一种搭载外泌体的神经修复生物材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种搭载外泌体的神经修复生物材料及其制备方法。

背景技术

脊髓损伤（SCI）是世界上最严重的神经系统疾病之一。由于高残障率，SCI给社会带来了沉重的经济负担。SCI的病理机制可分为两个过程：原发性损伤和继发性损伤。目前，治疗SCI的主要方法包括手术治疗，药物治疗，高压氧治疗和物理治疗。然而，SCI患者的治疗效果和结果仍然不能令人满意。

外泌体是直径在30-150 nm之间的细胞外囊泡，具有双层脂质膜结构。无论在生理和病理条件下几乎所有类型的细胞都可以产生外泌体。长久以来，外泌体因其细胞间通讯以及表观遗传调控备受关注。但是，由于缺乏靶向性以及被目的细胞主动吸收较弱，以循环给药的方式受到了很大的局限。为此，我们期望结合外泌体提供一种神经修复生物材料在治疗神经系统疾病上取得突破。

发明内容

鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，期望提供一种搭载外泌体的神经修复生物材料及其制备方法，通过局部注射或移植，提高外泌体的区域浓度，并且可以通过增加神经元胞外ATP含量，增加神经元能量供给，促进神经元对于外泌体的主动吸收，最大化外泌体的治疗作用，进而对神经修复领域提供一种新思路。

本发明提供的一种搭载外泌体的神经修复生物材料，包括外泌体和能量传递神经修复水凝胶，其中以所述神经修复生物材料计，所述外泌体的浓度为1-10 mg/ml；所述能量传递神经修复水凝胶包括如下重量组分：壳聚糖1.5-50份；β-甘油磷酸钠40-70份；海藻酸钠0.5-5份；Ca-PolyP 0.5-10份。

进一步的，以所述神经修复生物材料计，所述外泌体的浓度为1-4 mg/ml。

进一步的，所述能量传递神经修复水凝胶包括如下重量组分：壳聚糖10-14份；β-甘油磷酸钠55-65份；海藻酸钠2-4份；Ca-PolyP 1-5份。

进一步的，所述Ca-PolyP中PolyP的链长为40-130。

进一步的，所述Ca-PolyP由CaCl

进一步的，所述Ca-PolyP由CaCl

进一步的，所述外泌体的来源包括雪旺细胞、神经干细胞、间充质干细胞、RSC96细胞系、HT22细胞系、SH-SY5Y细胞系、PC12细胞系中的任意一种。

另，本发明还提供了一种搭载外泌体的神经修复生物材料的制备方法，包括如下步骤：将外泌体混入能量传递神经修复水凝胶中，使外泌体浓度为100-200ug/mL，于4℃冰浴下搅拌10分钟，即得。

进一步的，所述能量传递神经修复水凝胶的制备方法包括如下步骤：

称取壳聚糖溶于稀盐酸中，以配制壳聚糖溶液；

称取β-甘油磷酸钠溶于蒸馏水中，以配制β-甘油磷酸钠溶液；

称取海藻酸钠，溶于所述β-甘油磷酸钠溶液中，以配制海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液；

将所述海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液缓慢滴加到所述壳聚糖溶液中，以得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液；

称取Ca-PolyP粉末溶于所述壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，即得。

进一步的，所述稀盐酸的浓度为0.1mol/L。

相对于现有技术而言，本发明的有益效果是：

本发明的神经修复生物材料通过局部注射或移植，提高了外泌体的区域浓度，并且可以通过增加神经元胞外ATP含量，增加神经元能量供给，促进了神经元对于外泌体的主动吸收，最大化外泌体的治疗作用，在神经性疾病的治疗上取得了突破性进展，为神经修复领域提供了一种新思路。

应当理解，发明内容部分中所描述的内容并非旨在限定本发明的实施例的关键或重要特征，亦非用于限制本发明的范围。本发明的其它特征将通过以下的描述变得容易理解。

附图说明

通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为能量传递神经修复水凝胶的扫描电镜图；

图2为Zn-PolyP的组合物的扫描电镜图；

图3为Mn-PolyP的组合物的扫描电镜图；

图4为Mg-PolyP的组合物的扫描电镜图；

图5为Ni-PolyP的组合物的扫描电镜图；

图6为使用透射电镜观察得到的外泌体形态图；

图7为使用纳米粒度分析仪分析外泌体粒径大小的示意图；

图8为使用Western Bolt检测外泌体标记物示意图；

图9为水凝胶在抗坏血酸中降解至20%所需时间的示意图；

图10为搭载外泌体的神经修复生物材料的凝固时间的示意图；

图11为凝结胶样品的杨氏模量示意图；

图12为PKH26荧光强度示意图；

图13为移植后大鼠BBB评分示意图；

图14为大鼠斜板实验示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

本发明的实施例提供了一种搭载外泌体的神经修复生物材料，包括外泌体和能量传递神经修复水凝胶，其中以神经修复生物材料计，外泌体的浓度为1-10 mg/ml；能量传递神经修复水凝胶包括如下重量组分：壳聚糖1.5-50份；β-甘油磷酸钠40-70份；海藻酸钠0.5-5份；Ca-PolyP 0.5-10份。

在一优选实施例中，以神经修复生物材料计，外泌体的浓度为1-4 mg/ml。

在一优选实施例中，能量传递神经修复水凝胶包括如下重量组分：壳聚糖10-14份；β-甘油磷酸钠55-65份；海藻酸钠2-4份；Ca-PolyP 1-5份。

优选地，能量传递神经修复水凝胶包括如下重量组分：壳聚糖12份；β-甘油磷酸钠60份；海藻酸钠2-4份；Ca-PolyP 2份。

优选地，能量传递神经修复水凝胶包括如下重量组分：壳聚糖12份；β-甘油磷酸钠60份；海藻酸钠4份；Ca-PolyP 1-5份。

在一优选实施例中，Ca-PolyP中PolyP的链长为40-130。

优选地，Ca-PolyP(CaPP)为(Ca

在一优选实施例中，Ca-PolyP由CaCl

在一优选实施例中，Ca-PolyP由CaCl

在一优选实施例中，外泌体的来源包括雪旺细胞、神经干细胞、间充质干细胞、RSC96细胞系、HT22细胞系、SH-SY5Y细胞系、PC12细胞系中的任意一种。

另，本发明的实施例还提供了一种搭载外泌体的神经修复生物材料的制备方法，包括如下步骤：将外泌体混入能量传递神经修复水凝胶中，使外泌体浓度为100-200ug/mL，于4℃冰浴下搅拌10分钟，即得。

在一优选实施例中，能量传递神经修复水凝胶的制备方法包括如下步骤：

称取壳聚糖溶于稀盐酸中，以配制壳聚糖溶液；

称取β-甘油磷酸钠溶于蒸馏水中，以配制β-甘油磷酸钠溶液；

称取海藻酸钠，溶于β-甘油磷酸钠溶液中，以配制海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液；

将所述海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，以得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液；

称取Ca-PolyP粉末溶于壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，即得。

在一优选实施例中，稀盐酸的浓度为0.1mol/L。

实施例1

一种能量传递神经修复水凝胶，其组成如下：

其中，Ca-PolyP的制备方法如下：取28g CaCl

其中，能量传递神经修复水凝胶的制备方法如下：

（1）称取一定量的壳聚糖溶于0.1mol/L稀盐酸中(盐酸现用现配)，搅拌2 h使壳聚糖能够充分溶解，制备得壳聚糖溶液，4℃冷藏。

（2）称取一定量β-甘油磷酸钠并溶解1mL蒸馏水中，制备得β-甘油磷酸钠溶液。

（3）称取一定量海藻酸钠，溶于β-甘油磷酸钠溶液得到海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液。将混合溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，4℃下缓慢搅拌30分钟得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液，4℃冷藏。

（4）称取一定量Ca-PolyP粉末，4℃下溶于壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，即得，4℃冷藏备用。其中各组分浓度为：壳聚糖20mg/mL，β-甘油磷酸钠100mg/mL，海藻酸钠8mg/mL，CaPP 5mg/mL。其扫描电镜图如图1所示。

实施例2

一种能量传递神经修复水凝胶，其组成如下：

其中，Ca-PolyP的制备方法如下：取28g CaCl

其中，能量传递神经修复水凝胶的制备方法如下：

（1）称取一定量的壳聚糖溶于0.1mol/L稀盐酸中(盐酸现用现配)，搅拌2h使壳聚糖能够充分溶解，制备得壳聚糖溶液，4℃冷藏。

（2）称取一定量β-甘油磷酸钠并溶解1mL蒸馏水中，制备得β-甘油磷酸钠溶液。

（3）称取一定量海藻酸钠，溶于β-甘油磷酸钠溶液得到海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液。将混合溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，4℃下缓慢搅拌30分钟得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液。4℃冷藏。

（4）称取一定量Ca-PolyP粉末，4℃下溶于壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，即得，4℃冷藏备用。其中各组分浓度为：壳聚糖20mg/mL，β-甘油磷酸钠100mg/mL，海藻酸钠4mg/mL，CaPP 8mg/mL。

实施例3

一种能量传递神经修复水凝胶，其组成如下：

其中，Ca-PolyP的制备方法如下：取28g CaCl

其中，能量传递神经修复水凝胶的制备方法如下：

（1）称取一定量的壳聚糖溶于0.1mol/L稀盐酸中(盐酸现用现配)，搅拌2 h使壳聚糖能够充分溶解，制备得壳聚糖溶液，4℃冷藏。

（2）称取一定量β-甘油磷酸钠并溶解1mL蒸馏水中，制备得β-甘油磷酸钠溶液。

（3）称取一定量海藻酸钠，溶于β-甘油磷酸钠溶液得到海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液。将混合溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，4℃下缓慢搅拌30分钟得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液。4℃冷藏。

（4）称取一定量Ca-PolyP粉末，4℃下溶于壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，即得，4℃冷藏备用。其中各组分浓度为：壳聚糖20mg/mL，β-甘油磷酸钠100mg/mL，海藻酸钠8 mg/mL，CaPP 8 mg/mL。

实施例4

一种能量传递神经修复水凝胶，其组成如下：

其中，Ca-PolyP的制备方法如下：取28g CaCl

其中，能量传递神经修复水凝胶的制备方法如下：

（1）称取一定量的壳聚糖溶于0.1mol/L稀盐酸中(盐酸现用现配)，搅拌2 h使壳聚糖能够充分溶解，制备得壳聚糖溶液，4℃冷藏。

（2）称取一定量β-甘油磷酸钠并溶解1mL蒸馏水中，制备得β-甘油磷酸钠溶液。

（3）称取一定量海藻酸钠，溶于β-甘油磷酸钠溶液得到海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液。将混合溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，4℃下缓慢搅拌30分钟得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液，4℃冷藏。

（4）称取一定量Ca-PolyP粉末，4℃下溶于壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，即得，4℃冷藏备用。其中各组分浓度为：壳聚糖20mg/mL，β-甘油磷酸钠100mg/mL，海藻酸钠8mg/mL，CaPP 5mg/mL。

实施例5

含Zn-PolyP的组合物，其组成如下：

其中，Zn-PolyP的制备方法如下：取26g ZnCl

其中，含Zn-PolyP的组合物的制备方法如下：

（1）称取一定量的壳聚糖溶于0.1mol/L稀盐酸中(盐酸现用现配)，搅拌2 h使壳聚糖能够充分溶解，制备得壳聚糖溶液，4℃冷藏。

（2）称取一定量β-甘油磷酸钠并溶解1mL蒸馏水中，制备得β-甘油磷酸钠溶液。

（3）称取一定量海藻酸钠，溶于β-甘油磷酸钠溶液得到海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液。将混合溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，4℃下缓慢搅拌30分钟得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液。4℃冷藏。

（4）称取一定量Zn-PolyP粉末，4℃下溶于壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，得到Zn-PolyP，4℃冷藏备用，其中各组分浓度为：壳聚糖20mg/mL，β-甘油磷酸钠100mg/mL，海藻酸钠8mg/mL，Zn-PolyP 5mg/mL。其扫描电镜图如图2所示。

实施例6

含Mn-PolyP的组合物，其组成如下：

其中，Mn-PolyP的制备方法如下：取39.4gMnCl

其中，含Mn-PolyP的组合物的制备方法如下：

（1）称取一定量的壳聚糖溶于0.1mol/L稀盐酸中(盐酸现用现配)，搅拌2h使壳聚糖能够充分溶解，制备得壳聚糖溶液，4℃冷藏。

（2）称取一定量β-甘油磷酸钠并溶解1mL蒸馏水中，制备得β-甘油磷酸钠溶液。

（3）称取一定量海藻酸钠，溶于β-甘油磷酸钠溶液得到海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液。将混合溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，4℃下缓慢搅拌30分钟得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液，4℃冷藏。

（4）称取一定量Mn-PolyP粉末，4℃下溶于壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，得到Mn-PolyP，4℃冷藏备用。其中各组分浓度为：壳聚糖20mg/mL，β-甘油磷酸钠100mg/mL，海藻酸钠8mg/mL，MnPP 5mg/mL。其扫描电镜图如图3所示。

实施例7

含Mg-PolyP的组合物，其组成如下：

其中，Mg-PolyP的制备方法如下：取41.2gMgCl

其中，所述含Mg-PolyP的组合物的制备方法如下。

（1）称取一定量的壳聚糖溶于0.1mol/L稀盐酸中(盐酸现用现配)，搅拌2h使壳聚糖能够充分溶解，制备得壳聚糖溶液，4℃冷藏。

（2）称取一定量β-甘油磷酸钠并溶解1mL蒸馏水中，制备得β-甘油磷酸钠溶液。

（3）称取一定量海藻酸钠，溶于β-甘油磷酸钠溶液得到海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液。将混合溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，4℃下缓慢搅拌30分钟得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液，4℃冷藏。

（4）称取一定量Mg-PolyP粉末，4℃下溶于壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，得到Mg-PolyP，4℃冷藏备用。其中各组分浓度为：壳聚糖20mg/mL，β-甘油磷酸钠100mg/mL，海藻酸钠8mg/mL，MgPP 5mg/mL。其扫描电镜图如图4所示。

实施例8

含Ni-PolyP的组合物，其组成如下：

其中，Ni-PolyP的制备方法如下：取47.6gNiCl

其中，含Ni-PolyP的组合物的制备方法如下：

（1）称取一定量的壳聚糖溶于0.1mol/L稀盐酸中(盐酸现用现配)，搅拌2 h使壳聚糖能够充分溶解，制备得壳聚糖溶液，4℃冷藏。

（2）称取一定量β-甘油磷酸钠并溶解1mL蒸馏水中，制备得β-甘油磷酸钠溶液。

（3）称取一定量海藻酸钠，溶于β-甘油磷酸钠溶液得到海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液。将混合溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，4℃下缓慢搅拌30分钟得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液，4℃冷藏。

（4）称取一定量Ni-PolyP粉末，4℃下溶于壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，得到Ni-PolyP，4℃冷藏备用。其中各组分浓度为：壳聚糖20mg/mL，β-甘油磷酸钠100mg/mL，海藻酸钠8mg/mL，NiPP 5mg/mL。其扫描电镜图如图5所示。

实施例9

外泌体的制备

1、雪旺细胞外泌体的制备：

取1天龄的SD新生大鼠，使用75%酒精消毒处理，将大鼠的大腿后侧皮肤缓慢剥离，分离皮下组织和肌肉，在股骨后侧显露坐骨神经，沿着股骨近端将坐骨神经逐渐分离至踝关节处，得到坐骨神经整个的分支。将剥离的坐骨神经放在4℃的D-Hank’s缓冲液中，将神经外膜、脂肪组织的剥离，最后将剥离干净的神经束剪碎。将上述神经碎片加入 5ml 0.25%胰蛋白酶和5ml 0.1% Ⅱ型胶原酶溶液(Abcam)中消化。消化 45min，在37℃下进行。间隔5min对离心管进行摇晃震荡。将上述消化产物1500rmp离心5min，弃去上清，收集离心产物，再采用0.1% Ⅳ型胶原酶(Abcam)5ml对上述离心产物进行消化30min，每隔5min离心管进行摇晃震荡。消化流程结束后，加入DMEM/F12完全培养基，培养基含有15%胎牛血清，可终止消化反应。之后1500rmp离心6min后，弃掉上清液，再加入5ml DMEM/F12完全培养基（15%胎牛血清，1% Penicillin-Streptomycin Solution）反复吹打，混匀后加入T25培养瓶中培养。培养条件为5%二氧化碳，37℃。在培养后的第24-48小时之间，加入5 mmol/L 的阿糖胞苷进行抑制成纤维细胞的生长，第48小时后完全换液，采用PBS进行冲洗，后继续加入DMEM/F12完全培养基进行培养。每隔2-3天换液一次。

等细胞传至第3-7代时，使用10%无外泌体胎牛血清+89% DMEM/F12(Gibco)+1%Penicillin-Streptomycin Solution(Sigma-Aldrich)配制细胞培养基。待细胞密度为瓶底80%时，收集细胞上清。使用Eppendorf 5810以600g速度离心10分钟，离心后将上清转入新管。再以2000g速度离心20分钟，离心后将上清转入新管。再以10000g速度离心30分钟，离心后上清通过0.22微米的滤器，置入超离管中。最后使用Beckman超速离心机以100000g速度离心70分钟，弃掉上清，以1ml/管 PBS重悬沉淀，再次以100000g速度离心70分钟，弃去上清，以100uL/管重悬沉淀，以BCA法测定外泌体浓度，-80℃保存。

制备得到的外泌体使用透射电镜（HT7700透射电子显微镜，日立，日本）观察外泌体形态，见图6。

使用纳米粒度分析仪（Nanosight NS300,马尔文，英国）分析外泌体粒径大小，见图7。

使用Western Bolt检测外泌体标记物，见图8。

2、神经干细胞外泌体的制备：

取孕14-18天的孕Wistar大鼠，脱颈处死后，浸泡于75%酒精中消毒。使用无菌器械切开皮肤及腹膜，切开子宫，小心取出胚胎。使用4℃PBS冲洗组织。在体式显微镜下，从胚胎中解剖出海马体。将剥离的海马体放在 4℃的D-Hank’s缓冲液中，将血管膜的剥离干净后，使用眼科剪剪碎。使用2mg/ml木瓜蛋白酶以及1U/mlDNAse于37℃消化5分钟，使用DMEM/F12培养基终止消化。之后1000rmp离心5min后，弃掉上清液，再加入5ml DMEM/F12 +10ng/mlFGF-2(R&D Systems)(此处为终浓度)+10ng/ml EGF(R&D Systems) (此处为终浓度)+2%B27(17504044，GIBCO TM )+1% Penicillin-Streptomycin Solution (Sigma-Aldrich)反复吹打，混匀后加入T25培养瓶中培养。培养条件为 5%二氧化碳，37℃。

等细胞传至第3-7代时，使用DMEM/F12完全培养基培养细胞。每隔两个半量换液，收集细胞上清。使用Eppendorf 5810以600g速度离心10分钟，离心后将上清转入新管。再以2000g速度离心20分钟，离心后将上清转入新管。再以10000g速度离心30分钟，离心后上清通过0.22微米的滤器，置入超离管中。最后使用Beckman超速离心机以100000g速度离心70分钟，弃掉上清，以1ml/管PBS重悬沉淀，再次以100000g速度离心70分钟，弃去上清，以100uL/管重悬沉淀，以BCA法测定外泌体浓度，-80℃保存。

3、骨髓间充质干细胞外泌体的制备：

取4-6周大鼠用10％的水合氯醛(1mL/300 g，腹膜内)麻醉，然后用75%的乙醇消毒大鼠的下肢。在无菌条件下，获得大鼠的双侧下肢股骨，然后去除附着的脂肪和结缔组织。将股骨保存在无菌培养皿中。用PBS洗涤后，切除远端骨折区域。用间充质干细胞培养基(14371C，SAFC)，冲洗股骨腔3至4次。将冲洗液收集在50mL试管中，并将混合液与中等培养基混合。用70μm细胞过滤器(CORNING)过滤冲洗液后，将其离心(270 g，5分钟)并重悬。调整后的细胞密度为1×10

等细胞传至第3-7代时，使用98%间充质干细胞培养基+1% Stemline® XF MSCSupplement(14372C，SAFC)+1% Penicillin-Streptomycin Solution（Sigma-Aldrich）配制细胞培养基。待细胞密度为瓶底80%时，收集细胞上清。使用Eppendorf 5810以600g速度离心10分钟，离心后将上清转入新管。再以2000g速度离心20分钟，离心后将上清转入新管。再以10000g速度离心30分钟，离心后上清通过0.22微米的滤器，置入超离管中。最后使用Beckman超速离心机以100000g速度离心70分钟，弃掉上清，以1ml/管PBS重悬沉淀，再次以100000g速度离心70分钟，弃去上清，以100uL/管重悬沉淀，以BCA法测定外泌体浓度，-80℃保存。

4、RSC96细胞系外泌体的制备：

将胎牛血清(Gibco)以100000g速度离心8小时，制备为无外泌体胎牛血清。选用RSC96细胞系，使用10%无外泌体胎牛血清+89% DMEM/F12(Gibco)+1% Penicillin-Streptomycin Solution(Sigma-Aldrich)配制细胞培养基。待细胞密度为瓶底80%时，收集细胞上清。使用Eppendorf 5810以600g速度离心10分钟，离心后将上清转入新管。再以2000g速度离心20分钟，离心后将上清转入新管。再以10000g速度离心30分钟，离心后上清通过0.22微米的滤器，置入超离管中。最后使用Beckman超速离心机以100000g速度离心70分钟，弃掉上清，以1ml/管PBS重悬沉淀，再次以100000g速度离心70分钟，弃去上清，以100uL/管重悬沉淀，以BCA法测定外泌体浓度，-80℃保存。

5、HT22细胞系外泌体的制备：

将胎牛血清(Gibco)以100000g速度离心8小时，制备为无外泌体胎牛血清。选用HT22细胞系，使用10%无外泌体胎牛血清+89% DMEM/F12(Gibco)+1% Penicillin-Streptomycin Solution(Sigma-Aldrich)配制细胞培养基。待细胞密度为瓶底80%时，收集细胞上清。使用Eppendorf 5810 以600g速度离心10分钟，离心后将上清转入新管。再以2000g速度离心20分钟，离心后将上清转入新管。再以10000g速度离心30分钟，离心后上清通过0.22微米的滤器，置入超离管中。最后使用Beckman超速离心机以100000g速度离心70分钟，弃掉上清，以1ml/管PBS重悬沉淀，再次以100000g速度离心70分钟，弃去上清，以100uL/管重悬沉淀，以BCA法测定外泌体浓度，-80℃保存。

6、SH-SY5Y细胞系外泌体的制备：

将胎牛血清(Gibco)以100000g速度离心8小时，制备为无外泌体胎牛血清。选用SH-SY5Y细胞系细胞系，使用10%无外泌体胎牛血清+89% DMEM/F12(Gibco)+1%Penicillin-Streptomycin Solution(Sigma-Aldrich)配制细胞培养基。待细胞密度为瓶底80%时，收集细胞上清。使用Eppendorf 5810以600g速度离心10分钟，离心后将上清转入新管。再以2000g速度离心20分钟，离心后将上清转入新管。再以10000g速度离心30分钟，离心后上清通过0.22微米的滤器，置入超离管中。最后使用Beckman超速离心机以100000g速度离心70分钟，弃掉上清，以1ml/管PBS重悬沉淀，再次以100000g速度离心70分钟，弃去上清，以100uL/管重悬沉淀，以BCA法测定外泌体浓度，-80℃保存。

7、PC12细胞系外泌体的制备：

将胎牛血清(Gibco)以100000g速度离心8小时，制备为无外泌体胎牛血清。选用PC12细胞系细胞系，使用10%无外泌体胎牛血清+89% DMEM/F12(Gibco)+1% Penicillin-Streptomycin Solution(Sigma-Aldrich)配制细胞培养基。待细胞密度为瓶底80%时，收集细胞上清。使用Eppendorf 5810以600g速度离心10分钟，离心后将上清转入新管。再以2000g速度离心20分钟，离心后将上清转入新管。再以10000g速度离心30分钟，离心后上清通过0.22微米的滤器，置入超离管中。最后使用Beckman超速离心机以100000g速度离心70分钟，弃掉上清，以1ml/管PBS重悬沉淀，再次以100000g速度离心70分钟，弃去上清，以100uL/管重悬沉淀，以BCA法测定外泌体浓度，-80℃保存。

实施例10

搭载外泌体的神经修复生物材料

将实施例9的雪旺细胞外泌体混入实施例1制备得到的水凝胶中，使外泌体浓度为1.5mg/mL于4℃冰浴下搅拌10分钟备用。

实施例11

搭载外泌体的神经修复生物材料

将实施例9的雪旺细胞外泌体混入实施例2制备得到的产品中，使外泌体浓度为4mg/mL于4℃冰浴下搅拌10分钟备用。

实施例12

搭载外泌体的神经修复生物材料

将实施例9的雪旺细胞外泌体混入实施例3制备得到的水凝胶中，使外泌体浓度为1mg/mL于4℃冰浴下搅拌10分钟备用。

实施例13

搭载外泌体的神经修复生物材料

将实施例9的雪旺细胞外泌体混入实施例4制备得到的水凝胶中，使外泌体浓度为1.5mg/mL于4℃冰浴下搅拌10分钟备用。

实施例14

本实施例考察了搭载外泌体的神经修复水凝胶的物理化学性质。

1、不添加CaPP、添加CaPP的水凝胶（如实施例1制备）以及搭载外泌体的神经修复生物材料（如实施例10制备）搭载外泌体的神经修复水凝胶在抗坏血酸中降解至20%所需要的时间。

将不包含CaPP的水凝胶（即在制备时不添加CaPP）、水凝胶（如实施例1制备）以及搭载外泌体的神经修复生物材料（如实施例10制备）置于10ug/ml的抗坏血酸PBS溶液中。记录初始凝胶质量为M克。每隔24h取出水凝胶并用滤纸吸去凝胶表面粘附的水分，测定凝胶质量为Mn克。以重量变化率代表降解率N。

N=（M-Mn）/M×100%；

水凝胶在抗坏血酸中降解至20%所需要的时间如图9所示。

2、不添加CaPP、添加CaPP的水凝胶（如实施例1制备）以及搭载外泌体的神经修复生物材料（如实施例10制备）搭载外泌体的神经修复水凝胶在37℃凝固的时间。

将不添加CaPP、添加CaPP的水凝胶（如实施例1制备）以及搭载外泌体的神经修复生物材料（如实施例10制备）搭载外泌体的神经修复水凝胶加入试管，至于37℃水浴锅中。每隔10s，翻转试管，记录流动相转为固体相所用时间记作凝固时间，如图10所示。

3、不添加CaPP、添加CaPP的水凝胶（如实施例1制备）以及搭载外泌体的神经修复生物材料（如实施例10制备）搭载外泌体的神经修复水凝胶的杨氏模量。

将不添加CaPP、添加CaPP的水凝胶（如实施例1制备）以及搭载外泌体的神经修复生物材料（如实施例10制备）搭载外泌体的神经修复水凝胶注入到长宽各为1 cm的模具中，注入高度为1 cm。将模具放入37℃恒温水浴中，得到边长为1 cm的正方体水凝胶。采用多载荷多物理场耦合微观力学性能原位测试系统（Biomomentum，加拿大）测试凝结胶样品的压缩弹性模量，结果见图11。

实施例15

搭载外泌体的神经修复生物材料促进外泌体被神经细胞吸收

利用PKH26(MIDI26,Sigma-Aldrich,德国)标记RSC96细胞系外泌体(由实施例9制备)，将标记好的外泌体与神经修复水凝胶(由实施例1制备)混匀植入脊髓横断的大鼠体内。造模后3天后，心脏灌注取材。使用NF200（ab8135,abcam,英国）标记神经元。计算PKH26与NF200荧光双标记细胞中PKH26荧光强度。CaPP水凝胶组统计有基础水平的荧光强度，作为对照组，结果如图12所示。

对移植后大鼠进行BBB评分，结果如图13所示。

移植28天后，进行大鼠斜板实验，结果如图14所示。

本发明的神经修复生物材料通过局部注射或移植，提高了外泌体的区域浓度，并且可以通过增加神经元胞外ATP含量，增加神经元能量供给，促进了神经元对于外泌体的主动吸收，能够有效增加神经元损伤后存活，减少凋亡，体内移植能够增加神经修复，使神经损伤的实验对象运动感觉功能增加，最大化外泌体的治疗作用，在神经性疾病的治疗上取得了突破性进展，为神经修复领域提供了一种新思路。

在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。