一种毛果杨bZIP2基因在调控植物叶片扩张中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种毛果杨bZIP2基因在调控植物叶片扩张方面的应用。

背景技术

植物叶片是植物的重要器官之一，是植物进行光合作用的主要场所，提供植物生长发育所需的物质能量，良好的叶片生长状态对繁殖成功至关重要。叶片大小受到了严格的时空遗传调控，通常植物叶片表皮细胞增殖和细胞扩张的精确调控是决定叶片最终大小的关键因素。因此，研究基因作用于植物叶片扩张对杨树的育种、生产及应用具有重要意义。

杨树(Populus L.)是一种杨柳目杨柳科植物具有适应性强、生长速度快、容易扩繁、树木笔直高大、用途广等特点，在全球都有广泛种植。

碱性亮氢酸拉链(Basic Leucine Zipper,bZIP)转录因子家族是目前在植物中发现的基因家族数量最大、最多样化且高度保守的基因家族之一。bZIP蛋白广泛存在于各种植物，参与植物体内的多种生物学过程。

发明内容

本发明的目的是提供毛果杨bZIP2基因在调控植物叶片扩张中的应用，首次证明了bZIP2基因在调控植物叶片扩张中具有重要作用，用于培育生物量快速积累植物。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种毛果杨bZIP2基因，所述bZIP2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了一种所述基因编码的转录因子bZIP2，所述转录因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种表达载体，包括所述的bZIP2基因。

本发明还提供了一种重组菌，包括所述的bZIP2基因或所述的表达载体。

本发明还提供了一种所述的bZIP2基因、所述的转录因子、所述的表达载体或所述的宿主在调控植物叶片扩张中的应用。

优选的，所述调控植物叶片扩张的方法为在84K杨中过表达所述bZIP2基因。

优选的，所述调控叶片扩张为叶片面积增加、叶片表皮细胞体积增大、叶片表皮细胞数量增加。

本发明首次发现证明了bZIP2基因在调控植物叶片扩张中具有重要作用，为培育生物量快速积累植物提供了思路。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次证明毛果杨bZIP2可以参与bZIP2基因在调控植物叶片扩张。通过对毛果杨bZIP2基因的克隆与鉴定，基因的表达分析，及遗传转化，验证其功能，发现过表达bZIP2基因的84K与野生型相比，过表达84K杨叶片面积增加；显微观察发现相比于野生型对照，过表达84K杨的叶片表皮细胞体积增大、细胞数量增加，呈现出显著的叶片生长表型。本发明的公开利用生物工程技术获得高表达的84K杨，调控植物叶片扩张(见附图1至附图4)。

附图说明

图1为实施例2中野生型(WT)84K杨与过表达bZIP2的84K杨鉴定结果(过表达的相对表达量)

图2为实施例2中野生型(WT)84K杨和过表达bZIP2的84K杨株系生长表型；

图3为实施例3中野生型(WT)84K杨和过表达bZIP2的84K杨株系叶片表型；

图4为实施例3中野生型(WT)84K杨和过表达bZIP2的84K杨株系叶片表皮细胞大小和数量变化。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的试剂。

实施例

实施例1：获得过表达bZIP2基因的84K杨

1.各组织总RNA的提取：取毛果杨健康植株，使用RNA提取试剂盒(诺唯赞)提取毛果杨RNA。所得RNA经浓度和纯度检测后存于-80℃冰箱保存备用。

2.第一链cDNA的合成：以所得到的总RNA为模板，使用反转录试剂盒(Promega)进行反转录。

3.目的基因引物的设计及克隆：以cDNA为模板，使用高保真酶(诺唯赞)与带过表达载体端的引物进行PCR扩增，获得便于无缝克隆的基因片段。

毛果杨bZIP2基因过表达引物+载体连接引物：

pBI121-bZIP2-F：

agaacacgggggactATGGCCTCTTCTAGTGGGG

pBI121-bZIP2-R:

acccccggggatcctGTACATAACCATGTCCATGATGG

(在过表达引物基础上加入Xcm I酶切位点以及载体上的重组同源片段)。

PCR反应完成后，电泳检测并使用DNA凝胶回收试剂盒(天根)回收目的片段，纯化PCR目的扩增产物。回收纯化的产物放置在-20℃冰箱，后续将用于与pBI121载体连接，构建过表达载体。

4.本实验使用PBI121载体，用XbaI限制性内切酶酶切，并回收载体骨架，与PCR回收的产物进行连接，转入DH5α大肠杆菌内，于抗性培养基(含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基)上进行筛选，构建含有bZIP2全长CDS的过表达载体。挑取阳性大肠杆菌菌落，提取质粒，验证序列是否正确。

5.将提取的质粒转化农杆菌GV3101菌株，在抗性培养基(含有50mg/L卡那霉素，50mg/L利福平的LB固体培养基)上进行筛选。挑取阳性菌株扩大培养并保存。将扩大培养的农杆菌菌株分装至50mL无菌离心管中，于离心机中以4℃，5000rpm的转速离心10min，弃去管中液体，保留菌体，向离心管中加入50mL事先配置好的重悬液备用。

6.取84K杨愈伤组织用于侵染。获得过表达株系。

实施例2：鉴定bZIP2过表达84K杨中的bZIP2基因表达量。

1.野生型84K杨和bZIP2过表达84K杨中分别提取RNA：使用植物RNA试剂盒(诺唯赞)从植物叶片中提取总RNA样品。

2.反转录PCR：以总RNA样品为模板，使用反转录试剂盒(Promega)获得野生型84K杨和bZIP2过表达84K杨的总cDNA。

3.实时荧光定量PCR：使用荧光定量PCR试剂盒(Takara TB

PCR引物序列如下：

qPCR-bZIP2-F:GGCATCTTCAGGGTCAACAG

qPCR-bZIP2-R:CCTTTTACGCTTCCTTAGGTCC

以84K杨18S基因为内参基因，对比野生型84K杨和bZIP2过表达84K杨中的相对表达量，具体如图1所示。

实施例3：鉴定bZIP2过表达84K杨中的bZIP2基因表达量。

将生根后长势一致的野生型(WT)，过表达(bZIP2-OE)株系移至土壤中生长。表型观察发现，过表达株系的第3片展开叶比野生型植株大(图2)；对bZIP2-OE和WT株系进行显微镜下表皮细胞的观察，细胞数目统计显示，bZIP2-OE植株相比于WT植株表皮细胞的数目显著增加(图3)，细胞体积显著增大(图4)。

以上结合具体实施方式和/或范例性实例以及附图对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

SEQ ID NO.1

ATGGCCTCTTCTAGTGGGGCATCTTCAGGGTCAACAGCCAT

GTTGAGGAACTCAAGTTCTGAAGAGGATCCGCAGCAGATTA

TGGACCTAAGGAAGCGTAAAAGGATGCTATCCAATAGAGAA

TCTGCAAGAAGATCCAGAATGAGGAAACAGAAACACCTGG

ATGACCTCACGGGACAACTTCGTCAGCTCGCGAGAGAAAA

TAATGAGATCCTGACAAGGATGAATGTTATCTCTCAGCTTTA

CATGAATATTGAAGCCGAGAACTCTATCCTCAGAGCCCAAA

TGGCTGAGCTTACCCACAGATTGGACTCTCTCAATGAAATT

ATTGAATATGCCAACTTTAGCGATGGTCTTTTTGAACCCGAG

GATGCTGTTGCCTCTGTTTCTGCGACTAGTCATCAGATTGGT

GATGGTTTTTTCATGAATCCATGGAATAATGCTAATTCCCAT

GTGAATCAGCCCATCATGGACATGGTTATGTACTGASEQ ID NO.2

MASSSGASSGSTAMLRNSSSEEDPQQIMDLRKRKRMLSNRES

ARRSRMRKQKHLDDLTGQLRQLARENNEILTRMNVISQLYM

NIEAENSILRAQMAELTHRLDSLNEIIEYANFSDGLFEPEDAVASVSATSHQIGDGFFMNPWNNANSHVNQPIMDMVMY*。