一株生防菌株萎缩芽孢杆菌BGB-98R及其应用

技术领域

本申请涉及微生物及其应用的技术领域，更具体地说，涉及一株生防菌株萎缩芽孢杆菌BGB-98R及其应用。

背景技术

芽孢杆菌广泛存在于自然界中，属于一类好氧或兼性厌氧菌，芽孢杆菌可在恶劣的环境中产生抗逆性强的芽孢以度过不良的环境条件。从目前研究来看，芽孢杆菌的生防优势最为明显，不仅可以在恶劣环境下生长，还可在一定环境下大量繁殖，对一些较为常见的、易造成腐烂病的病原菌，如禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、灰霉等具有良好的抑制效果。

随着科学技术的发展，越来越多的菌种被发现和培养，但有些可被利用和在实验室内培养条件下的菌种在实际生产应用中生存能力较差。为了提高筛选菌种的生存能力，在极端环境进行菌种筛选，越来越有实用意义。沙漠土壤土体薄，水分少，缺乏腐殖质层，在沙漠中生存较为活跃的菌种，在实际生产应用中可能会更加的活跃。

随着人类对沙漠土壤的探索，越来越多的沙漠土壤被改造，种植作物或大田作物。但随着种植时间的增加，这些改造的土壤也变得不太适宜种植，如在沙漠中种植马铃薯产生连作障碍等。因此，急需获得能够改善沙漠土壤，使其适合种植作用的微生物菌种。

发明内容

本申请提供一株生防菌株萎缩芽孢杆菌BGB-98R及其应用。该萎缩芽孢杆菌BGB-98R具有较强的生防功能，在干旱贫瘠的土壤中可正常生长，同时能够降低马铃薯腐烂病病害率，可显著促进马铃薯生长，提高马铃薯产量，在田间使用中还可改善土壤微生物群落结构。

第一方面，本申请提供一种萎缩芽孢杆菌BGB-98R，采用如下的技术方案：

本申请提供的萎缩芽孢杆菌（拉丁文学名：

该菌株是从宁夏固原市西吉县红耀乡具有连作障碍非连作障碍区域的土壤样本中分离获得的。菌株营养细胞呈杆状、圆端，多数为单个、少数成对或链状排列，细胞壁为革兰阳性结构。最佳生长温度为28-32℃，最高生长温度为35℃，最低生长温度为18℃，需氧或兼性厌氧。在营养琼脂培养基28℃培养20h的菌落表面粗糙不透明，污白色或黄色，边缘形成皱醭，挑取为粘稠状或冻状。

从NCBI（GenBank）数据库中获取多个参比菌株序列，运用软件BioEdit和MEGA11对分离菌株和参比菌株的

在植物生长过程中，主要功能为可促进种子萌发、促进植物生长，并对土壤中镰刀菌等多种病原菌有较强的抑制作用，在干旱贫瘠的土壤中可正常生长，能够降低马铃薯腐烂病病害率，可显著促进马铃薯生长，提高马铃薯产量，还可改善土壤微生物的群落结构。菌株被释放到土壤中，对人、动物和植物均无害，不会污染环境，还可在一定情况下丰富自然界菌群结构，提高自然界菌群多样性。

第二方面，本申请提供一种培养物。该培养物包括上述萎缩芽孢杆菌BGB-98R。

本申请中，培养物可以是发酵液以及利用发酵液获得的发酵上清液。

第三方面，本申请提供一种发酵液。该发酵液包括上述萎缩芽孢杆菌BGB-98R。

第四方面，本申请提供一种菌悬液。该菌悬液包括上述萎缩芽孢杆菌BGB-98R。

第五方面，本申请提供一种菌剂。该菌剂包括上述萎缩芽孢杆菌BGB-98R。

第六方面，本申请提供一种菌粉。该培养物包括上述萎缩芽孢杆菌BGB-98R。

第七方面，本申请提供一种上述萎缩芽孢杆菌BGB-98R、培养物、发酵液、菌悬液、菌剂或菌粉在改善土壤微生物结构和病原菌防控领域的应用。

可选地，所述病原菌包括禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌和灰霉。

第八方面，本申请提供一种上述萎缩芽孢杆菌BGB-98R、培养物、发酵液、菌悬液、菌剂或菌粉在促进种子萌发和促进植株生长领域中的应用。

可选地，所述萎缩芽孢杆菌BGB-98R的菌含量为1×10

可选地，当所述萎缩芽孢杆菌BGB-98R的菌含量为5×10

可选地，所述萎缩芽孢杆菌BGB-98R能够在干旱贫瘠的土壤中可正常生长。

可选地，所述萎缩芽孢杆菌BGB-98R能够降低马铃薯腐烂病病害率，显著促进马铃薯生长，提高马铃薯产量。

可选地，所述萎缩芽孢杆菌BGB-98R能够改善土壤微生物群落结构。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1. 本申请提供一种萎缩芽孢杆菌，命名为萎缩芽孢杆菌BGB-98R，该菌株于2023年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.27752。

2. 该萎缩芽孢杆菌BGB-98R呈杆状、圆端，多数为单个、少数成对或链状排列，细胞壁为革兰阳性结构。最佳生长温度为28-32℃，最高生长温度为35℃，最低生长温度为18℃，需氧或兼性厌氧。在营养琼脂培养基28℃培养20h的菌落表面粗糙不透明，污白色或黄色，边缘形成皱醭，挑取为粘稠状或冻状。

3. 在植物生长过程中，主要功能为可促进黄瓜种子萌发和促进黄瓜幼苗生长，并对土壤中镰刀菌等多种病原菌有较强的抑制作用，在田间应用中，在干旱贫瘠的土壤中可正常生长，能够降低马铃薯腐烂病病害率，可显著促进马铃薯生长，提高马铃薯产量，还可改善土壤微生物的群落结构。菌株被释放到土壤中，对人、动物和植物均无害，不会污染环境，还可在一定情况下丰富自然界菌群结构，提高自然界菌群多样性。

4. 当所述萎缩芽孢杆菌BGB-98R的菌含量为5×10

附图说明

图1为分离菌株的镜检观察结果（1000×）（其中，A为分离菌株培养15h的结果-对数生长期；B为分离菌株培养40h的结果-产孢期）。

图2为分离菌株在营养琼脂培养基上的生长状态。

图3为分离菌株的系统发育树。

图4为体现菌种BGB-98R对病原菌抑制作用的结果图（其中，A为菌种BGB-98R抑制禾谷镰刀菌的结果；B为菌种BGB-98R抑制尖孢镰刀菌的结果；C为菌种BGB-98R抑制灰霉的结果）。

图5为体现菌种BGB-98R对黄瓜幼苗促生作用的结果图。

图6为微生物菌剂田间试验中对土壤微生物（真菌）丰度结构的影响。

图7为微生物菌剂田间试验中对土壤微生物（细菌）丰度结构的影响。

图8为微生物菌剂田间试验-马铃薯的试验结果。

具体实施方式

本申请提供一种萎缩芽孢杆菌（

将本申请提供的萎缩芽孢杆菌BGB-98R以及包括该菌株的培养物、发酵液、菌悬液、菌粉、菌剂在改善土壤微生物结构和病原菌防控领域的应用。还能够促进种子萌发和促进植株生长。在进行种子萌发和植株生长的试验中，萎缩芽孢杆菌BGB-98R的菌含量选择1×10

本申请中用到的培养基配方及制备方法如下：

营养液体培养基：称取蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 10g，溶于1L纯水中，pH：6.8-7.5。

营养琼脂培养基：称取蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 10g、琼脂 20g，溶于1L纯水中，pH：6.8-7.5。

营养土配制及营养指标：将北京嘉博文沃美克有机源土壤调理剂与珍珠岩、蛭石、椰糠按照3:1:2:4体积比配制营养土，灭菌后检测常规营养指标（干基）分别为：有机质65%，氮1.45%，磷0.37%，钾0.16%。

液体发酵种子液培养基：称取蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 10g、酵母粉5g、玉米粉10g，溶于1L纯水中，pH：6.5-7.5。

液体发酵培养基：酵母粉5g/L、玉米粉10g/L、糖蜜10g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、硫酸镁0.3g/L、碳酸钙1g/L、消泡剂0.5g/L，投入液体发酵罐中，溶于纯水中，pH：5.5-6.5。

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本申请的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

以下各实施例中所使用的试剂、溶剂和其它试验材料均可以通过商购获得。

本申请中所用到的仪器设备：培养箱（上海精宏-DHG-9030A）、低速离心机（四川蜀科-DD5000）、振荡培养箱（上海知楚-ZQZY-78BV）、pH计（上海雷磁PHS-3E）、紫外可见分光光度计（青岛-聚创UV759CRT）、液体发酵罐系统（上海国强生化工程装备有限公司-FUS-50L-300L）、喷雾干燥机（上海豫明仪器有限公司-YM-5L）。

以下结合实施例、附图以及性能检测结果对本申请作进一步详细说明。

实施例

实施例1

本实施例提供了一种新菌种的获得过程。具体如下：

（1）土壤样品采集：采集来甘肃古浪县西靖镇兴民新村雪川农业集团马铃薯种植基地（东经103°34′42″，北纬37°35′23″）具有马铃薯连作障碍非连作障碍区域的土壤（土壤主要理化性质：有机质2.41g/kg；碱解氮151mg/kg；速效磷9mg/kg；速效钾36mg/kg；pH6.06），并进行日期及其他信息登记，在4℃低温环境下保藏送至实验室。

（2）目标菌种初步分离：称取上述采集的土壤样品10g，无菌条件下加入到预先灭菌的盛有100ml生理盐水的三角瓶中，28℃、160rpm条件下充分振荡30min后，静置15min，按比例稀释至10

（3）初步鉴定：将分离纯化得到的菌株（即分离菌株）于显微镜下镜检并观察，结果如图1所示。图1中分别示出了上述分离菌株培养15h（对数生长期）和40h（产孢期）的培养情况。

根据图1的镜检结果，初步确定分离菌株为芽孢杆菌属。

实施例2——单菌株性质和

本实施例提供了实施例1获得的分离菌株的单菌株性质和

（一）单菌株性质

（1）形态特征

分离菌株营养细胞呈杆状、圆端，多数为单个、少数成对或链状排列，细胞壁为革兰阳性结构。最佳生长温度为28-32℃，最高生长温度为35℃，最低生长温度为18℃，需氧或兼性厌氧。在营养琼脂培养基28℃培养20h的菌落表面粗糙不透明，污白色或黄色，边缘形成皱醭，挑取为粘稠状或冻状，如图2所示。

（2）培养特性

菌株最适生长条件为：pH＝7.0，温度30℃，转速180r/min，可利用广泛的碳源和氮源。

（3）功能特性

在植物生长过程中，主要功能为可促进黄瓜种子萌发并促进黄瓜幼苗生长，并对土壤中镰刀菌等多种病原菌有较强的抑制作用，在干旱贫瘠土壤中可正常生长，降低马铃薯腐烂病病害率，可显著促进马铃薯生长，提高马铃薯产量，可改善土壤微生物结构。菌株被释放到土壤中，对人、动物和植物均无害，不会污染环境，还可在一定情况下丰富自然界菌群结构，提高自然界菌群多样性。

（二）

为鉴定本菌株的系统发育地位，对该分离菌株的

从NCBI（GenBank）数据库中获取9个参比菌株序列，运用软件BioEdit和MEGA11对分离菌株的

与相关技术相比，本申请分离获得的菌株BGB-98R具有如下效果：菌株BGB-98R具有促生防病的特性，植物促生试验发现，与不接种相比，接种该菌株可显著促进种子萌发，并可抑制土壤中多种病原菌的生长，可在28-32℃正常生长。本申请分离获得的菌株BGB-98R在干旱贫瘠的土壤中也可正常生长，且能够降低马铃薯腐烂病病害率，可显著促进马铃薯生长，提高马铃薯产量，改善土壤微生物群落结构，可用于实际生产。

将萎缩芽孢杆菌（

实施例3

本实施例提供了一种萎缩芽孢杆菌BGB-98R的发酵液。

上述发酵液的制备方法具体如下：

将实施例1获得的分离菌株进行活化，并转接于营养液体培养基中，在28℃条件下培养20h，获得萎缩芽孢杆菌BGB-98R的发酵液。

实施例4

本实施例提供了一种萎缩芽孢杆菌BGB-98R的发酵上清液。

上述发酵上清液的制备方法具体如下：

将实施例1获得的分离菌株进行活化，并转接于营养液体培养基中，在28℃条件下培养20h，获得萎缩芽孢杆菌BGB-98R的发酵液；将发酵液离心，留上清，即为萎缩芽孢杆菌BGB-98R的发酵上清液。

实施例5

本实施例提供了一种萎缩芽孢杆菌BGB-98R的菌悬液。

上述菌悬液的制备方法具体如下：

将实施例1获得的分离菌株进行活化，并转接于营养液体培养基中，在28℃条件下培养24h，获得萎缩芽孢杆菌BGB-98R的发酵液；将发酵液离心，留沉淀，并用无菌水重悬沉淀，即为萎缩芽孢杆菌BGB-98R的菌悬液。

性能检测试验一——拮抗病原菌试验

对萎缩芽孢杆菌BGB-98R进行拮抗病原菌试验。供试的病原菌为禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、灰霉。具体如下：

（1）菌种BGB-98R：利用上述分离筛选得到的菌种BGB-98R活化后接种于营养液体培养基中进行培养，在30℃、220rpm的条件下培养至对数期（菌株的生长情况用核酸蛋白测定仪检测），并将其转接于营养琼脂培养基平板中，置于30℃的恒温培养箱中培养36h，备用。

病原菌：将4℃保存的禾谷镰刀菌PDA固体培养基平板、尖孢镰刀菌PDA固体培养基平板、灰霉PDA固体培养基平板打孔，取直径5mm圆形菌饼分别接种到PDA液体培养基平板上，置于28℃的恒温培养箱中培养3-4d，备用。

（2）将培养好的菌种BGB-98R的营养琼脂培养基平板打孔，取直径5mm圆形菌饼接种到新的PDA固体培养基平板距离平板中心2.5cm的位置。同理，将培养好的禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、灰霉的PDA液体培养基平板打孔，取直径5mm圆形菌饼分别接种到新的PDA固体培养基平板距离平板中心2.5cm的位置，作为处理组。新的PDA固体培养基平板中的病原菌和菌种BGB-98R的位置对称。同时，以接种禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、灰霉的PDA固体培养基平板作为对照组。置于28℃的恒温培养箱中培养至病原菌长满整个平板，观察抑菌效果，计算抑菌率。

抑菌率的计算公式如下：

抑菌率（％）＝（Rp-Rt）/Rp×100％。

其中，Rp表示对照组病原菌菌丝生长的半径，Rt表示处理组病原菌菌丝生长的半径（近菌株BGB-98R的一侧）。

（3）试验结果如图4和表1所示。

表1 菌种BGB-98R对病原菌的抑制效果

由表1和图4可知，萎缩芽孢杆菌BGB-98R对禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、灰霉病原菌具有显著的抑制作用。其中，对禾谷镰刀菌的抑菌率为44.39%，对尖孢镰刀菌的抑菌率为54.33%，对灰霉的抑菌率为53.90%。

性能检测试验二——促进种子萌发和促进植株生长试验

对萎缩芽孢杆菌BGB-98R进行促进种子萌发和促进植株生长试验。供试材料为黄瓜种子（中农16号）。具体如下：

（1）菌种BGB-98R：利用上述分离筛选得到的菌种BGB-98R活化后接种于营养液体培养基中进行培养，在30℃、220rpm的条件下培养至对数期（菌株的生长情况用核酸蛋白测定仪检测）。利用OD值估算含菌量并利用稀释涂布平板计数，用无菌水将发酵液稀释至菌含量为1×10

将已灭菌的营养土放置于育苗盘中，并分别设置处理组和对照组。处理组：利用菌含量为1×10

（2）促进种子萌发试验：将处理组和对照组的育苗盆放置于28℃的温室中12h，利用0.2%次氯酸钠处理黄瓜种子2min，并用无菌水洗5-10次。按照穴播的方式将黄瓜种子种植于育苗盘中，8-12d后观察黄瓜种子的萌发情况。处理组和对照组分别设置3个重复。

（3）促进植株生长试验：待黄瓜出苗后，将黄瓜幼苗分别移栽至处理组和对照组的育苗盆中，放置于人工生长室进行培养，30天后收获，并检测植株鲜重和根长。人工生长室的光周期设置为：日/夜=16h/8h；温度设置为：日/夜=30℃/24℃。处理组和对照组分别设置10个重复。

（4）试验结果如图5和表2所示。

萌发率（%）=种子发芽数/种子总数×100%。

表2 菌种BGB-98R对黄瓜种子萌发和植株生长的促进效果

结合图5和表2可知，与对照组的萌发率相比，处理组的萌发率具有显著差异。说明萎缩芽孢杆菌BGB-98R能够促进黄瓜种子萌发，处理组的萌发率比对照组的萌发率提高12.2%。

另外，与对照组的萌发率相比，处理组的根长和整株鲜重具有显著差异。说明萎缩芽孢杆菌BGB-98R能够促进黄瓜幼苗生长，处理组的根长比对照组的根长提高19.2%。

因此，萎缩芽孢杆菌BGB-98R可促进黄瓜种子萌发及黄瓜植株生长，对黄瓜的生长具有显著的促进作用。

实施例6

本实施例提供了一种萎缩芽孢杆菌BGB-98R的菌剂。

上述菌剂的制备过程具体如下：

利用已活化的菌株BGB-98R平板，利用打孔器打孔接种于具有液体发酵种子液培养基的500mL锥形瓶中，在30℃、180rpm的恒温摇床中培养24h，获得培养好的种子液，待用。

将培养好的种子液接种于300L发酵罐中，发酵罐发酵液体积为发酵罐总体积的70%，发酵接种量为1%，转速为200rpm，温度为28℃，通气量为1vvm，发酵20h补加20g/L的灭菌糖蜜水10L，持续发酵至45h，待芽孢率达到90%以上，下罐。

利用桶式离心机对上述发酵液进行离心，按照9：1的重量比向浆液中添加保护剂（保护剂中成分配比，糊精、分散剂、亚硫酸钠的重量比为40：9：1），即为萎缩芽孢杆菌BGB-98R的菌剂。

实施例7

本实施例提供了一种萎缩芽孢杆菌BGB-98R的菌粉。

上述菌粉的制备过程具体如下：将实施例6制得的菌剂进行喷雾干燥，干燥成为菌粉，即得萎缩芽孢杆菌BGB-98R的菌粉，菌粉菌含量为2000亿/g。

实施例8

本实施例提供了一种微生物菌剂。该微生物菌剂包括利用萎缩芽孢杆菌BGB-98R制得的菌剂。

上述微生物菌剂的制备过程具体如下：

将实施例6制得的菌剂与实施例3中北京嘉博文沃美克有机源土壤调理剂（菌剂载体）进行复配，按照菌粉与土壤调理剂重量比为1：400的比例均匀混合，混合后的微生物菌剂产品中含菌量为5亿/g。

性能检测试验三——利用微生物菌剂进行田间试验

对实施例8提供的微生物菌剂进行田间试验。具体如下：

（1）供试田

供试田：甘肃古浪县西靖镇兴民新村雪川农业集团马铃薯种植基地马铃薯田块，选择土地情况较为均匀的田块。

试验方法如下：2023年4月15日将微生物菌剂通过翻耕施入土壤中，40kg/亩，均匀混合，整平，7天后进行田间马铃薯春播。其他种植措施按照农事操作进行，不施用杀菌剂产品。试验在2个独立种植马铃薯区域（GB和GBS）进行，并设置对照实验（GBC和GBSC）不施用微生物菌剂，而加入等量菌剂载体和保护剂。每处理设置2亩，3次重复。施用本申请提供的微生物菌剂30d后在田间进行表层土壤取样，放置在冰盒里，带回实验室进行样品前处理。每处理利用5点取样法取样，每点取2m

微生物检测方法及结果：将上述样品进行前处理之后，送至北京诺禾致源科技股份有限公司，进行16S和ITS土壤微生物多样性建库测序，对测序结果进行分析。如图6和图7中物种相对丰度柱形图中，以属作为分析单位，取前20位丰度较高的微生物作为分析对象。

由图6和图7的结果可知，施用本申请提供的微生物菌剂30d，尤其是丰度较高的病原菌属

马铃薯田间试验结果如表3和图8所示。

表3 田间试验中微生物菌剂对马铃薯的促生和生防作用

表3和图8的结果显示，与对照组相比，施用本申请提供的微生物菌剂后，马铃薯的平均茎粗分别增加5.69%和8.8%，植株平均增高10.28%和12.02%，单株分枝数平均增加5.17%和8.20%，单株结薯量分别增加7.32%和7.69%，腐烂病病株率分别下降77.28%和79.31%。基于上述，与对照组相比，施用本申请提供的微生物菌剂可显著促进马铃薯生长，显著降低马铃薯腐烂病病株率。

另外，马铃薯田间测产结果显示，与对照组相比，施用本申请提供的微生物菌剂马铃薯亩产分别增加7.65%和6.15%。因此，基于上述可知，施用本申请提供的微生物菌剂可显著提高马铃薯产量。

由上述可知，本申请提供的菌株BGB-98R具有明显的抑制病原菌生长的特性。同时，还能够有效促进黄瓜种子萌发以及促进黄瓜幼苗生长。在田间实验中，菌株BGB-98R在干旱贫瘠土壤中可正常生长，且能够降低马铃薯腐烂病病害率，可显著促进马铃薯生长，提高马铃薯产量。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的精神和范围。