品；ADP，中国科学院上海生物化学研究所；APTT测定试剂盒、TT测定试剂盒、FIB测定试剂盒、PT测定试剂盒、红细胞变形试剂购自北京世帝科学仪器公司；ET RIAKIT，解放军总医院科技开发中心放免所；NOS试剂盒和NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

试验分组与剂量

取Beagle犬30只，随机分为6组，每组5只动物，雌雄兼用。

(1)假手术组：给予等容积(含甘露醇6.4mg/kg)的生理盐水。

(2)模型组：给予等容积(含甘露醇6.4mg/kg)的生理盐水。

(4)丹酚酸B低剂量组：0.8mg/kg。

(5)丹酚酸B中剂量组：1.6mg/kg。

(6)丹酚酸B高剂量组：3.2mg/kg。

将各组动物所用药物溶于0.9％氯化钠注射液中，给药容积为1ml/kg。试验方法

取犬，由前肢小隐静脉用3％戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后，背位固定于手术台上，剪去颈部、胸部和左后肢内侧的毛。将针状电极插入犬四肢皮下，记录心电图(ECG)。分离气管并插入气管插管。分离左侧股动脉、股静脉，分离股静脉插入静脉插管，缓慢恒速输入生理盐水(约1ml/min)；分离股动脉插入动脉插管(管内充满500U/ml的肝素生理盐水)并接压力换能器(TP-400T)，并经放大(AP-641G)测量平均动脉压(MAP)，定标灵敏度为13.33kPa(100mmHg)/cm。联接记录仪的连线板直接由动脉压触发心率记数仪(AT-601G)记录心率(HR)。

于左侧第四、五肋间开胸，暴露心脏，并接人工呼吸机。打开心包膜，缝于胸壁，做成荷包摇篮。暴露右心耳，静注肝素5-10mg/kg使肝素化，用心耳钳夹住右心耳，作一荷包缝口，将缝线穿于一小段橡皮管内，用小钢丝将线勾入橡皮管，于荷包口中心剪一小口，迅速插入冠状窦插管(内径4-5mm，管口为斜角，近管口处为圆形膨大，斜角面避免管口与窦壁紧贴，膨大部为使冠状窦血不致外溢)，将小橡皮管内荷包缝线拉紧，靠小橡皮管顶住插管，以避免出血，迅速将插管准确插入冠状窦，结扎右心耳处荷包缝线，固定插管。该插管的远端连接三通管以备取血。用0号丝线结扎左冠状动脉前降支中下1/3处，假手术组只穿线不结扎。选择梗塞区附近位置12个标测点缝置心外膜电图电极，并在远离梗塞区选一对照点，用手持绝缘金属点状电极按标测点顺序进行标测，经传感器(JB-642G)、放大器(AB-621G)，用八道生理记录仪记录心外膜电图(EECG)(定标：1mm＝1mv)。结扎15min后经股静脉恒流泵恒速给药(1ml/min)，记录平均动脉压(MAP)、心率(HR)，并于八道生理记录仪描记EECG曲线。

记录结扎前、结扎15min和给药后1、5、10、15、30、60、90、120min的EECG、MAP、HR。统计各标测点EECG的ST段偏移Σ-ST，以及ST段抬高≥2mv以上的N-ST。各组分别于给药前和给药60min后，左心室取血测动脉血氧，冠状窦处取血测冠状窦血氧，两者氧差反映心肌耗氧；各组分别于结扎前、结扎15min、给药60min后股静脉取血，用试剂盒测定血清CK、LDH值。实验结束后，立即取出心脏，用生理盐水洗去血液后，称取全心重和心室重量，并把心室横切成5片，置于37℃1％TTC溶液中染色15min，剪去各心肌片被染色的非梗塞区，把未染色的梗塞区心肌称重，除以全心重或心室重分别得到梗塞范围占全心重或占心室重的百分率。

检测方法：

心外膜电图

选择梗塞区附近位置12个标测点缝置心外膜电图电极，并在远离梗塞区选一对照点，用手持绝缘金属点状电极按标测点顺序进行标测，经传感器(JB-642G)、放大器(AB-621G)，用八道生理记录仪记录心外膜电图(EECG)(定标：1mm＝1mv)。

结扎60min后剪开缝合线再灌注，同时经股静脉恒流泵恒速给药(1ml/min)，并于八道生理记录仪描记EECG曲线，记录心率(HR)。

记录结扎前、结扎60min和给药后15、30、60、90、120min的EECG、MAP、HR。统计各标测点EECG的ST段偏移Σ-ST，以及ST段抬高≥2mv以上的N-ST。

血流动力学指标检测

将针状电极插入犬四肢皮下，记录心电图(ECG)。待稳定后，用恒流泵经股静脉给药(1ml/min)，用BIOPAC十六道生理记录仪生物信号分析系统观察并记录心输出量(CO)、冠脉流量(CBF)，并于八道生理记录仪上描记ECG。测量并计算给药前后各时间段犬的MAP、HR、CO、CBF、LVSP、LVdp/dtmax、LVEDP、射血时间、SV(每搏输出量)、CI(心脏指数)、SI(心搏指数)、LVWI(左室作功指数)、TTI(总耗氧指数)、TPVR(总外周血管阻力)。

计算公式：

CI(心脏指数)＝CO/体表面积SV(每搏输出量)＝CO*1000/HR

SI(心搏指数)＝CI*1000/HRTTI(总耗氧指数)＝MAP*HR*射血时间

TPVR(总外周血管阻力)＝MAP/CO

LVWI(左室作功指数)＝CI*1.025*(SAP-0.667)*13.6*0.001

血氧检测

各组于给药120min后，左心室取动脉血，冠状窦处取冠状窦血，两者氧差反映心肌耗氧。用血气自动分析仪测定血氧含量，并计算动－静脉氧饱和度差。

试验结束后取血，用硫代巴比妥法(TBA)测定MDA含量，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。用考马斯亮蓝G-250测定心肌组织蛋白质的含量。操作步骤按试剂盒说明书进行。

心肌损伤酶谱检测

股静脉取血，用试剂盒测定血清CK、LDH值。

试验结束后取血，分别由Beckman DXC800全自动生化分析仪测定CK-MB、LDH含量，化学免疫发光法检测cTn-I含量。

NO、ET、6-Keto-PGF1α、TXB2检测

股静脉取血，按试剂盒说明用含10％EDTA二钠30μL和抑肽酶40μL抗凝，4℃，3000rpm离心，分离血浆，用放射免疫学的方法测定6-Keto-PGF1α、TXB2含量；取心尖部位的心肌组织制成10％的组织匀浆，用放射免疫学的方法测定心肌组织和血浆ET的浓度。

股静脉取血，分离血清，用硝酸还原酶法测定NO浓度，用化学比色法测定NOS活性。

血小板聚集率的测定

将3.8％的枸椽酸钠抗凝(1:9)的血液以800r/min离心10分钟，取富血小板血浆(PRP)，利用LG-PABER型血小板聚集及凝血因子分析仪记录最大聚集率并按下列公式计算抑制率。

红细胞聚集和变形能力的测定

将肝素(500U/ml)抗凝的血液采用LG-R-190型红细胞变形/聚集能力测定仪进行测定。

血液粘度的测定

股动脉取血，用肝素钠生理盐水溶液(500U/ml)按1:9抗凝。

全血粘度：将抗凝血采用LG-R-80系列血液粘度仪测定；

血浆粘度：全血测定完后，剩余血样以3000r/min离心，进行血浆粘度的测定。

凝血系统各项指标的测定

将血小板聚集率测定后剩余的血浆以3000r/min离心10分钟，取贫血小板血浆(PPP)，采用LG-PABER型血小板聚集及凝血因子分析仪测定凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原含量(FIB)。

心肌梗死质量百分比测定

实验结束后，立即取出心脏，用生理盐水洗去血液后，称取全心重和心室重量，并把心室横切成5片，置于37℃1％TTC溶液中染色15min，剪去各心肌片被染色的非梗塞区，把未染色的梗塞区心肌称重，除以全心重或心室重分别得到梗塞范围占全心重或占心室重的百分率。

心肌组织病理学观察

取心尖部心肌组织，10％甲醛固定，常规取材，脱水，石蜡包埋，制片(4μm厚)，HE染色，光镜观察(重点观察：心肌纤维排列情况，充血、水肿、出血、炎性细胞浸润病变，细胞核形态，胞膜形态，胞浆嗜酸性变，心肌细胞间隙及染色等)。根据病变轻重程度不同，依次标记为“-”、“+”、“++”、“+++”表示，其中“-”为无明显改变，“+++”为严重的病理改变。

统计方法

数据以均数±标准差表示

变化率(发生率)％＝(X

X

试验结果

(一)丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的HR、MAP、Σ-ST以及N-ST的影响。

图1至图4分别为丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的HR、MAP、Σ-ST以及N-ST的影响。结果表明，丹酚酸B高剂量组在给药后60-120min能显著降低心肌缺血-再灌注损伤犬心率(与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01)；丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的MAP无影响(与模型组比较，P>0.05)；丹酚酸B低、中、高剂量均可降低心肌缺血-再灌注损伤犬的Σ-ST，部分时间点与模型组比较差异显著(*p<0.05，**p<0.01)，表明丹酚酸B能明显减轻心肌缺血程度；丹酚酸B低、中、高剂量可降低心肌缺血-再灌注损伤犬的N-ST，部分时间点与模型组比较差异显著(*p<0.05，**p<0.01)，表明丹酚酸B能明显减轻心肌缺血程度。

(二)丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的血流动力学的影响。

图5-图16显示了丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的血流动力学的影响。结果表明，丹酚酸B各剂量组对心肌缺血-再灌注损伤犬的心输出量未见明显影响(与假手术组比较，p>0.05)；如图6所示(图中，与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01；与缺血60min比较，#p<0.05，##p<0.01)，模型及各治疗组在缺血60min时CBF较缺血前显著降低(P<0.01)。模型及各剂量组CBF在灌注后各时间点均高于缺血60min(p<0.01)。中剂量组在灌注120min时CBF高于模型组(与模型组比较，p<0.05)，高剂量组在灌注90和120min时CBF高于模型组(与模型组比较，#p<0.05，##p<0.01)；图7显示，丹酚酸B各剂量组对心肌缺血-再灌注损伤犬的每搏输出量(SV)未见明显影响(p>0.05)；图8-图10分别表明丹酚酸B各剂量组对心肌缺血-再灌注损伤犬的心脏指数、心搏指数、射血时间未见明显影响(p>0.05)；图11表明，除模型组外，其余各组缺血60min时LVSP较缺血前显著增高(P<0.01)；除模型组外，其余各组给药后各时间点LVSP较缺血60min未见显著变化(P>0.05)；图12表明除模型组外，其余各组缺血60min时LVEDP较缺血前显著增高(P<0.01)；除模型组外，其余各组给药后各时间点LVEDP较缺血60min未见显著变化(P>0.05)；图13表明，除模型组外，其余各组缺血60min时，心肌缺血-再灌注损伤犬的LV-dp/dtmax绝对值较缺血前显著降低(P<0.05)；其余各组给药后各时间点LV-dp/dtmax较缺血60min比较无显著变化(P＞0.05)；图14表明，除模型组外，其余各组缺血60min时左室做功指数较缺血前未见显著变化(P>0.05)；除模型组外，其余各组给药后各时间点左室做功指数较缺血60min未见显著变化(P>0.05)；图15表明除模型组外，其余各组缺血60min时总耗氧指数较缺血前显著增高(P<0.05)；高剂量组给药后60-120min总耗氧指数较缺血60min显著下降(P<0.05)；同时图16表明丹酚酸B各剂量组对心肌缺血-再灌注损伤犬的血管总外周阻力(TPVR)无影响。

(三)丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬动静脉血氧气分压(Po

图17和图18的结果表明，模型组犬心肌缺血-再灌注损伤120min时，动静脉血氧气分压(Po

(四)丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的血清心肌酶谱(CK-MB、LDH、cTnI)和抗氧化功能(MDA、SOD)的影响。

图19-图23结果表明，丹酚酸B中、高剂量可减少心肌缺血-再灌注损伤犬的血清中CK-MB、cTnI、LDH的含量，与模型组比较差异显著；丹酚酸B中剂量可减少心肌缺血-再灌注损伤犬的血清中MDA的含量，增加SOD的含量，与模型组比较差异显著。高剂量可减少心肌缺血-再灌注损伤犬的血清中MDA的含量，增加SOD的含量，与模型组比较差异显著(P<0.01)。

(五)丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的NO、ET、6-Keto-PGF1α、TXB2的影响。

图24-图29结果表明，心肌缺血-再灌注后，心肌组织和血浆ET的浓度均明显升高，与假手术组比较，有统计学意义(P<0.05)；丹酚酸B中、高剂量可显著降低由于缺血-再灌注所引起的血浆ET浓度的升高，丹酚酸B高剂量还可降低心肌组织中ET的浓度，与模型组比较，差异显著；心肌缺血-再灌注使犬血清中NOS活性和NO的释放明显减少；丹酚酸B中、高剂量均能提高NOS的活性，增加NO的释放，与模型组比较，有统计学差异；心肌缺血-再灌注使犬血浆中6-Keto-PGF1α含量下降，TXB2含量增加(P<0.05)；丹酚酸B高剂量给药60min和120min后能提高6-Keto-PGF1α含量，降低TXB2含量(P<0.01)。

(六)丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬血小板聚集率的影响。

表1显示了丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬血小板聚集率的影响。实验结果表明：心肌缺血60min，再灌注120min时，模型组血小板聚集率较之模型组显著增加(P<0.01)；丹酚酸B低、中、高剂量均可显著降低心肌缺血-再灌注损伤犬血小板聚集率，与模型组比较，有统计学差异。抑制率分别为21.24％，23.75％，25.79％。结果见表1。

表1丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬血小板聚集率的影响

与模型组比较*P<0.05，**P<0.01

(七)丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬红细胞变形能力、红细胞聚集的影响。

图30实验结果表明：模型组心肌缺血-再灌注损伤犬红细胞变形能力明显降低，聚集增加，与模型组比较差异显著；丹酚酸B中、高剂量能增强红细胞变形能力，高剂量可降低红细胞聚集，与模型组比较差异显著。

(八)丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬对全血粘度和血浆粘度的影响。

图31-32实验结果显示：模型组血浆粘度和全血粘度均明显增高；丹酚酸B高剂量可以降低低切变率(5s

(九)丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬对凝血系统的影响。

图33和图34结果表明，模型组APTT、PT时间延长，FIB含量增加，与模型组比较，有显著性差异；丹酚酸B高剂量能明显延长TT时间；中、高剂量能明显延长APTT时间，减少FIB含量，而对PT的影响不明显(P>0.05)。

(十)丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的心肌梗塞范围的影响

表2丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的心肌梗塞范围的影响(n＝5)

与模型组比较

结果显示：丹酚酸B中、高剂量可减少心肌缺血-再灌注损伤犬的梗塞范围，与模型组比较差异显著。

(十一)丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬的病理学改变的影响

假手术对照组:心肌细胞排列紧密，横纹清晰，核居中，间质未见血管扩张及炎细胞浸润,心外膜、心内膜无异常。

模型组：5例心肌细胞排列稀疏，心肌细胞纤细呈波浪状(+++)，横纹不清晰，心肌间质水肿明显(++-+++),其中3例心肌间质见少量炎细胞浸润(+)。心外膜、心内膜无异常。

丹酚酸B低剂量组：1例心肌细胞排列紧密，横纹清晰，间质未见血管扩张及炎细胞浸润；4例心肌细胞排列稀疏，横纹不清晰，心肌间质轻-重度水肿(+-+++)，其中2例心肌间质见少量炎细胞浸润(+)。心外膜、心内膜无异常。

丹酚酸B中剂量组：3例心肌细胞排列紧密，横纹清晰，间质未见血管扩张及炎细胞浸润；2例心肌细胞排列稀疏，横纹不清晰，心肌间质中度水肿(++)。心外膜、心内膜无异常。

丹酚酸B高剂量组：4例心肌细胞排列紧密，横纹清晰，间质未见血管扩张及炎细胞浸润；1例心肌细胞排列稀疏，横纹不清晰，心肌间质轻度水肿(+)。心外膜、心内膜无异常。结果见表3。

表3丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤犬心肌病理变化的影响(n＝5)

与模型组比较*P<0.05,**P<0.01。

以上结果提示，丹酚酸B对心肌缺血-再灌注损伤具有一定的保护作用。这种保护作用是多方面的，包括增加冠脉流量，抗氧化，改善血管内皮功能紊乱，抑制血小板聚集，改善血液流变学异常。这些作用可以明显减轻缺血-再灌注所致的心肌病理损伤，使心肌细胞变性程度、心肌间质水肿程度及炎细胞浸润均明显减轻。因此，丹酚酸B具有治疗心肌梗塞患者PCI围术期缺血再灌注导致心肌损伤的心肌保护作用。