TBL1XR1在肝脏疾病的治疗及肝脏再生中的应用

技术领域

本发明涉及TBL1XR1在肝脏疾病的治疗及肝脏再生中的应用。

背景技术

在我国，有超过三分之一的人口罹患不同种类的肝脏疾病，包括各种病毒性肝炎、非酒精和酒精性脂肪肝、药物损害等引起的肝纤维化，外源性刺激的长期存在会促发病灶恶化为肝硬化、肝癌等，具有很高的致死率，病程发展至终末期只能通过肝移植来治疗。而器官供体的数目往往十分有限，能接受移植手术的患者百中无一，且术后也有大量潜在预后问题，如长期使用免疫抑制剂造成的副作用等。

幸运的是肝脏自身即具有极强再生能力，但在正常肝脏中，细胞周转相对缓慢。而在损伤条件下，肝门静脉区域肝细胞会经历重编程状态转化为肝脏干细胞类似细胞(LPSC)，进入细胞增殖周期，进而完成损伤处的修复。通过外科手术切除了中部和左侧肝叶(相当于减少了70％的肝重量)的小鼠，短短一周内，其肝脏便经过三个阶段完成了再生，这三个阶段包括：(1)起始阶段(也称为启动阶段)，这一阶段肝细胞暴露在外周血循环中，接受了超出平常多倍的细胞因子的信号刺激，肝脏激活一系列完整的损伤反应基因和细胞因子网络，诱导增殖性反应；(2)增殖阶段，此时完全激活的肝脏再生细胞进入细胞周期补充肝脏质量及数目；(3)终止阶段，以TGFβ为首的细胞因子带领细胞退出细胞周期重新进入静息状态。完成再生过程后，肝脏就恢复了相当高的工作能力。

肝脏再生是涵盖众多不同的肝内和肝外细胞成分和大量信号分子在损伤或者特定微环境中的复杂且受到精密调节的相互作用，并且具有时序性。在各种促增殖因子和增殖抑制因子的调控下，肝脏启动再生并及时终止再生，实现肝再生调控点对维持机体稳态的重要意义。在如此复杂的再生调控网络中，找到内源性调控肝脏再生的因子，验证其是否为合适的治疗肝损伤靶标，仍然是肝再生领域亟待解决的科学问题。

先前的研究证实在卵巢癌、鼻咽癌、肺鳞状细胞癌、结外淋巴瘤中，TBL1XR1基因变异和高拷贝数与恶性肿瘤高度相关，TBL1XR1高表达状态下的肿瘤细胞增殖、迁移能力均增强。以往的研究表明TBL1XR1与TBL1基因高度同源，两者都包含F-box/WD-40重复序列，这是与维甲酸和甲状腺激素受体(SMRT)以及核受体抑制因子N-CoR阻遏复合物结合的关键位点，其与N-CoR/SMART介导了非配体核受体的转录抑制。TBL1XR1还作为E3泛素连接酶，招募UbcH5泛素结合酶/19S蛋白酶体，随后以配体依赖的方式用辅助激活因子取代辅助抑制因子。TBL1XR1在调控多种信号通路(Wnt/β-catenin、Notch、NF-κB、核受体)和基因转录中起关键作用，可影响细胞生长、抗凋亡、抗炎症反应以及调节基因转录。

有研究发现，肝脏转录辅助因子TBL1/TBLR1通过核受体过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)调控肝脏脂质代谢，TBL1/TBLR1活性的缺乏可导致肝脏脂肪变性和高甘油三酯血症。但是具体关于与TBL1和TBLR1高度同源的TBL1XR1在肝脏其它疾病中的研究尚未展开和深入。

腺相关病毒(AAV)可被宿主细胞表面的糖基化受体识别，通过网格蛋白介导的内吞进入细胞内，其遗传物质在细胞核内完成复制和转录。1995年，Terence R.Flotte等第一次使用AAV作为基因治疗载体，通过AAV2将正常CFTR基因转导到遗传性囊性纤维化病人的病变气管表皮内，展示了AAV在人体临床实验上的安全性。2014年欧盟批准了应用于脂蛋白酯酶缺乏(lipoprotein lipase deficiency，LPLD)的基因治疗药物Glybera(通用名alipogene tiparvovec)，Glybera将功能性LPLD基因包裹进AAV，注射入患者的骨骼肌，通过一次性治疗，可长期显著降低急性胰腺炎的发病率。时隔3年，FDA于2017年批准了Luxturna(AAV2)，用于治疗由RPE65基因突变导致的遗传性视网膜疾病。Luxturna将RPE65包裹进AAV2，注射进患者的眼睛。2019年5月，美国FDA批获了用于治疗脊柱肌肉萎缩的基因治疗药物Zolgensma。Zolgensma将正常表达SMN蛋白的转基因装进AAV9病毒载体，通过一次治疗可让患者的细胞重新开始生成SMN蛋白，从而缓解SMA症状。随着AAV治疗效果的有效性和安全性得到证实，在临床上越来越多的将其运用到各种疾病的治疗上，临床前期实验的治疗效果更是能为其应用打下基础。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，成功在小鼠体内建立了70％肝脏切除术造成的严重肝损伤模型，率先运用AAV8型肝脏特异性亲和病毒，来发掘TBL1XR1在肝脏疾病和肝再生领域的潜在医学价值。

具体而言，本发明第一方面提供促进TBL1XR1基因的表达和/或提高TBL1XR1蛋白的活性的试剂在制备促进对象肝再生的药物中的应用。

在一个或多个实施方案中，所述促进TBL1XR1基因的表达的试剂为含TBL1XR1基因的表达载体，用于在靶细胞或靶组织内过表达TBL1XR1 mRNA或蛋白质。

在一个或多个实施方案中，所述表达载体为利用AAV8载体构建得到的表达载体。

在一个或多个实施方案中，所述对象是实施了肝切除术的患者。

在一个或多个实施方案中，所述对象是肝病患者。

在一个或多个实施方案中，所述对象是肝肿瘤、肝外伤、肝脓肿、肝内胆管结石或肝囊肿患者。

在一个或多个实施方案中，所述对象是肝移植患者。

本发明第二方面提供抑制TBL1XR1基因的表达和/或抑制TBL1XR1蛋白的活性的试剂在制备治疗或预防TBL1XR1介导的疾病的药物中的应用。

在一个或多个实施方案中，所述试剂为TBL1XR1蛋白的抗体或其抗原结合片段。

在一个或多个实施方案中，所述抗体为人源抗体，更优选为单克隆抗体。

在一个或多个实施方案中，所述试剂为表达抑制TBL1XR1基因表达的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达载体。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子选自siRNA、反义RNA和核酶的编码序列。

在一个或多个实施方案中，所述表达载体为基因编辑载体。

在一个或多个实施方案中，所述表达载体为使用AAV8构建的表达载体。

在一个或多个实施方案中，所述TBL1XR1介导的疾病选自：肝癌、前列腺癌、卵巢癌、肺鳞状细胞癌、乳腺癌、宫颈癌、鼻咽癌、食管鳞状细胞癌、胃癌、结肠癌、大肠癌、结外淋巴瘤和急性白血病；优选地，所述疾病为肝癌。

本发明第三方面提供一种促进对象肝细胞或肝组织再生的方法，所述方法包括使用能促进TBL1XR1基因的表达和/或提高TBL1XR1蛋白活性的试剂处理肝细胞或肝组织的步骤。

在一个或多个实施方案中，所述试剂为含TBL1XR1基因的表达载体，用于在靶细胞或靶组织内过表达TBL1XR1 mRNA或蛋白质；优选地，所述表达载体为利用AAV8载体构建得到的表达载体。

在一个或多个实施方案中，所述方法为体外方法。

在一个或多个实施方案中，所述对象为实施了肝切除术的患者。

在一个或多个实施方案中，所述对象是肝病患者。

在一个或多个实施方案中，所述对象是肝肿瘤、肝外伤、肝脓肿、肝内胆管结石或肝囊肿患者。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括在实施肝切除术之前、同时和/或之后给予所述试剂。

本发明第四方面还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的以TBL1XR1蛋白或基因为靶点、抑制TBL1XR1基因表达或降低TBL1XR1蛋白活性的试剂，或以其为靶点促进该基因的表达或提高该蛋白的活性的试剂，和生理学或药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明第五方面提供一种构建肝再生动物模型的方法，所述方法包括对动物实施肝切除术之前、同时和/或之后给予有效量的能促进TBL1XR1基因的表达和/或提高TBL1XR1蛋白的活性的试剂。

在一个或多个实施方案中，所述促进TBL1XR1基因的表达的试剂为含TBL1XR1基因的表达载体，用于在靶细胞或靶组织内过表达TBL1XR1 mRNA或蛋白质。

在一个或多个实施方案中，所述表达载体为利用AAV8载体构建得到的表达载体。

本发明第六方面提供促进TBL1XR1基因的表达和/或提高TBL1XR1蛋白的活性的试剂和抑制TBL1XR1基因的表达和/或抑制TBL1XR1蛋白的活性的试剂在制备治疗患者肝脏疾病的药物或药盒中的应用。

在一个或多个实施方案中，所述治疗包括：给予患者所述抑制TBL1XR1基因的表达和/或抑制TBL1XR1蛋白的活性的试剂，以抑制患病肝细胞的生长或杀灭患病的肝细胞，然后实施肝切除术，切除患病肝组织，之后给予所述促进TBL1XR1基因的表达和/或提高TBL1XR1蛋白的活性的试剂，促进正常肝细胞的再生和肝组织修复。

在一个或多个实施方案中，所述肝脏疾病为肝癌。

附图说明

图1：TBL1XR1蛋白组织免疫荧光染色结果。

图2：肝脏切除手术技术流程图。

图3：组织RNA荧光定量结果。

图4：组织免疫荧光染色结果。红色信号为细胞处于增殖期的标志Ki67，Ki67在细胞核表达，绿色信号为细胞骨架，用细胞骨架特异性结合物质鬼笔环肽染色，以显示单个的细胞轮廓。

图5：肝脏增殖细胞数对比图。

图6：rAAV8载体结构示意图。

具体实施方式

转导素β1X连锁受体蛋白1(TBL1XR1)是大多数组织中普遍存在的核蛋白，含F-box/WD40重复序列，在信号通路的调节过程中具有重要作用。它是一种进化上保守的蛋白质，在所有物种之间具有高度的相似性。TBL1XR1对于非配体核受体(NRs)和其他受调控的转录因子(TFs)介导的转录抑制至关重要。同时，TBL1XR1在调控多种信号通路(Wnt/β-catenin、Notch、NF-κB、核受体)和基因转录中起关键作用，可影响细胞生长、抗凋亡、抗炎症反应并调节基因转录。人TBL1XR1的编码和氨基酸序列可分别见(NCBI中Gene数据库ID:81004，蛋白质数据库NP_109657.2)。

本发明发现，通过调控肝细胞中TBL1XR1的表达，可以促进或抑制肝细胞生长，实现肝再生、治疗或预防由于肝细胞或肝组织异常增生导致的疾病。

本文中，肝再生指实施大部分肝切除术(PH)后，肝脏实质大部分丢失，生理功能瞬时下降的情况下，剩余肝脏细胞通过细胞增殖由新老细胞缓慢更替状态转变为快速新生状态，以补偿丢失、损伤的肝组织并恢复肝脏的生理功能，这个过程称为肝再生(liverregeneration，LR)。本文所述的肝脏疾病包括：由于肝细胞或肝组织的异常增殖/增生导致的肝脏疾病，尤其指肝细胞癌，以及肝脏大面积损伤后，细胞增殖受限引起的肝功能阻碍。

本发明通过促进TBL1XR1基因的表达和/或提高TBL1XR1蛋白的活性从而促进肝细胞生长，实现肝再生。

可采用本领域周知的方法促进TBL1XR1基因的表达。例如，通过转入含TBL1XR1基因的表达载体而在肝细胞或肝组织内过表达TBL1XR1 mRNA和蛋白质。示例性的过表达载体可以是本领域常规用于基因治疗的表达载体，如AAV载体，尤其是AAV8载体。

在优选的实施方案中，对即将、正在或已经实施了肝切除术的患者给予促进TBL1XR1基因的表达和/或提高TBL1XR1蛋白的活性的试剂，以促进肝再生和修复。肝切除术是将肝脏的局部性病变，包括肝肿瘤、肝外伤、肝脓肿、肝内胆管结石、肝囊肿等，应用外科技术，施行肝段、肝叶及半肝切除，而保留足以维持功能的正常肝组织。目前肝切除术有：肝楔形切除术、肝部分切除术、肝叶切除术、半肝切除术、中肝叶切除术和肝二叶切除术等。在一些实施方案中，所述患者是肝癌患者，对其实施肝切除术、切除癌组织后，给予促进TBL1XR1基因的表达和/或提高TBL1XR1蛋白的活性的试剂，促进健康肝细胞的再生和肝脏组织的修复。在一些实施方案中，患者是肝移植患者，给予促进TBL1XR1基因的表达和/或提高TBL1XR1蛋白的活性的试剂，促进健康肝细胞的再生和肝脏组织的修复。本文中，所述肝移植患者可以是提供肝脏的供者，也可以是接受了肝脏的个体。

本发明通过抑制TBL1XR1基因的表达和/或抑制TBL1XR1蛋白的活性而抑制肝细胞生长，以治疗或预防由于肝细胞或肝组织异常增生导致的疾病。

本文中，抑制TBL1XR1基因表达包括使肝细胞内TBL1XR1蛋白的表达水平与TBL1XR1蛋白表达未受影响的肝细胞相比降低至少30％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，甚至完全不表达TBL1XR1蛋白。抑制TBL1XR1蛋白的活性包括将TBL1XR1蛋白的活性与正常活性相比降低至少30％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，甚至完全失活。

本文中，TBL1XR1蛋白活性的抑制可采用本领域周知的技术实现。例如，可通过给予TBL1XR1蛋白的抗体，拮抗其活性。TBL1XR1抗体为本领域所周知，可使用市售抗体。抗体优选为人源抗体。另外，抗体优选为单克隆抗体。或者，TBL1XR1蛋白活性的抑制可通过表达突变的TBL1XR1蛋白来实现。例如，可在对象细胞内表达同源重组载体，将编码其转录活性下调或丧失的TBL1XR1蛋白的核酸序列重组到细胞的基因组内，替换正常的TBL1XR1基因，使得对象细胞表达突变的TBL1XR1蛋白。突变通常发生在TBL1XR1蛋白的功能结构域内。突变可以是数量不限的插入、缺失或取代突变，只要使得TBL1XR1蛋白的转录活性下调或丧失生物学功能即可。在一些实施方案中，也可使用小分子化合物来拮抗TBL1XR1蛋白的生物学活性。

或者，可通过表达合适的核酸分子来抑制TBL1XR1基因表达。这类核酸分子包括但不限于siRNA、反义RNA、核酶和基因编辑载体。siRNA是长20到25个核苷酸的双链RNA，参与RNA干扰(RNAi)，以带有专一性的方式抑制TBL1XR1基因的表达。siRNA也可经由多种不同转染技术导入对象细胞内，并对TBL1XR1基因产生具专一性的敲弱效果。可采用本领域周知siRNA设计原则设计siRNA。例如，可在TBL1XR1 mRNA中寻找一段20-25nt长、通常为21nt的序列作为siRNA靶位点。可采用化学合成、体外转录、siRNA表达载体以及PCR表达组件等方法制备感兴趣的siRNA。

在活体中输送siRNA的一种办法是将siRNA序列作为“短发夹”克隆进质粒载体中。该发夹序列在动物体内被表达形成一个“双链RNA”(dsRNA)，并被RNAi通道处理。通常，短发夹RNA(shRNA)包括两个短反向重复序列，中间由一个茎环序列分隔，组成发夹结构。

反义RNA是指与mRNA互补后，能抑制基因表达的RNA。反义RNA通常包括3类：I类反义RNA直接作用于靶mRNA的SD序列和/或部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶III降解；II类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变化，抑制翻译；III类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。核酶是具有催化功能的小分子RNA，能降解特异的mRNA序列。核酶可通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性地剪切底物RNA分子，从而阻断靶基因的表达。

基因编辑载体可以是本领域周知的CRISPR-CAS9基因编辑载体或TALEN基因编辑载体。在一些实施方案中，所述基因编辑载体以AAV病毒载体为骨架载体构建得到。

可将包括siRNA、反义RNA和核酶的编码序列在内的核酸分子克隆到表达载体中，通过该核酸表达载体递送至体内，并表达出所述siRNA、反义RNA或核酶，实现所需的生物学功能。合适的表达载体为AAV载体，更优选为AAV8。

本发明示例性的用于肝脏靶向特异性敲降TBL1XR1基因的rAAV8载体的结构示意图可如图6所示。该载体包括来自AAV的骨架以及设立在反向末端重复序列ITR之间的启动子序列、任选的示踪蛋白的编码序列、靶向敲降序列以及转录后调控序列(WPRE)。启动子序列可以是本领域已知的各种合适的启动子，如肝脏特异的启动子。示例性的肝脏特异的启动子序列是TBG启动子序列。示例性的示踪蛋白包括各种荧光蛋白，如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白和黄色荧光蛋白等。靶向敲降序列可以是本文所述的siRNA、反义RNA或核酶的编码序列。转录后调控序列用于增加外源片段的表达效率，可采用本领域已知的WPREs来实施本发明。示例性的用于靶向敲降序列可如SEQ ID NO:1所示。示例性的TBG启动子的核苷酸序列可如SEQ ID NO:2所示。示例性的WPRE的核苷酸序列可如SEQ ID NO:3所示。

可采用本领域周知技术制备适用于本发明的siRNA、反义RNA、核酶编码序列和基因编辑载体，构建所需的表达载体，并给予需要的对象，用于抑制TBL1XR1基因的表达。

因此，本文提供一种治疗或预防肝癌的方法，所述方法包括给予需要的对象治疗有效量或预防有效量的抑制TBL1XR1基因的表达的试剂和/或抑制TBL1XR1蛋白的活性的试剂。另一方面，本发明提供一种肝癌治疗方法，所述方法包括对肝癌患者实施肝切除术切除癌组织后，给予患者促进TBL1XR1基因的表达和/或提高TBL1XR1蛋白的活性的试剂，以促进肝再生和修复。再一方面，本发明提供肝癌治疗方法，该方法包括给予肝癌患者治疗有效量或预防有效量的抑制TBL1XR1基因的表达的试剂和/或抑制TBL1XR1蛋白的活性的试剂，抑制癌细胞的生长或杀灭癌细胞，然后对肝癌患者实施肝切除术切除癌组织，之后再给予患者促进TBL1XR1基因的表达和/或提高TBL1XR1蛋白的活性的试剂，以促进肝再生和修复。

本文还提供一种促进肝再生的方法，所述方法包括给予需要的对象有效量的促进TBL1XR1基因的表达和/或提高TBL1XR1蛋白活性的试剂。优选地，所述对象是肝病患者。优选地，所述对象实施了肝切除术。在一些实施方案中，所述促进肝再生的方法是体外方法。

在另外一些实施方案中，本文提供抑制TBL1XR1基因的表达的试剂和/或抑制TBL1XR1蛋白的活性的试剂在制备治疗或预防肝癌的药物中的应用，和用于治疗或预防肝癌的抑制TBL1XR1基因的表达的试剂和/或抑制TBL1XR1蛋白的活性的试剂，以及促进TBL1XR1基因的表达和/或提高TBL1XR1蛋白活性的试剂在制备用于促进肝再生的药物中的用途，以及用于促进肝再生的促进TBL1XR1基因的表达和/或提高TBL1XR1蛋白活性的试剂。所述试剂可以为前文所述的抗体、核酸分子、小分子化合物和载体等。

本文中，“治疗”包括以下含义：(i)抑制疾病或病症，即遏制其发展；(ii)缓解疾病或病症，即，使该疾病或病症的状态消退；或者(iii)减轻该疾病或病症的症状。“预防”包括预防疾病或病症在哺乳动物中出现，特别是当这类哺乳动物易患有该疾病或病症，但尚未被诊断为已患有该疾病或病症时。

有效量是指服用后足以在某种程度上缓解所治疗的疾病或病症的一个或多个症状的药剂的量。其结果可以为迹象、症状或病因的消减和/或缓解，或生物系统的任何其它所需变化。例如，用于治疗的“有效量”是在临床上提供显著的病症缓解效果所需的包含本文所述试剂的组合物的量。可使用诸如剂量递增试验的技术测定适合于任意个体病例中的有效量。

本文所述的方法和用途中，给药的方法包括但不限于口服途径、经十二指肠途径、胃肠外注射(包括静脉内、皮下、腹膜内、肌内、动脉内注射或输注)、局部给药和经直肠给药。本领域技术人员熟知可用于本文所述化合物和方法的施用技术，例如在Goodman andGilman,The Pharmacological Basis of Therapeutics,(current ed.)，Pergamon；Remington's Pharmaceutical Sciences(current edition),Mack Publishing Co.,Easton,Pa中讨论的那些。在优选的实施方案中，本文讨论的化合物和组合物通过口服施用。当使用AAV病毒载体作为骨架载体构建得到的基因编辑载体时，可通过静脉注射的方式给药。给药剂量也可根据患者的年龄、性别、所患疾病的种类和严重程度等加以确定。

本文的药物组合物或药物可含有本文所述的以TBL1XR1蛋白或基因为靶点、抑制TBL1XR1基因表达或降低TBL1XR1蛋白活性的试剂，或以其为靶点促进该基因的表达或提高该蛋白的活性的试剂，和生理学或药学上可接受的载体或赋形剂。

在一些实施方案中，本发明提供含有一种药物组合物或药盒，该药物组合物或药盒含有：(1)以TBL1XR1蛋白或基因为靶点、抑制TBL1XR1基因表达或降低TBL1XR1蛋白活性的试剂，和(2)以其为靶点促进该基因的表达或提高该蛋白的活性的试剂，以及(3)生理学或药学上可接受的载体或赋形剂。(1)和(2)所述试剂可如本文任一实施方案所述。优选地，该药物组合物或药盒中，(1)和(2)所述试剂独立包装。优选地，该药物组合物或药盒用于对象肝病疾病的治疗，该治疗包括：先给予(1)所述试剂抑制癌细胞生长或杀灭癌细胞，在患者实施肝切除术后给予(2)所述药物促进肝细胞再生、肝脏组织修复。优选地，所述对象为肝肿瘤、肝外伤、肝脓肿、肝内胆管结石或肝囊肿患者。更优选地，所述药物组合物或药物用于治疗对象的肝癌。

本文中，“生理上或药学上可接受的载体”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害所服用药物组合物中所述试剂的生物活性及性能的那些载体和稀释剂。“生理上或药学上可接受的赋形剂”是指加到药物组合物中进一步有利于所述试剂的服用的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。药物组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。

本文中，对象为哺乳动物，尤其指人。

以下将以具体实施例的方式对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非用于限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域的常规方法和市售的或常规的试剂。

材料与方法

(I)实验动物

本研究全部采用雄性C57BL/6J小鼠作为实验动物，小鼠购于中国科学院广州生物医药与健康研究院实验动物中心，实验场所在广州生物医药与健康研究院实验动物中心。

(II)试剂材料

TBL1XR1抗体购于美国abcam公司。

Ki67抗体购于美国Thermofisher公司。

胎牛血清购于阿根廷Natocor公司。

DMEM细胞培养基和细胞培养耗材购于美国Corning公司。

TRIZOL试剂购于北京百泰克生物技术有限公司。

重组腺相关病毒载体(rAAV8)定制于广州派真技术有限公司。

手术工具、麻药均购于深圳瑞沃德生命科技有限公司。

OCT冷冻切片包埋剂购于美国樱花公司。

实施例

实施例1、小鼠70％肝脏部分切除模型的建立

15只12周龄SPF级C57BL/6J小鼠随机分5组，随后每只小鼠经历了切除肝脏左叶和中叶的70％肝脏切除术，术后内外表皮经过缝合和表面除菌，给予水浴保温台体温保温护理。

实施例2、确定TBL1XR1在小鼠肝脏再生阶段主要发挥功能的时间节点

分别在实施肝脏切除术后的8小时、第1天、第2天、第3天和第7天，收取小鼠腹腔内剩余肝脏组织，并收取两只未经过手术的健康小鼠肝脏组织记为第0天。将肝脏立即用OCT试剂冷冻包埋，快速冷冻切片机内切片。切片用于组织免疫荧光染色，用TBL1XR1抗体去结合组织中的TBL1XR1蛋白，得到图1所示实验结果，TBL1XR1蛋白在8小时(8H)开始高表达，在第2天(D2)达到表达高峰。由此确定：在70％肝脏切除术造成的损伤条件下，TBL1XR1蛋白在损伤后的第2天，开始发挥其最主要作用。

实施例3、肝脏特异性抑制TBL1XR1表达模型的建立和鉴定

将12只8周龄SPF级C57BL/6J小鼠随机分3组，在动物保定器中，每只小鼠从其尾部静脉处注射总滴度为3×10

实验结果如图3所示，与对照组小鼠相比，TBL1XR1敲降组小鼠的肝脏的TBL1XR1mRNA表达水平更低，说明成功在肝脏组织中特异性地敲降了TBL1XR1基因，敲降效率约为73％。

实施例4、鉴定TBL1XR1在小鼠肝脏再生阶段的重要影响

参照实施例3，分别在实施肝脏切除术后的8小时和第2天，收取对照组(注入的病毒载体中未插入shRNA)和实验组(注入的病毒载体插入了可敲降肝脏内TBL1XR1基因的发卡结构shRNA)小鼠腹腔内剩余肝脏组织，技术路线如图2所示。将肝脏组织立即用OCT试剂冷冻包埋，快速冷冻切片机内切片。术后第2天的组织切片用于组织免疫荧光染色，得到图4所示实验结果。红色信号为细胞处于增殖期的标志Ki67，Ki67在细胞核表达，绿色信号为细胞骨架，用细胞骨架特异性结合物质鬼笔环肽染色，以显示单个的细胞轮廓。

对术后第2天肝脏组织免疫荧光结果，经多点图像采集，每个组织平面在蔡司激光共聚焦显微镜-LSM900下放大20倍，拍摄20张照片，照片中的红色Ki67信号，经过图像处理软件Fiji计数。3组小鼠，每组4只，每只小鼠20张照片，经计数统计，术后第2天4只实验组小鼠肝脏细胞表达Ki67比率的均值为20.88％，4只对照组细胞小鼠肝脏细胞表达Ki67比率的均值为38.86％。将两组内每只小鼠肝脏细胞表达Ki67比率代入统计软件Graphpad，进行配对T检验，得到P＝0.0072，说明TBL1XR1敲降组的肝脏增殖细胞数显著小于TBL1XR1未敲降组的肝脏增殖细胞数(图5)。由此证明TBL1XR1在70％肝脏部分切除损伤小鼠内能加速肝脏细胞增殖，促进肝脏再生。

序列表

<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120> TBL1XR1在肝脏疾病的治疗及肝脏再生中的应用

<130> 218214

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggatgtcacg tctctagatt g 21

<210> 2

<211> 410

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgcatgtata atttctacag aacctattag aaaggatcac ccagcctctg cttttgtaca 60

actttccctt aaaaaactgc caattccact gctgtttggc ccaatagtga gaactttttc 120

ctgctgcctc ttggtgcttt tgcctatggc ccctattctg cctgctgaag acactcttgc 180

cagcatggac ttaaacccct ccagctctga caatcctctt tctcttttgt tttacatgaa 240

gggtctggca gccaaagcaa tcactcaaag ttcaaacctt atcatttttt gctttgttcc 300

tcttggcctt ggttttgtac atcagctttg aaaataccat cccagggtta atgctggggt 360

taatttataa ctaagagtgc tctagttttg caatacagga catgctataa 410

<210> 3

<211> 427

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ataatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg 60

ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc 120

gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt agttcttgcc acggcggaac 180

tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt 240

ccgtggtgtt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc atctagcttt 300

atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 360

gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt 420

ttttaaa 427