基于NKA-9型大孔树脂对驱虫斑鸠菊总黄酮粗提物的纯化生产方法

技术领域

本发明涉及的是一种中草药中黄酮类化合物分离纯化技术，具体涉及一种基于均匀设计的NKA-9型大孔树脂对驱虫斑鸠菊总黄酮粗提物的纯化生产方法。

背景技术

驱虫斑鸠菊为菊科植物驱虫斑鸠菊(Vernonia anthelmintica(L.)willd)的成熟果实。具有清除异常黏液质，驱虫、消肿、散寒止痛的功效，现多用于治疗湿寒性胃痛及肝病，白癜风等疾病。驱虫斑鸠菊药材中黄酮类成分是治疗白癜风的主要活性成分，主要通过促进黑素细胞中优黑素的合成从而发挥其有效地促进黑素合成的作用。

大孔树脂是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的新型高分子材料，通过利用化合物与大孔树脂之间吸附力的不同及不同物质分子量大小的差异进行分离。与其他分离技术相比具有稳定性高、比表面积大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长等优点，被广泛用于各类天然产物的分离纯化。文献(杨科等，大孔树脂纯化驱虫斑鸠菊总黄酮的工艺研究，中成药，2013，35(10)：2268-2271)采用LS-300B大孔树脂富集驱虫斑鸠菊总黄酮成分，该方法存在周期长、成本高的问题，且纯化后驱虫斑鸠菊总黄酮的体外抗氧化作用未见报道。本发明通过对大孔树脂的筛选，并对其动力学进行研究，将均匀设计理论和单因素相结合，选取具有代表性的数据进行部分考察，将具有交互作用的因素建立相应因素水平表，最后测试驱虫斑鸠菊总黄酮回收率，从而通过较少优选次数找出最佳参数，成功将驱虫斑鸠菊总黄酮纯度提升至81.4％。体外抗氧化结果表明纯化后的驱虫斑鸠菊总黄酮对DPPH和ABTS自由基具有较强的清除作用。

发明内容

本发明目的是提供一种利用NKA-9型大孔树脂对驱虫斑鸠菊总黄酮粗提物进行纯化的生产方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明其特点在于：包括如下步骤：

步骤一：利用加热回流法对驱虫斑鸠菊药材进行总黄酮的提取；

步骤二：驱虫斑鸠菊总黄酮的纯化；

(1)对大孔吸附树脂进行预处理；

(2)大孔树脂的筛选：将步骤一中得到的驱虫斑鸠菊总黄酮粗提液加入等量预处理好的大孔吸附树脂中，取等量乙醇溶液解吸，于室温充分吸附、解吸12-24h，测定溶液吸光度。总黄酮含量采用NaNO

(3)对筛选的大孔吸附树脂进行吸附动力学模型、吸附等温线模型回归方程拟合；

(4)均匀设计与统计分析：a.依次调节上样液浓度为0.5～8.5mg/mL；上样液pH为1～8；乙醇洗脱液浓度为10％～90％；洗脱流速为0.5～3mL/min进行单因素考察，并绘制筛选树脂的动态泄露曲线与洗脱曲线，用(2)中方法测定所得驱虫斑鸠菊提取液中总黄酮含量；b.根据a.中考察结果筛选出上样液浓度、上样液pH、洗脱液浓度三因素，以总黄酮回收率为优化指标，使用均匀设计表U

步骤三：纯化后驱虫斑鸠菊总黄酮体外抗氧化作用

(1)清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基活性能力：称量驱虫斑鸠菊总黄酮提取物、纯化物和L-抗坏血酸(Vc)使其浓度呈梯度。取适量DPPH试剂，加入10～20倍量的乙醇溶液，混匀后避光保存。按比例1∶4取待测液和DPPH溶液混合，室温避光反应25～30min，测定其在517nm波长处的吸光度值，计算自由基清除率；

(2)清除2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基活性能力：将ABTS溶液与过硫酸钾溶液按比例混匀，于暗处反应14～16h得到ABTS工作液。按比例1∶9取(1)配制的梯度溶液与稀释40～50倍的ABTS工作液混合，室温避光反应8～12min，测定其在734nm波长处的吸光度值，计算自由基清除率。

步骤二中，所述的大孔吸附树脂为D101型、AB-8型、NKA型、NKA-9型、X-5型、DM130型、DM301型、LS-300型、LS-300B型号大孔树脂中的一种或几种，作为优选，所述的大孔吸附树脂为NKA-9型号的大孔吸附树脂。

本发明提供了一种利用NKA-9型大孔树脂对驱虫斑鸠菊总黄酮粗提物进行纯化的生产方法，通过设计筛选，并对吸附热力学及其动力学进行研究，采用单因素和均匀设计法相结合得到最佳工艺参数，将驱虫斑鸠菊总黄酮纯度提升至81.4％。缩短了生产周期，具有快捷、高效、经济的特点。得到了纯度高、质量稳定、抗氧化作用好的驱虫斑鸠菊总黄酮产品。

附图说明

图1为驱虫斑鸠菊总黄酮纯化生产流程图；

图2为驱虫斑鸠菊总黄酮含量测定标准曲线；

图3为驱虫斑鸠菊总黄酮在不同树脂上的吸附能力和解吸能力以及解吸率；

图4、5分别为驱虫斑鸠菊总黄酮在NKA-9树脂上的吸附拟一阶动力学和拟二阶动力学回归线；

图6为不同温度下驱虫斑鸠菊总黄酮在NKA-9树脂上的吸附曲线；

图7、8分别为不同温度下驱虫斑鸠菊总黄酮在NKA-9树脂上的Langmuir模型和Freundlich模型的线性相关关系；

图9为不同上样液浓度对驱虫斑鸠菊总黄酮吸附率的影响；

图10为不同pH对驱虫斑鸠菊总黄酮吸附率的影响；

图11为NKA-9大孔树脂动态泄露曲线；

图12为不同洗脱液浓度对驱虫斑鸠菊总黄酮解吸率的影响；

图13为不同洗脱流速对驱虫斑鸠菊总黄酮解吸率的影响；

图14为驱虫斑鸠菊总黄酮在NKA-9树脂上的洗脱曲线；

图15、16分别为驱虫斑鸠菊总黄酮清除DPPH和ABTS自由基活性测定。

从图2可以看出标准曲线具有很好的线性关系(R

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做具体的说明：

实施例1：利用加热回流法对驱虫斑鸠菊药材进行总黄酮的提取

称取驱虫斑鸠菊果实500g，加入7L 50％乙醇溶液，80℃加热回流提取3.5h，减压抽滤分离滤液和滤渣，将滤渣重复提取2次，合并上清液，减压浓缩，即得驱虫斑鸠菊总黄酮粗提物。

实施例2：驱虫斑鸠菊总黄酮的纯化

(1)大孔吸附树脂预处理：取大孔树脂，用95％乙醇溶液浸泡24h使其充分溶胀，用纯化水冲洗树脂至无醇味，接着用4％盐酸溶液浸泡4h，用纯化水冲洗树脂至中性，再用4％氢氧化钠溶液浸泡4h，用纯化水冲洗树脂至中性，吸水纸吸去树脂表面水分，备用。

(2)大孔树脂的筛选：称量0.5g预处理后的干燥树脂于具塞容器中，取0.61mg/mL的驱虫斑鸠菊总黄酮粗提物溶液50mL，于室温下以120r/min振摇12h，滤液用紫外分光光度计测定剩余黄酮含量。接着取上述吸附饱和的树脂，分别加入50mL95％乙醇溶液，同法振摇12h，使大孔树脂解吸完全，测定溶液中黄酮含量，分别计算各大孔树脂的吸附量、解吸量、解吸率，结果见图3。优选解吸率最高的NKA-9型大孔树脂进行后续纯化。

(3)NKA-9型大孔吸附树脂吸附动力学模型、吸附等温线模型回归方程拟合

a.吸附动力学模型回归方程：称量0.5g NKA-9型大孔吸附树脂于具塞容器中，取0.45mg/mL的驱虫斑鸠菊总黄酮粗提物溶液50mL，于室温下以120r/min振摇12h，每30min测定吸附液中总黄酮浓度，直至达到平衡。通过拟一阶(1)和拟二阶(2)动力学方程得到吸附动力学模型拟合回归方程及参数，预测驱虫斑鸠菊总黄酮在NKA-9树脂上的吸附过程：

b.吸附等温线模型回归方程：称量0.5g NKA-9型大孔吸附树脂于具塞容器中，取0.29、0.33、0.46、0.59、0.79mg/mL的驱虫斑鸠菊总黄酮粗提物溶液50mL，于室温下以120r/min振摇12h，检测到达平衡后浓度，对Langmuir模型(3)和Freundlich模型(4)进行适应度评估，确定NKA-9树脂对驱虫斑鸠菊总黄酮提取物的吸附等温线：

(4)均匀设计与统计分析

a.单因素考察：①上样液浓度的影响：分别取等量质量浓度为0.5、1.5、2.5、4.5、6.5、8.5mg/mL的驱虫斑鸠菊粗提液，加入装有NKA-9大孔树脂的层析柱内进行吸附，层析柱径高比为1∶30，树脂床高约12cm，收集过柱液，计算吸附率，结果见图9；②上样液pH的影响：取等量质量浓度为2.5mg/mL的驱虫斑鸠菊粗提液，分别调节溶液pH为1.0、2.0、4.0、6.0、8.0，加入装有NKA-9大孔树脂的层析柱内进行吸附，层析柱径高比为1∶30，树脂床高约12cm，收集过柱液，计算吸附率，结果见图10；③洗脱液浓度的影响：取等量质量浓度为2.5mg/mL的驱虫斑鸠菊粗提液，调节溶液pH为2.0，加入装有NKA-9大孔树脂的层析柱内进行吸附，层析柱径高比为1∶30，树脂床高约12cm，用2BV 0.1mol/L HCl除杂后分别用10％、30％、50％、70％、90％的乙醇溶液各5BV进行洗脱，收集洗脱液，计算洗脱率，结果见图12；④洗脱流速的影响：取等量质量浓度为2.5mg/mL的驱虫斑鸠菊粗提液，调节溶液pH为2.0，加入装有NKA-9大孔树脂的层析柱内进行吸附，层析柱径高比为1∶30，树脂床高约12cm，用2BV 0.1mol/L HCl除杂后用5BV 50％的乙醇溶液分别以0.5、1.0、2.0、3.0mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液，计算洗脱率，结果见图13。由图可知，洗脱流速对驱虫斑鸠菊总黄酮在NKA-9树脂上的影响不大，优选1mL/min进行后续纯化生产方法。

NKA-9大孔树脂动态泄露曲线：取4BV质量浓度为2.5mg/mL的驱虫斑鸠菊粗提液，调节溶液pH为2.0，加入装有NKA-9大孔树脂的层析柱内进行吸附，层析柱径高比为1∶30，树脂床高约12cm，每0.3BV测定流出液浓度，绘制大孔树脂泄露曲线，以确定最大上样量，结果见图11。

NKA-9大孔树脂洗脱曲线：取等量质量浓度为2.5mg/mL的驱虫斑鸠菊粗提液，调节溶液pH为2.0，加入装有NKA-9大孔树脂的层析柱内进行吸附，层析柱径高比为1∶30，树脂床高约12cm，用2BV 0.1mol/L HCl除杂后用50％乙醇溶液以1mL/min的流速洗脱，按照柱体积测定洗脱液浓度绘制洗脱曲线，以确定最佳洗脱体积，结果见图14。

b.基于均匀设计的NKA-9大孔树脂对驱虫斑鸠菊总黄酮纯化生产方法优化

结合单因素考察，优选上样液浓度(X

Y＝15.8711+1.1115X

由综合所得回归方程可以看出：洗脱液浓度与总黄酮回收率成正相关，上样液浓度与上样液pH的交互作用与总黄酮回收率成负相关，DW＝2.004，模型P＜0.01，表明模型具有统计学意义。根据SPSS二次多项式逐步回归分析及规划求解预测NKA-9大孔树脂纯化驱虫斑鸠菊总黄酮的最佳工艺为：上样液浓度为1.0mg/mL，pH调至0.5，洗脱液浓度为75％。依据均匀设计所得最优方案进行重复三次，得到驱虫斑鸠菊总黄酮平均回收率为98.19％，RSD＝0.615％，高于现行结果，因此确定驱虫斑鸠菊总黄酮最佳纯化条件为：上样液浓度为1.0mg/mL，pH调至0.5，洗脱液浓度为75％，洗脱液体积为6BV，洗脱流速为1mL/min。在此条件下，驱虫斑鸠菊总黄酮纯度由40.6％提升至81.4％，证明NKA-9型大孔吸附树脂在优化后的生产方法下能较好的纯化驱虫斑鸠菊总黄酮。

表1 均匀设计优化方案及结果

实施例3：驱虫斑鸠菊总黄酮体外抗氧化活性测定

按发明内容步骤三进行驱虫斑鸠菊总黄酮溶液对DPPH和ABTS自由基清除能力的测定。驱虫斑鸠菊总黄酮对DPPH和ABTS自由基有一定的清除能力，且随着浓度的提高而增强，粗提物与经NKA-9树脂纯化后黄酮相比，纯化后的驱虫斑鸠菊总黄酮对DPPH和ABTS自由基有较强的清除能力，清除率分别达到83.76％和92.64％。