一种甘松及其制剂特征图谱的构建方法及质量检测方法

技术领域

本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种甘松及其制剂特征图谱的构建方法及质量检测方法。

背景技术

甘松为败酱科植物甘松Nardostachys jatamansi DC.的干燥根及根茎。甘松的主要活性成分挥发油类成分、萜类成分、酚酸类成分进行评价。甘松具有如下功效：理气止痛，开郁醒脾；外用祛湿消肿。用于脘腹胀满，食欲不振，呕吐；外用治牙痛，脚气肿毒。

2020版《中国药典》仅以药材性状、显微鉴别、薄层鉴别、挥发油总量、甘松新酮为特征成分来控制其质量。文献也对甘松中化学成分进行阐述。然而，一方面，通过上述现有的标准或相关研究，并没有具体的甘松的药物制剂质量控制方法，更不能从整体上检测和控制其质量；另一方面，只通过单一成分的含量测定联合其他成分的鉴别甘松的药物制剂，费时、费力，难以广泛地应用于生产实践。

现有技术中，对甘松的质量控制都是针对甘松药材、饮片，并非是针对甘松的药物制剂，且存在共有信息少、特征性不足的缺陷，现有技术中针对甘松药材、饮片的检测方法并不能适用于甘松制剂。

甘松制剂常见的类型有汤剂、粉末剂、配方颗粒等，例如标准汤剂冻干粉是由甘松饮片经过提取、浓缩、干燥等步骤得到。然而由于中药标准汤剂冻干粉已经不具备药材性状鉴别的特征，现有鉴别甘松的方法不适于标准汤剂冻干粉等由甘松水提取物制得的制剂的质量检测，特征峰少，分离效果差。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供一种甘松及其制剂特征图谱的构建方法及质量检测方法，该方法根据甘松及其制剂的特点，建立该品种的特征图谱，实现多个特征峰的有效分离、节约检测时间、提高特征性，为全面、快速建立甘松及其制剂的质量控制标准提供科学依据。

为此，本发明提供了一种甘松及其制剂特征图谱的构建方法，包括以下步骤，

(1)供试品溶液的制备；

(2)取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，得到供试品的特征图谱，色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈和含甲酸的水溶液为流动相，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→5min→40min→50min，流动相中乙腈的体积百分数为：10％→10％→35％→50％。

进一步地，步骤(2)中，检测波长为234-344nm；和/或，柱温为30-40℃；和/或，流速为0.8-1.2mL/min；和/或，梯度洗脱程序还包括：50→56-60min，流动相中乙腈的体积百分数为：50％→90％；和/或，含甲酸的水溶液中甲酸的体积百分数为0.05-0.2％；和/或，进样量为5μL-20μL。

进一步地，步骤(1)包括如下步骤：

1)取供试品加入提取溶剂提取，得到提取液；

2)将提取液进行固液分离，取液体，即得供试品溶液；优选的，步骤(1)满足如下A-D中的任意一项或者多项：

A、步骤1)中，供试品的质量与提取溶剂的体积比为0.1-0.4:10-50；质量与体积的配比关系为g/mL；

B、所述提取溶剂包含甲醇或者甲醇水溶液，优选为50％的甲醇水溶液；

C、步骤1)中，提取方式为超声提取或者回流提取，提取时间为15min-45min；

D、步骤2)中，所述固液分离为离心或者过滤。

进一步地，所述甘松及其制剂选自甘松药材、甘松饮片、甘松水提取物或者甘松制剂。

可选的，所述药物制剂为粉剂(例如标准汤剂冻干粉)、片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。

可选的，所述甘松的药物制剂的制备方法包括如下步骤：

取甘松，加热回流提取至少1次，每次加入至少8重量倍量的水提取至少20min，同时收集挥发油适量(不少于相当于饮片量0.21％(ml/g)挥发油)，包合备用(挥发油：β-环糊精：水＝1：8：21，胶体磨研磨30分钟)，过滤，滤液浓缩至60℃相对密度为1.0～1.2，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂；所述辅料为药学上可接受的辅料为：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素纳等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000、PEG4000、虫蜡等。

可选的，所述甘松的药物制剂的制备方法包括如下步骤：

取甘松，加热回流提取1～5次，每次加入8～25重量倍量的水提取20min～1h，同时收集挥发油适量(不少于相当于饮片量0.21％(ml/g)挥发油)，包合备用(挥发油：β-环糊精：水＝1：8：21，胶体磨研磨30分钟)，水提液过滤，滤液浓缩至70℃相对密度为1.05～1.15/mL，加入挥发油包合物，混匀，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂；

更可选的，取甘松，加热回流提取1次，加入18重量倍量的水提取45min，同时收集挥发油适量(不少于相当于饮片量0.21％(ml/g)挥发油)，包合备用(挥发油：β-环糊精：水＝1：8：21，胶体磨研磨30分钟)，水提液过滤，滤液浓缩至60℃相对密度为1.06～1.14g/mL，加入挥发油包合物，混匀，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。常规工艺可以包括喷雾干燥(例如进风温度：150～210℃，出风温度：70～115℃，风速30～50Hz)。

进一步地，所述的构建方法还包括采用绿原酸、隐绿原酸、去氧甘松醇A、甘松新酮二醇和甘松香酮A中的一种或者多种为对照品加溶剂制备对照品溶液的步骤，以及按照上述任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品参照图谱的步骤；优选的，溶剂选自甲醇或者体积百分数为70％以上的甲醇水溶液；优选的，每1mL对照品溶液中含各对照品0.04-0.2mg。

进一步地，所述的构建方法还包括采用甘松对照药材加水提取、滤过、干燥后得到的固体采用提取溶剂提取后固液分离，取液体，即得对照药材参照物溶液，以及按照上述任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照药材参照物溶液得到对照药材参照图谱的步骤。

其中，所述提取溶剂如前述所限定。固液分离为离心或者过滤。

进一步地，所述甘松及其制剂的特征图谱具有9个共有特征峰，峰2、峰7应分别与绿原酸对照品、去氧甘松醇A对照品参照物峰的保留时间相对应，与绿原酸对照品参照物相应的峰为S1峰，与去氧甘松醇A对照品参照物相应的峰为S2峰，峰1、峰3～5与S1峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，峰1、峰3～5与S1峰的规定值依次为：0.47、1.06、1.31、1.63；峰6、峰8～9与S2峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，峰6、峰8～9与S2峰的规定值依次为：0.92、1.14、1.30；优选的，峰5与峰2的相对峰面积不小于0.13；优选的，峰7与峰2的相对峰面积不小于1.5。

进一步地，所述甘松及其制剂的特征图谱具有9个共有特征峰，其中峰2为绿原酸；峰3为隐绿原酸；峰7为去氧甘松醇A；峰8为甘松新酮二醇；峰9为甘松香酮A。

本发明还提供了一种甘松及其制剂产品的质量检测方法，包括将待测产品按照上述任一所述的构建方法得到特征图谱的步骤；优选的，还包括测定甘松及其制剂产品中去氧甘松醇A和/或绿原酸的含量的步骤。

进一步地，测定甘松及其制剂产品中去氧甘松醇A和/或绿原酸的含量的步骤包括：

(1)供试品溶液的制备，以及去氧甘松醇A和/或绿原酸对照品溶液的制备；

(2)取供试品溶液和对照品溶液采用高效液相色谱法检测，通过外标法计算供试品溶液中的对照品的含量。

进一步地，去氧甘松醇A测定的色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水(30:70)为流动相。

检测波长为234-344nm；和/或，柱温为20-40℃；和/或，流速为0.8-1.2mL/min。

进一步地，绿原酸测定的色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.1％磷酸溶液(10：90)为流动相。

检测波长为234-344nm；和/或，柱温为20-40℃；和/或，流速为0.8-1.2mL/min。

进一步地，供试品溶液的制备方法包括如下步骤：

1)取供试品加入提取溶剂提取，得到提取液；

2)将提取液进行固液分离，取液体，干燥，即得供试品溶液；优选的，步骤(1)满足如下A-D中的任意一项或者多项：

A、步骤1)中，供试品的质量与提取溶剂的体积比为0.05-0.4:10-50；质量与体积的配比关系为g/mL；

B、所述提取溶剂包含水、甲醇和乙醇中的一种或者多种，优选为50％-70％的甲醇水溶液；

C、步骤1)中，提取方式为超声提取或者回流提取，提取时间为15min-45min；

D、步骤2)中，所述固液分离为离心或者过滤。

进一步地，所述甘松及其制剂选自甘松药材、甘松饮片、甘松水提取物或者甘松制剂。

可选的，所述药物制剂为粉剂(例如标准汤剂冻干粉)、片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。

进一步地，对照品溶液的溶剂选自甲醇或者体积百分数为70％以上的甲醇水溶液。

进一步地，每1mL对照品溶液中各对照品40-80μg。

具体的，测定甘松及其制剂产品中去氧甘松醇A的含量包括：

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(30:70)为流动相；每分钟流速1.0ml，柱温为25℃，检测波长为236nm。理论板数按去氧甘松醇A峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备取去氧甘松醇A对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品适量，研细，取0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

具体的，测定甘松及其制剂产品中绿原酸的含量包括：

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸溶液(10：90)为流动相；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为327nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备取绿原酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率30kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明还提供了一种不同基原的甘松及其制剂产品的鉴别方法，包括将待鉴别产品按照上述任一所述的构建方法得到特征图谱的步骤；优选的，峰5与峰2的相对峰面积不大于0.13，则基原为甘松基原，反之，则基原为匙叶甘松基原。

本发明还提供了一种不同部分来源的甘松及其制剂产品的鉴别方法，包括将待鉴别产品按照上述任一所述的构建方法得到特征图谱的步骤；优选的，峰7与峰2的相对峰面积不小于1.5，则部位来源为根及根茎，反之，则部位来源为甘松叶子。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的甘松及其制剂特征图谱的构建方法，取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，得到供试品的特征图谱，色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈和含甲酸的水溶液为流动相，在特定洗脱程序下得到9个共有特征峰，并实现了这些共有特征峰的很好分离，得到的特征图谱基线平稳，特征峰峰形好、分离效果好、简便，为甘松及其制剂的质量检测和控制提供依据，实现对甘松及其制剂整体成分表征，重现性稳定。更重要的是，通过流动相梯度的筛选实现了绿原酸、隐绿原酸、去氧甘松醇A、甘松新酮二醇和甘松香酮A等专属性成分的同时指认，特征性显著。

2.本发明提供的甘松及其制剂特征图谱的构建方法，以药材、饮片及其相关制剂为研究对象，确认了9个共有特征峰，指认了绿原酸、隐绿原酸、去氧甘松醇A、甘松新酮二醇和甘松香酮A等关键特征成分，以9个关键信息包含萜类及酚酸类特征指纹图谱，全面综合地分析甘松的质量，并指导甘松药物制剂的开发利用，制定的技术方法专属性强、对检测设备要求较低、操作简单方便、重现性好的甘松质量控制方法，客观、合理的评价甘松相关药物制剂的质量。能够全面地、快速地检测甘松及其药物制剂的质量，有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。同时，该方法具有稳定性高、精密度高、重复性好等优点。

3.本发明提供的不同基原的甘松及其制剂产品的鉴别方法，能够方便、快速地鉴别匙叶甘松基原或者甘松基原的甘松及其制剂，有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。

4.本发明提供的不同部分来源的甘松及其制剂产品的鉴别方法，能够方便、快速地鉴别根及根茎来源或者叶子来源的甘松及其制剂，有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中绿原酸对照品色谱图；

图2为实施例1中去氧甘松醇A对照品色谱图；

图3为实施例1中甘松饮片标准汤剂(冻干粉)样品色谱图；

图4为实施例2中梯度条件1色谱图；

图5为实施例2中梯度条件2色谱图；

图6为实施例2中梯度条件3色谱图；

图7为实施例2中梯度条件4色谱图；

图8为实施例2中梯度条件5色谱图；

图9为实施例2中波长214nm色谱图；

图10为实施例2中波长234nm色谱图；

图11为实施例2中波长254nm色谱图；

图12为实施例2中波长264nm色谱图；

图13为实施例2中波长274nm色谱图；

图14为实施例2中波长284nm色谱图；

图15为实施例2中波长304nm色谱图；

图16为实施例2中波长324nm色谱图；

图17为实施例2中波长344nm色谱图；

图18为实施例2中波长364nm色谱图；

图19为实施例2中0.05％甲酸色谱图；

图20为实施例2中0.1％甲酸色谱图；

图21为实施例2中0.2％甲酸色谱图；

图22为实施例2中流速0.8mL/min色谱图；

图23为实施例2中流速1.0mL/min色谱图；

图24为实施例2中流速1.2mL/min色谱图；

图25为实施例2中柱温30℃条件下对照图；

图26为实施例2中柱温35℃条件下对照图；

图27为实施例2中柱温40℃条件下对照图；

图28为实施例2中Dikma Platisil ODS色谱柱色谱图；

图29为实施例2中Agilent 5TC-C18(2)色谱柱色谱图；

图30为实施例2中Shimadzu-GL Wondacract ODS-2色谱柱色谱图；

图31为实施例2中Waters液相考察色谱图；

图32为实施例2中戴安液相考察色谱图；

图33为实施例2中岛津液相考察色谱图；

图34为实施例3中甘松对照药材色谱图；

图35为实施例3中甘松饮片标准汤剂冻干粉多批次特征图谱；(S1～S18分别为：A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12、A13、A14、A15、A16、A17、A18；R为对照特征图谱)；

图36为实施例3中甘松饮片标准汤剂冻干粉对照特征图谱；峰2：绿原酸；峰3：隐绿原酸；峰7：去氧甘松醇A；峰8：甘松新酮二醇；峰9：甘松香酮A；

图37为实施例3中不同对照品定位色谱图；S1：甘松对照图谱；S2：绿原酸；S3：隐绿原酸；S4：甘松新酮二醇；S5：甘松香酮A；S6：去氧甘松醇A；

图38为实施例5中甘松药材与匙叶甘松药材图谱比较；S1：甘松供试品；S2：匙叶甘松供试品；

图39为实施例5中甘松不同部位图谱比较；S1：甘松根及根茎；S2：甘松叶子。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。除非特别说明，本发明中的甘松饮片标准汤剂冻干粉中的甘松饮片的基原是败酱科植物甘松Nardostachys jatamansi DC.基原，部位来源是干燥根及根茎。

本发明中，甘松标准汤剂冻干粉、配方颗粒提取物和配方颗粒均是以甘松饮片为原料按照本领域常规方法制得，例如本发明中，按如下方法进行样品制备：取甘松药材，根据《中国药典》2020年版甘松药材项下有关规定炮制(炮制工艺：取甘松药材适量，除去杂质和泥沙，洗净，切长段，干燥制备成甘松饮片。

1、甘松饮片标准汤剂冻干粉：取甘松饮片约600g，置砂锅中，提取两次，加水10倍(质量倍量)浸泡30分钟，先武火(5档)煮沸，再文火(3档)煎煮30分钟，200目纱布(尼龙)趁热过滤；药渣再加水8倍(质量倍量)，武火(5档)煮沸后，再文火(3档)煎煮25分钟，200目纱布(尼龙)趁热过滤，合并滤液；滤液即为甘松饮片标准汤剂。取其中500g饮片对应的甘松饮片标准汤剂，照挥发油测定法(中国药典2020年版通则2204)提取挥发油。剩余100g饮片对应的松饮片标准汤剂减压浓缩(温度60℃，真空度50mbar)至相对密度为1.02g/ml～1.08g/ml的浓浸膏；置于冷冻干燥机中，冷冻干燥(-80℃，0Mpa)至干燥状态，取出，称重，研磨成粉末，分装于西林瓶中，即得甘松饮片标准汤剂冻干粉。

2、配方颗粒提取物：取甘松饮片6700g，加水煎煮1次，加18倍(质量倍量)水浸泡30分钟，煎煮45分钟，得到水提液同时收集挥发油适量(不少于相当于饮片量0.21％(ml/g)挥发油)，包合备用(挥发油：β-环糊精：水的质量比为1：8：21，胶体磨研磨30分钟，得到挥发油包合物)，水提液200目滤过(干浸膏出膏率为8.0％-13.0％)，60℃减压浓缩至相对密度1.06～1.14g/mL(60℃±5℃)的流膏，流膏保温至65℃，加入挥发油包合物，混匀，进行喷雾干燥(进风温度：180℃，出风温度：100℃，风速40Hz)，加麦芽糊精适量，混匀，即得。

3、配方颗粒：取甘松饮片6700g，加水煎煮1次，加18倍(质量倍量)水浸泡30分钟，煎煮45分钟，得到水提液同时收集挥发油适量(不少于相当于饮片量0.21％(ml/g)挥发油)，包合备用(挥发油：β-环糊精：水的质量比为1：8：21，胶体磨研磨30分钟，得到挥发油包合物)，水提液200目滤过(干浸膏出膏率为8.0％-13.0％)，60℃减压浓缩至相对密度1.06～1.14g/mL(60℃±5℃)的流膏，流膏保温至65℃，加入挥发油包合物，混匀，进行喷雾干燥(进风温度：180℃，出风温度：100℃，风速40Hz)，加麦芽糊精适量，混匀，制粒，制成1000g，即得。

实施例1

本实施例提供了一种甘松标准汤剂冻干粉的特征图谱的构建方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：以甘松标准汤剂冻干粉为供试品，取供试品适量，研细，取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇20ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，滤过，取续滤液，即得。

(2)对照品溶液的制备：取去氧甘松醇A对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得对照品溶液1；取绿原酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得对照品溶液2；取甘松新酮二醇适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得对照品溶液3；取甘松香酮A适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得对照品溶液4。

(3)高效液相色谱法检测：各取对照品溶液和供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪中，色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Dikma Platisil ODS，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，0.1％甲酸水为流动相B，按下表中的规定条件进行洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为254nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000。

结果见下表和图1-3所示，色谱方法系统适应性良好，甘松标准汤剂冻干粉的特征图谱基线平稳，特征峰峰形好、分离效果好、特征峰分布均匀，具有9个共有特征峰，峰2、峰7应分别与绿原酸对照品、去氧甘松醇A对照品参照物峰的保留时间相对应，与绿原酸对照品参照物相应的峰为S1峰，与去氧甘松醇A对照品参照物相应的峰为S2峰，峰1、峰3～5与S1峰的相对保留时间依次为：0.47、1.06、1.31、1.63；峰6、峰8～9与S2峰的相对保留时间依次为：0.92、1.14、1.30；峰5与S1峰(峰2)的相对峰面积为0.28(不小于0.13)，峰S2(峰7)与S1峰(峰2)的相对峰面积为3.3(不小于1.5)。

表1甘松标准汤剂冻干粉的特征图谱系统适应性参数

实施例2

1、仪器与试药

1.1仪器

色谱仪1：waters e2695色谱系统，包括四元梯度输液泵(Alliance2695型)、120位高性能自动进样器、原装进口色谱柱温箱、Waters 2489紫外检测器、Empower色谱工作站；色谱仪2：Agilent 1260InfinityⅡ，包括G711B型四元泵、G7129A型自动进样器、G7114A型VWD检测器、G7116A型柱温箱、OpenLab CDS色谱工作站。色谱仪3：Shimadzu LC-2030C 3Dplus色谱系统，包括LC-40B XR四元泵、SIL-40C自动控温自动进样器、SPD-40V PAD检测器、CTO-40C柱温箱、Lab Solution色谱工作站。色谱柱：(1)Dikma Platisil ODS(柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm)；(2)Agilent 5TC-C18(2)(柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm)；(3)Shimadzu-GL Wondacract ODS-2(柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm)。

1.2试药

绿原酸对照品：购于中国食品药品检定研究所，批号110753-202018，含量以96.1％计；去氧甘松醇A对照品：购于江西佰草源生物科技有限公司，批号001810-202301，纯度HPLC≥98％；甘松新酮二醇对照品：购于上海鸿永生物科技有限公司，批号070100-202111，纯度HPLC≥98％；甘松香酮A对照品：购于上海鸿永生物科技有限公司，批号070102-202111，纯度HPLC≥98％。甘松对照药材：购于中国食品药品检定研究所，批号121402-201805。

甘松饮片冻干粉批次：A1-A18，产地依次为：四川省甘孜藏族自治州甘孜县、四川省甘孜藏族自治州甘孜县、四川省甘孜藏族自治州甘孜县、青海果洛藏族自治州斑玛县、青海果洛藏族自治州斑玛县、青海果洛藏族自治州斑玛县、四川阿坝藏族羌族自治州阿坝县、四川阿坝藏族羌族自治州阿坝县、四川阿坝藏族羌族自治州阿坝县、甘肃甘南藏族自治州玛曲县、甘肃甘南藏族自治州玛曲县、甘肃甘南藏族自治州玛曲县、四川阿坝藏族羌族自治州松潘县、四川阿坝藏族羌族自治州松潘县、四川阿坝藏族羌族自治州松潘县、四川省甘孜藏族自治州甘孜县、四川省甘孜藏族自治州甘孜县、四川省甘孜藏族自治州甘孜县。

2、色谱条件和提取溶剂的考察

(1)梯度洗脱程序的考察

取实施例1制得的供试品溶液注入高效液相色谱仪中，色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；色谱柱：Dikma PlatisilODS。以乙腈为流动相A，0.1％甲酸水为流动相B，分别按下表中的规定条件进行洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为254nm；进样量10μl。

表2梯度条件1～3

表3洗脱优化条件4和5

表4系统适用性参数

本发明中，不对称性中n.a.表示系统未有显示数据，分离度中n.a.表示系统未有显示数据。

结果见上表和图4-8所示，梯度条件3的色谱峰较前几个梯度，分离效果较佳且色谱信息较丰富。而相比于梯度条件1-3来说，梯度条件4和5明显提高了分离效果。其中，梯度条件5洗脱后呈现的图谱，色谱信息较丰富，主要色谱峰较多，分离度较好，基线较平稳，检测时间更短，故优选梯度条件5做后续的条件筛选。

(2)检测波长的选择

取实施例1制得的供试品溶液注入高效液相色谱仪中，比较10个不同吸收波长下(214nm、234nm、254nm、264nm、274nm、284nm、304nm、324nm、344nm、364nm)的色谱图，其余色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；色谱柱：Dikma Platisil ODS。以乙腈为流动相A，0.1％甲酸水为流动相B，分别上述梯度条件5进行洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；；进样量10μl。

表5不同吸收波长色谱峰系统适应性参数

甘松中有效成分主要为挥发油和萜类化合物，其有效检测波长范围在234-364nm。由上表和附图9-18可以看出，波长234-344nm条件下色谱图的色谱峰较多，信息量较大，基线较平稳，分离度较好，结合峰面积来看，以波长254nm峰面积均匀性最佳。

(3)甲酸浓度的考察

取实施例1制得的供试品溶液注入高效液相色谱仪中，比较不0.05％甲酸溶液、0.1％甲酸、0.2％甲酸为流动相B的色谱图，其余色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；色谱柱：Dikma Platisil ODS。以乙腈为流动相A，以上不同酸溶液为流动相B，分别上述梯度条件5进行洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为254nm；进样量10μl。

表6不同甲酸浓度考察系统适用性参数

结果表明，不同甲酸浓度对各色谱峰有一定影响，0.05-0.2％甲酸溶液洗脱呈现的色谱图主要色谱峰的峰型及分离度均较好(见上表和图19-21)，结合峰面积和基线来看，0.1％-0.2％甲酸溶液得到的色谱图各特征峰出峰面积更高且均匀，且基线更加平稳，因此优选0.1％-0.2％甲酸溶液。

(4)流速的考察

考察不同流速0.8、1.0、1.2mL/min对各个特征峰的分离情况的影响。取本实施例第(1)项制得的供试品溶液，分别在流速为0.8、1.0、1.2mL/min下，按照梯度条件5进行梯度分析，其余色谱条件均与第(1)项相同。

表7不同流速考察系统适用性参数

结果见上表和图22-24，使用0.8、1.0、1.2mL/min均可实现多个特征峰的分离，尤其是1.0mL/min的分离效果最好。结合峰面积和出峰时间来看，1.0mL/min得到的色谱图各特征峰出峰面积更高且均匀，且出峰时间更短，因此优选1.0mL/min。

(5)柱温的考察

考察不同柱温30、35、40℃对各个特征峰的分离情况的影响。取本实施例第(1)项制得的供试品溶液，分别在柱温为30、35、40℃下，按照梯度条件5进行梯度分析，其余色谱条件均与第(1)项相同。

表8不同柱温考察系统适用性参数

结果见上表和图25-27，使用20、25、30℃可实现多个特征峰的分离，尤其是35℃的分离效果最好。

(6)色谱柱的考察

考察色谱柱对色谱峰分离及峰形等的影响。取本实施例第(1)项制得的供试品溶液，按照梯度条件5进行梯度分析，采用如下三个色谱柱进行检测：Dikma Platisil ODS(柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm)色谱柱；Agilent 5TC-C18(2)(柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm)色谱柱；Shimadzu-GL Wondacract ODS-2(柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm)色谱柱，柱温35℃，其余色谱条件均与第(1)项相同。

表9 Dikma Platisil ODS色谱柱考察系统适用性参数

表10 Agilent 5TC-C18(2)色谱柱考察系统适用性参数

表11Shimadzu-GL Wondacract ODS-2色谱柱考察系统适用性参数

结果见图28-30，使用上述三种C18色谱柱均可实现多个特征峰的分离，尤其是采用Dikma Platisil ODS色谱柱时，色谱柱对峰1的分离效果更好，故选择Dikma PlatisilODS色谱柱作为甘松标准汤剂冻干粉特征图谱测定的色谱柱。

(7)色谱仪的考察

考察Waters、戴安、岛津三种型号的色谱仪对色谱峰分离及峰形等的影响。取本实施例第(1)项制得的供试品溶液，按照梯度条件5进行梯度分析，柱温35℃，色谱条件均与第(1)项相同。

比较不同品牌高效液相测得特征图谱可以发现，Waters、戴安、岛津三种型号的高效液相色谱法呈现的色谱信息均较为完整，且各特征峰的均不缺失(参见图31-33)，因此，无需固定液相色谱仪型号测定甘松饮片(标准汤剂)冻干粉特征图谱。

3、供试品溶液的制备

(1)提取溶剂的考察

考察不同提取溶剂(20％甲醇、50％甲醇、甲醇)对甘松饮片标准汤剂(冻干粉)特征图谱的影响。分别取甘松标准汤剂冻干粉约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入不同提取溶剂50mL，密塞，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。HPLC检测，色谱条件同实施例1，考察结果见下表和图23-28所示。

表12提取溶剂甲醇浓度考察色谱峰系统适应性参数表

结论：20％甲醇、50％甲醇、甲醇均可实现各峰的有效分离，50％甲醇提取检测得到的色谱峰峰面积较大，且各峰峰形较好，因此优选50％甲醇作为甘松标准汤剂冻干粉特征图谱的提取溶剂。

(2)提取时间的考察

考察不同提取时间(15、30、45分钟)对甘松饮片标准汤剂特征图谱的主要特征峰的提取效果。分别取甘松标准汤剂冻干粉约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50mL，密塞，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)15、30、45分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。HPLC检测，色谱条件同实施例1。

试验结果表明，综合比较以上三个不同提取时间的结果，不同提取时间对各峰保留时间不造成影响，均可完全提取；超声处理15、30、45分钟时峰面积有一定差异，超声处理30分钟时提取已较为完全，且各峰的分离度、不对称性、理论板数等较好，优选提取时间为30分钟。

(3)取样量的选择

分别取甘松标准汤剂冻干粉0.1g，0.2g，0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20mL，密塞，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。HPLC检测，色谱条件同实施例1。

试验结果表明，当取样量在0.1g～0.4g时，峰面积按比例增加，说明在取样量0.1g～0.4g时，均可完全提取，取样量为0.2g特征峰的峰面积相对比较适中，因此优选将0.2g作为甘松标准汤剂冻干粉的取样量。

(4)溶剂用量的考察

分别取甘松标准汤剂冻干粉约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50％甲醇10mL、20mL、50mL，密塞，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。HPLC检测，色谱条件同实施例1。

试验结果表明，说明在10～50ml溶剂量时，均可完全提取，综合可考虑峰面积响应，溶剂体积为20mL特征峰的峰面积相对比较适中，因此将提取溶剂量优选为20ml。

实施例3

(1)多批甘松标准汤剂冻干粉特征图谱测定

取甘松对照药材1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水20ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加入50％甲醇10ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。

取18批甘松标准汤剂冻干粉(A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12、A13、A14、A15、A16、A17、A18)按实施例1的方法操作制备得到供试品溶液，取18批供试品溶液和对照药材参照物溶液按照实施例1第(3)项的方法进行测试，得到甘松对照药材特征图谱和18批甘松标准汤剂冻干粉的特征图谱。见图34和35所示，将18批甘松标准汤剂冻干粉的特征图谱检测AIA数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”计算软件，共标定了8个峰共有峰，形成共有模式图，并建立对照图谱，如图36所示。

表13 18批甘松饮片标准汤剂特征图谱相对保留时间

表14 18批甘松饮片标准汤剂特征图谱相对峰面积

根据研究结果确定：甘松标准汤剂冻干粉特征图谱供试品色谱中应呈现9个共有特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的9个共有特征峰的保留时间相对应，其中峰2、峰7应分别与绿原酸对照品、去氧甘松醇A对照品参照物峰的保留时间相对应，与绿原酸对照品参照物相应的峰为S1峰，计算峰1、峰3～5与S1峰的相对保留时间。与去氧甘松醇A对照品参照物相应的峰为S2峰，计算峰6、峰8～9与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.47(峰1)、1.06(峰3)、1.31(峰4)、1.63(峰5)、0.92(峰6)、2.67(峰7)、1.14(峰8)、1.30(峰9)。计算峰5、峰7(S2)与S1峰的相对峰面积，其相对峰面积应在规定值的范围之内。规定值为：不得小于0.13(峰5)、不得小于1.5(峰7)。测定结果表明18批次的甘松标准汤剂冻干粉各个特征峰规定的相对保留时间均在规定值的±10％之内。

对照图谱的拟合方式采用Mark峰拟合。

表15甘松饮片标准汤剂(冻干粉)对照图谱相对保留时间

表16甘松饮片标准汤剂(冻干粉)对照图谱相对峰面积

表17甘松对照药材特征图谱相对保留时间

表18甘松对照药材特征图谱相对峰面积

(2)特征图谱传递

分别以18批甘松饮片为供试品按照实施例1的方法构建特征图谱，建立甘松饮片对照特征图谱并与甘松标准汤剂冻干粉对照特征图谱比较，结果见下表所示，

表19甘松饮片及甘松饮片标准汤剂对照图谱相对保留时间

表20甘松饮片及甘松饮片标准汤剂对照图谱相对峰面积

结果显示，根据研究选用的18批甘松饮片、对应的18批甘松饮片标准汤剂，按实施例1项下方法进行测定，得到的特征峰数量一致，且相对保留时间也基本一致。说明甘松饮片按传统制备方法制得的标准汤剂冻干粉中，与原料的化学成分一致，说明甘松饮片经水煮后物质基础未发生改变，量值传递关系良好。

(3)峰指认

对照品溶液的制备：取绿原酸、隐绿原酸、去氧甘松醇A、甘松新酮二醇和甘松香酮A适量，精密称定，分别加甲醇制成每1mL对照品溶液中含40μg绿原酸、40μg隐绿原酸、100μg去氧甘松醇A、40μg甘松新酮二醇和40μg甘松香酮A的溶液，即得。

取上述实施例1制得的甘松标准汤剂冻干粉的供试品溶液，将各对照品溶液及供试品溶液，按实施例1的方法高效液相色谱法进行检测后比对，结果如图37。

小结：甘松标准汤剂冻干粉供试品色谱图中峰2为绿原酸；峰3为隐绿原酸；峰7为去氧甘松醇A；峰8为甘松新酮二醇；峰9为甘松香酮A。

并通过LC/MS/MS对峰1、峰4～5进行分子量及分子结构分析，便于为后续特征成分峰的定性提供参考依据。LC/MS/MS分析结构见报告。

表21甘松饮片标准汤剂LC/MS/MS分析结果

实施例4方法学验证

1、专属性

精密吸取实施例1制得的供试品溶液、阴性空白溶液(50％甲醇)各10μL，分别注入液相色谱仪，按实施例1的方法检测，结果阴性无干扰。

2、仪器精密度试验

以甘松标准汤剂冻干粉为供试品按照实施例1的方法制备供试品溶液，取同一份甘松标准汤剂冻干粉的供试品溶液，按实施例1下的色谱条件，重复进样6次，测定9个共有特征峰的相对保留时间，并进行分析。

结果表明，各特征峰与参照物S峰的相对保留时间的RSD均小于2％，表明仪器精密度良好。

3、方法重复性试验

取同一批甘松标准汤剂冻干粉6份，按实施例1的下方法分别测定9个共有特征峰的相对保留时间，并进行分析。

结果表明，各特征峰与参照物S峰的相对保留时间的RSD小于2.0％，表明本方法重复性良好。

4、中间精密度(不同操作人员)

分别由三名检验员在不同的时间，用同一台设备，按实施例1的下色谱条件测定同一批号的甘松标准汤剂冻干粉，分别测定9个共有特征峰的相对保留时间，并进行分析。

结果表明，各特征峰与参照物S峰的相对保留时间的RSD均小于2.0％，表明方法中间精密度(不同人员)良好。

5、稳定性考察

取同一甘松标准汤剂冻干粉为供试品按实施例1供试品溶液的制备和高效液相色谱法检测，分别在制备后0h、2h、4h、6h、10h、12h、24h进样，测定9个共有特征峰的相对保留时间，并进行分析，确定供试品溶液的稳定性。

结果表明，各特征峰与参照物S峰的相对保留时间的RSD均小于2％，表明供试品溶液在24小时内稳定，符合测定要求。

实施例5

本实施例提供了一种不同基原的甘松标准汤剂冻干粉的鉴别方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备：分别取3批匙叶甘松标准汤剂冻干粉为供试品按照实施例1的方法制得供试品溶液。

(2)高效液相色谱法检测：同实施例1。制得3批匙叶甘松标准汤剂冻干粉特征图谱。

结果见下表和图38所示，通过与18批甘松基原的甘松标准汤剂冻干粉特征图谱对比结果可知，不同品种甘松样品均存在9个峰，匙叶甘松样品中峰5要比甘松样品响应较低，故可通过规定5峰与峰2(S1、绿原酸)的相对峰面积范围来区分不同品种的甘松与匙叶甘松样品，对3批次匙叶甘松饮片标准汤剂特征图谱峰5与峰2(S1、绿原酸)的相对峰面积进行测定分析，范围为0.012-0.058，均值为0.039。18批甘松饮片标准汤剂峰5与峰2(S1、绿原酸)相对峰面积范围为0.19-0.76，均值为0.36，SD为0.12，下限-30％为0.13，故将5峰与S1峰相对峰面积值规定为不得过0,13。即规定甘松配方颗粒的峰5与峰2(S1、绿原酸)的相对峰面积不大于0.13，即可作为不同品种甘松的区分鉴别。

本实施例还提供了一种不同部位来源的甘松标准汤剂冻干粉的鉴别方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备：分别取5批采用甘松叶子为原料制备的甘松标准汤剂冻干粉为供试品按照实施例1的方法制得供试品溶液。

(2)高效液相色谱法检测：同实施例1。制得5批部位来源为甘松叶子的甘松标准汤剂冻干粉特征图谱。

结果见下表和图39所示，通过与18批部位来源为甘松根及根茎的甘松标准汤剂冻干粉特征图谱对比结果可知，甘松根及根茎特征图谱中绿原酸色谱峰的响应较小，去氧甘松醇A色谱峰响应较大；甘松叶子特征图谱中，绿原酸色谱峰响应较大，去氧甘松醇A色谱峰响应非常小，故可通过规定峰7(S2、去氧甘松醇A)与峰2(S1、绿原酸)的相对峰面积来控制甘松药材质量。18批甘松药材特征图谱中峰7(S2、去氧甘松醇A)与峰2(S1、绿原酸)相对峰面积范围为2.21-10.41，均值为4.04，故建议规定甘松药材特征图谱中峰7(S2、去氧甘松醇A)与2峰(S1、绿原酸)的相对峰面积不得小于1.5，可控制甘松药材质量。

表22 18批甘松饮片标准汤剂相对峰面积比值

表23 3批匙叶甘松饮片标准汤剂峰5/峰S1相对峰面积比值

表24 5批甘松全草不同部位对峰面积比值

实施例6

本实施例提供了一种甘松标准汤剂冻干粉中绿原酸的含量测定方法，包括，

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸溶液(10：90)为流动相；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为327nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备取绿原酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含40μl的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品粉末0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率30kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例7

本实施例提供了一种甘松标准汤剂冻干粉中去氧甘松醇A的含量测定方法，包括，

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(30:70)为流动相；流速为每分钟1.0ml，柱温为25℃，检测波长为236nm。理论板数按去氧甘松醇A峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备取去氧甘松醇A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品粉末0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例8绿原酸含量测定方法的考察

(1)流动相成分的考察

取实施例6制得的供试品溶液进行HPLC测试，分别采用如下流动相①：0.1％磷酸-乙腈(体积比90：10)②：0.05％磷酸-乙腈(体积比90：10)③：0.2％磷酸-乙腈(体积比90：10)，考察不同流动相对指标成分分离效果的影响，其余色谱条件均与实施例6相同。结果显示，不同浓度磷酸对指标成分的分离效果影响不大，因此方法选定流动相系统为0.1％磷酸-乙腈。

(2)流速的选择

取实施例6制得的供试品溶液进行HPLC测试，分别采用如下0.9、1.0、1.1ml/min流速，考察不同流速对指标成分分离效果的影响，其余色谱条件均与实施例6相同。结果显示，当流速为1.0ml/min时指标成分的分离效果和系统适应性参数相对较优，因此选定流速为1.0ml/min。

(3)柱温的选择

取实施例6制得的供试品溶液进行HPLC测试，分别采用如下20℃、25℃、30℃柱温，考察不同柱温对指标成分分离效果的影响，其余色谱条件均与实施例6相同。结果显示，当柱温为25℃时指标成分的分离效果和系统适应性参数相对较优，温度对故确定柱温为25℃。

(4)色谱柱的选择

取实施例6制得的供试品溶液进行HPLC测试，分别采用如下不同的色谱柱(1、Dikma Platisil ODS；2、HEXI Morphing WD-C18；3、Welch Ultimate XB-C18)，考察不同色谱柱对指标成分分离效果的影响，其余色谱条件均与实施例6相同。结果显示，结果不同色谱柱条件下测定的绿原酸的色谱峰系统适应性参数及分离效果影响较小，故无需不固定色谱柱。

(5)色谱仪的选择

取实施例6制得的供试品溶液进行HPLC测试，分别采用如下不同的色谱仪(1、戴安；2、安捷伦；3、waters)，考察不同色谱仪对指标成分分离效果的影响，其余色谱条件均与实施例6相同。结果显示，结果不同色谱柱条件下测定的绿原酸的色谱峰系统适应性参数及分离效果影响较小，故无需不固定色谱柱。

(6)超声功率的考察

考察不同超声功率(100W、200W、250W)对供试品中指标成分绿原酸含量的影响，其余工艺条件均如实施例6。按照实施例6的色谱条件检测，每组平行制样2份进行测试，100W、200W和250W的功率的平均值依次为14.7mg/g、14.8mg/g、14.8mg/g，各组相对平均偏差分别为0.34％、0.14％、0.20％。

试验结果表明，不同超声功率下，测定的甘松标准汤剂冻干粉含量结果基本相同，说明超声功率对含量测定影响不大，因此优选常用的250W作为甘松标准汤剂冻干粉含量测定的超声功率。

(7)提取溶剂种类的选择

考察不同提取溶剂(水、甲醇、乙醇、50％甲醇及50％乙醇)对甘松饮片标准汤剂中绿原酸含量的提取效果，其余工艺条件均如实施例6。按照实施例6的色谱条件检测。每组平行制样2份进行测试，水、乙醇、甲醇、50％乙醇及50％甲醇的平均值依次为14.4mg/g、11.3mg/g、12.7mg/g、14.3mg/g和14.7mg/g，各组相对平均偏差分别为0.38％、0.93％、1.74％、1.09％和0.31％。

结果表明采用不同类型的提取溶剂对甘松标准汤剂冻干粉的含量测定有一定影响。50％甲醇测得的含量最高，因此优选50％甲醇作为甘松标准汤剂冻干粉含量测定的提取溶剂。

(8)溶剂用量的选择

分别考察不同提取溶剂用量：10、25、50mL对甘松饮片标准汤剂中绿原酸含量的提取效果。其余工艺条件均如实施例6，按照实施例6的色谱条件检测。每组平行制样2份进行测试，10、25、50mL的平均值依次为14.4mg/g、14.7mg/g、14.7mg/g，各组相对平均偏差为0.69％、0.31％、0.17％。结果表明，三个提取体积均能完全提取绿原酸含量，提取效率接近。故优选25mL作为本试验提取体积。

(9)超声时间的考察

分别考察提取时间15、30、45分钟对甘松饮片标准汤剂中绿原酸含量的提取效果。其余工艺条件均如实施例6，按照实施例6的色谱条件检测。每组平行制样2份进行测试，15、30、45分钟的平均值依次为14.5mg/g、14.7mg/g、14.7mg/g，各组相对平均偏差为0.24％、0.31％、0.17％。结果表明当超声时间15-45分钟时，含量结果相当，将甘松标准汤剂冻干粉含量测定的超声时间优选为30分钟。

(10)取样量考察

分别考察取样量0.05g、0.1g、0.2g对甘松饮片标准汤剂中绿原酸含量的提取效果。其余工艺条件均如实施例6，按照实施例6的色谱条件检测。每组平行制样2份进行测试，0.05g、0.1g、0.2g的平均值依次为14.7mg/g、14.7mg/g、14.6mg/g，各组相对平均偏差为0.24％、0.31％和0.07％。

试验结果表明，取样量0.05g～0.1g之间，提取效率接近，提取完全，故选取样量为0.1g作为本试验取样量。

实施例9去氧甘松醇A含量测定方法的考察

(1)流动相成分的考察

取实施例7制得的供试品溶液进行HPLC测试，分别采用如下流动相①：0.1％甲酸-乙腈(体积比65：35)②：0.1％甲酸-乙腈(体积比67：33)③：0.1％甲酸-乙腈(体积比70：30)，考察不同流动相对指标成分分离效果的影响，其余色谱条件均与实施例7相同。结果显示，梯度条件3中基线更加平稳，故最终优选梯度3(0.1％甲酸-乙腈(体积比70：30))进行后续的研究。

(2)流动相成分的选择

取实施例7制得的供试品溶液进行HPLC测试，分别采用如下流动相①：0.1％甲酸-乙腈(体积比70：30)②：0.1％醋酸-乙腈(体积比70：30)③：水-乙腈(体积比70：30)④0.1％甲酸-甲醇(体积比70：30)，考察不同流动相对指标成分分离效果的影响，其余色谱条件均与实施例7相同。结果显示，甲醇流动相无法出峰，不同水相对指标成分的分离效果影响不大，因此方法选定流动相系统为水-乙腈。

(3)流速的选择

取实施例7制得的供试品溶液进行HPLC测试，分别采用如下0.8、1.0、1.2ml/min流速，考察不同流速对指标成分分离效果的影响，其余色谱条件均与实施例7相同。结果显示，当流速为1.0ml/min时指标成分的分离效果和系统适应性参数相对较优，因此选定流速为1.0ml/min。

(4)柱温的选择

取实施例7制得的供试品溶液进行HPLC测试，分别采用如下20℃、25℃、30℃柱温，考察不同柱温对指标成分分离效果的影响，其余色谱条件均与实施例7相同。结果显示，当柱温为25℃时指标成分的分离效果和系统适应性参数相对较优，温度对故确定柱温为25℃。

(5)色谱柱的选择

取实施例7制得的供试品溶液进行HPLC测试，分别采用如下不同的色谱柱(1、Water HSS T3(4.6×250mm,5μm)；2、Agilent TC-C18(4.6×250mm,5μm)；3、岛津InrtsilODS-3(4.6×250mm,5μm))，考察不同色谱柱对指标成分分离效果的影响，其余色谱条件均与实施例7相同。结果显示，结果不同色谱柱条件下测定的去氧甘松醇A的色谱峰系统适应性参数及分离效果影响较小，故无需不固定色谱柱。

(6)色谱仪的选择

取实施例7制得的供试品溶液进行HPLC测试，分别采用如下不同的色谱仪(1、戴安；2、安捷伦；3、waters)，考察不同色谱仪对指标成分分离效果的影响，其余色谱条件均与实施例7相同。结果显示，结果不同色谱柱条件下测定的去氧甘松醇A的色谱峰系统适应性参数及分离效果影响较小，故无需不固定色谱柱。

(7)提取溶剂种类的选择

考察不同提取溶剂(水、甲醇、乙醇、50％甲醇及50％乙醇)对甘松饮片标准汤剂中去氧甘松醇A含量的提取效果，其余工艺条件均如实施例7。按照实施例7的色谱条件检测。每组平行制样2份进行测试，水、乙醇、甲醇、50％乙醇及50％甲醇的平均值依次为18.2mg/g、17.3mg/g、18.5mg/g、18.8mg/g和18.7mg/g，各组相对平均偏差分别为0.33％、0.63％、0.22％、0.53％和0.19％。

结果表明采用不同类型的提取溶剂对甘松标准汤剂冻干粉的含量测定无明显差异。70％甲醇作为提取溶剂时供试品溶液中去氧甘松醇A的含量稍高，故提取溶剂优选为70％甲醇。

(8)超声时间的考察

分别考察提取时间15、30、45分钟对甘松饮片标准汤剂中去氧甘松醇A含量的提取效果。其余工艺条件均如实施例7，按照实施例7的色谱条件检测。每组平行制样2份进行测试，15、30、45分钟的平均值依次为18.7mg/g、18.8mg/g、18.8mg/g，各组相对平均偏差为0.11％、0.53％、0.13％。结果表明当超声时间15-45分钟时，含量结果相当，将甘松标准汤剂冻干粉含量测定的超声时间优选为30分钟。

(9)取样量考察

分别考察取样量0.05g、0.1g、0.2g对甘松饮片标准汤剂中去氧甘松醇A含量的提取效果。其余工艺条件均如实施例7，按照实施例7的色谱条件检测。每组平行制样2份进行测试，0.05g、0.1g、0.2g的平均值依次为18.8mg/g、18.8mg/g、18.7mg/g，各组相对平均偏差为0.45％、0.53％和0.51％。

试验结果表明，取样量0.05g～0.1g之间，提取效率接近，提取完全，优选取样量为0.1g作为本试验取样量。

(10)取样量考察

分别考察不同提取溶剂用量：5μL、10μL、15μL对甘松饮片标准汤剂中去氧甘松醇A含量影响。其余工艺条件均如实施例7，按照实施例7的色谱条件检测。每组平行制样2份进行测试，5μL、10μL、15μL的平均值依次为18.8mg/g、18.8mg/g、18.7mg/g，各组相对平均偏差为0.19％、0.53％和0.27％。

试验结果表明，取样溶剂用量：5μL、10μL、15μL，提取效率接近，提取完全，优选10μL作为本试验进样体积。

实施例10方法学验证

分别对实施例6和7的方法进行方法学验证。

1、专属性考察

取空白样品溶液(甲醇)和实施例6制得的供试品溶液和对照品溶液，按照实施例6项下的色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图，结果见图36和37所示，阴性对照试验无干扰。

取空白样品溶液(甲醇)和实施例7制得的供试品溶液和对照品溶液，按照实施例7项下的色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图，结果见图36和37所示，阴性对照试验无干扰。

2、线性关系考察

取绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含2.651μg、5.303μg、10.61μg、21.21μg、53.03μg、106.1μg、212.1μg的溶液，精密吸取以上7个不同浓度的绿原酸对照品10μl注入液相色谱仪，按照实施例6项下的色谱条件测定峰面积，以绿原酸进样质量浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。测定结果图见下表，标准曲线见下图，回归方程：y＝0.8531x-1.5069，R

取去氧甘松醇A对照品适量，加甲醇分别制成每1mL含432.2μg、216.1μg、108.1μg、43.2μg、21.6μg、4.32μg的溶液，精密吸取以上不同浓度的去氧甘松醇A对照品溶液10μL注入液相色谱仪，按照实施例7项下的色谱条件测定峰面积，以去氧甘松醇A的进样质量浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。结果见下表，回归方程为：y＝0.3697x+2.0155，R

3、精密度试验

(1)仪器精密度试验

取同一份实施例6制备得到的甘松饮片标准汤剂(批号：A1)供试品溶液，按照实施例6项下的色谱条件重复进样6次，测定绿原酸峰面积，结果峰面积RSD值为0.29％，说明该方法仪器精密度良好。

取同一份实施例7制备得到的甘松饮片标准汤剂(批号：A1)供试品溶液，按照实施例7项下的色谱条件重复进样6次，测定去氧甘松醇A峰面积，结果峰面积RSD值为0.24％，说明该方法仪器精密度良好。

(2)不同人员中间精密度考察

取同一批甘松饮片标准汤剂(批号：A1)，由甲、乙、丙实验人员分开独立操作，按实施例6项的方法处理，测定绿原酸含量的RSD为0.80％，结果表明该方法在不同操作人员中间精密度良好。

取同一批甘松饮片标准汤剂(批号：A1)，由甲、乙、丙实验人员分开独立操作，按照实施例7项的方法处理，测定去氧甘松醇A含量的RSD为0.28％，结果表明该方法在不同操作人员中间精密度良好。

(3)重复性考察

取同一批甘松饮片标准汤剂(批号：A1)6份，按实施例6项的方法处理，测定并计算含量结果RSD％。结果见下表，RSD为0.82％，表明该方法重复性良好。

取同一批甘松饮片标准汤剂(批号：A1)6份，按实施例7供试品溶液的制备方法制备，按照实施例7项下的色谱条件进行HPLC分析，测定并计算含量结果RSD％。结果见下表，RSD为0.33％，表明该方法重复性良好。

(4)准确度考察

即加样回收试验，精密称取6份甘松饮片标准汤剂(批号：A1)样品(随行样品绿原酸含量为14.86mg/g)约0.05g，用50％甲醇配制绿原酸对照品溶液(0.0155mg/mL、0.0309mg/mL、0.0464mg/mL)分别精密加入25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，用50％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。按照实施例6项下的色谱条件进行HPLC分析，平均回收率为99.2％，RSD值为1.2％，实验结果表明方法准确性良好。

精密称取6份甘松饮片标准汤剂(批号：A1)样品(随行样品去氧甘松醇A含量为18.7mg/g)约0.05g，用70％甲醇配置绿原酸对照品溶液(0.0267mg/mL、0.0534mg/mL、0.08005mg/mL)分别精密加入20mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。按照实施例7项下的色谱条件进行HPLC分析，平均回收率为99.0％，RSD值为0.83％，实验结果表明方法准确性良好。

(5)溶液的稳定性

取同一份实施例6制备得到的甘松饮片标准汤剂(批号：A1)供试品溶液，分别在第0、2、4、8、10、12、18、24小时注入液相色谱仪中，按照实施例6项下的色谱条件进行HPLC分析，测定绿原酸峰面积，计算峰面积RSD值。结果见下表，RSD值为0.60％，表明供试品溶液在24小时内稳定，可以满足测定需要。

取同一份实施例7制备得到的甘松饮片标准汤剂(批号：A1)供试品溶液，分别在第0、2、4、8、12、24小时注入液相色谱仪中，按照实施例7项下的色谱条件进行HPLC分析，测定去氧甘松醇A峰面积，计算峰面积RSD值。结果见下表，RSD值为0.67％，表明供试品溶液在24小时内稳定，可以满足测定需要。

(6)耐用性考察

①不同流速耐用性考察

取同一份实施例6制备得到的甘松饮片标准汤剂(批号：A1)供试品溶液，分别用不同流速0.9ml/min；1.0ml/min；1.1ml/min下进行试验，其余均按照实施例6项下的色谱条件进行HPLC分析，测定绿原酸含量的RSD为0.44％，结果表明不同流速对指标成分的含量的影响不大，表明该方法对流速的耐用性较为良好。

取同一份实施例7制备得到的甘松饮片标准汤剂(批号：A1)供试品溶液，分别用不同流速0.9ml/min；1.0ml/min；1.1ml/min下进行试验，其余均按照实施例7项下的色谱条件进行HPLC分析，测定去氧甘松醇A含量的RSD为0.88％，结果表明不同流速对指标成分的含量的影响不大，表明该方法对流速的耐用性较为良好。

②不同柱温的考察

取同一份实施例6制备得到的甘松饮片标准汤剂(批号：A1)供试品溶液，分别在不同柱温23℃、25℃、27℃下进行试验，其余均按照实施例6项下的色谱条件进行HPLC分析，测定绿原酸含量的RSD为0.83％，结果表明不同柱温对指标成分的含量的影响不大。

取同一份实施例7制备得到的甘松饮片标准汤剂(批号：A1)供试品溶液，分别在不同柱温23℃、25℃、27℃下进行试验，其余按照实施例7项下的色谱条件进行HPLC分析，测定去氧甘松醇A含量的RSD为0.61％，表明不同柱温对指标成分的含量的影响不大。

③不同仪器耐用性的考察

取同一份实施例6制备得到的甘松饮片标准汤剂(批号：A1)供试品溶液，分别用不同型号仪器(1、Waters e2695；2、Agilent 1260；3、戴安U3000)进样，按照实施例6项下的色谱条件进行HPLC分析，测定绿原酸含量。结果不同型号色谱柱条件下测定的绿原酸含量较为接近，RSD为0.80％，表明该方法对流速的耐用性较为良好。

取同一份实施例7制备得到的甘松饮片标准汤剂(批号：A1)供试品溶液，分别用不同型号仪器(1、Waters；2、Agilent；3、戴安)进样，按照实施例7项下的色谱条件进行HPLC分析，测定去氧甘松醇A含量。结果不同型号色谱柱条件下测定的去氧甘松醇A含量较为接近，RSD为0.72％，表明该方法对流速的耐用性较为良好。

④不同色谱柱的考察

取同一份实施例6制备得到的甘松饮片标准汤剂(批号：A1)供试品溶液，分别用不同型号色谱柱(1、Dikma；2、HEXI；3、Welch)进样，按照实施例6项下的色谱条件进行HPLC分析，测定绿原酸含量。结果不同型号色谱柱条件下测定的绿原酸含量较为接近，RSD为0.40％，表明该方法对不同色谱柱的耐用性较好。

取同一份实施例7制备得到的甘松饮片标准汤剂(批号：A1)供试品溶液，分别用不同型号色谱柱(1、Water T3；2，Agilent TC-C18；3；岛津Inrtsil ODS-3)进样，按照实施例7项下的色谱条件进行HPLC分析，测定去氧甘松醇A含量。结果不同型号色谱柱条件下测定的去氧甘松醇A含量较为接近，RSD为0.58％，表明该方法对流速的耐用性较为良好。

(7)甘松标准汤剂冻干粉含量测定

取18批甘松饮片标准汤剂(冻干粉)样品，按照实施例6项下的方法处理测定各批次冻干粉绿原酸的含量并计算转移率。结果显示：各批次标准汤剂中绿原酸含量实测平均转移率范围为25.7％-42.2％，均值33.0％，SD为4.7％，均值±30％的波动范围为23.1％-42.8％。规定甘松饮片标准汤剂中绿原酸含量转移率范围为25.0％～42.0％，结合实际出膏率折算至冻干粉平均绿原酸含量范围为7.6-16.2mg/g，均值为10.2mg/g，SD为2.4mg/g，均值±30％范围为7.2-13.3mg/g，根据理论值规定甘松饮片标准汤剂冻干粉绿原酸含量范围为7.6-16.0mg/g，符合《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》。

取18批甘松饮片标准汤剂(冻干粉)样品，按照实施例7项下的方法处理测定各批次冻干粉去氧甘松醇A的含量并计算转移率。结果显示：各批次标准汤剂中去氧甘松醇A含量实测平均转移率范围为77.6％-95.2％，均值87.9％，SD为5.6％，均值±30％的波动范围为61.5％-114.3％。规定甘松饮片标准汤剂中去氧甘松醇A含量转移率范围为77.5％～95.0％，结合实际出膏率折算至冻干粉平均去氧甘松醇A含量范围为13.9-32.8mg/g，均值为21.2mg/g，SD为6.0mg/g，均值±30％范围为14.9-27.6mg/g，根据理论值规定甘松饮片标准汤剂冻干粉去氧甘松醇A含量范围为14.0-33.0mg/g，符合《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》。

根据以上结果，规定甘松饮片标准汤剂含量如下：本品每1g含挥发油为：1.0％-3.5％(ml/g)，含去氧甘松醇A(C12H16O2)应为14.0mg-33.0mg，含绿原酸(C16H18O9)应为7.6mg～16.0mg。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。