一种温控载药水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种温控载药水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

感音神经性聋(神经性聋)主要包括老年性耳聋、噪声性耳聋、药物性耳聋和遗传性耳聋四种形式。当前，罹患感音神经性聋的人群数量极多，据估计全球人口总数的大约25％-30％正在遭受各种形式感音神经性聋的困扰。因此事实上，感音神经性聋正在日益成为世界各国面临的重大公共卫生挑战。

相比较而言，目前针对感音神经性聋的治疗方法较为局限，助听器和人工耳蜗虽然可以在一定程度上改善患者的听力水平，但是上述两种设备在很多方面都存在严重缺陷，难以做到广泛的使用和推广。因此，通过药物有效治疗感音神经性聋仍然是最具前景的治疗方法。

内耳与体内绝大多数器官不同，其具有特殊的解剖结构-内耳血管屏障，因此无论采用口服、肌注或是静脉等常规给药方式，药物都很难透过这个屏障进入内耳来改善内耳微环境、修复受损害的耳蜗毛细胞、神经突触以及听神经等重要听觉结构，因而也无法发挥药物本身的治疗作用。常规给药的另外一个限制因素是，由于药物难以进入到内耳，却很容易达到心脏、肝脏以及肾脏等全身重要脏器，因此容易引起全身性毒性，甚至造成严重的药物毒副作用。因而寻求合理有效的给药途径及制剂已成为药学工作者的当务之急。

近年来，利用生物可降解水凝胶将药物持续输送到内耳作为多次注射的替代方案，由于水凝胶载药在中耳停留时间长，重复注射引起感染的风险小，药物作用时间长，得到了广泛的关注。原位水凝胶药物传递系统是随着药用高分子材料科学迅猛发展而诞生的新颖剂型，通过鼓室注射形成原位药物载体水凝胶聚合物的几种策略已被研究，例如明胶，透明质酸基水凝胶，壳聚糖及其衍生物和GelMA水凝胶等。但从可注射的溶胶状态到作为缓释药物储存库的凝胶状态，上述凝胶化方案大多是通过点交联或光固化，且这些化学形成的药物传递载体通常由质硬的材质组成，因此治疗本身可能导致长期传导性听力损失，且无有效降解途径。

而温度敏感原位水凝胶药物传递系统是指以液体状态给药能在需要的组织、器官或体腔内立即胶凝，形成非化学交联的半固体制剂。该水凝胶给药系统具有凝胶制剂的亲水性三维网络结构及良好的组织相容性，溶胶-凝胶的相变特性使该系统适合注射给药，尤其适合不稳定生物大分子药物的输送；凝胶的流动特性能很好地适应填充体腔或者缺损；凝胶与用药部位特别是黏膜组织亲和力强、滞留时间长；并具有一定的控制释药性能，且发挥作用后可通过变温经咽鼓管完全代谢。因此，温度敏感原位凝胶完美融合了液体制剂和凝胶制剂的优点，特别适合用作鼓室给药的载体。既往也已有多项研究通过鼓室注射水凝胶载地塞米松等常规耳聋药物治疗耳聋，为今后的耳聋治疗提供一种全新的治疗方案。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种温控载药水凝胶及其制备方法和应用，该水凝胶可以高浓度负载耳聋治疗药物，通过温度控制改变水凝胶的自身形态，从而精准地将负载药物通过注射递送到中耳；且治疗结束后可通过咽鼓管排出体外，不会在体内残留。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种温控载药水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，

S1：制备PLGA-BDNF纳米微球；

S2：取步骤S1中制备得到的PLGA-BDNF纳米微球与含有Zn纳米粒的PLGA-PEG-PLGA水凝胶混合，得到温控载药水凝胶。

进一步的，步骤S1的具体操作包括以下步骤，

S101：将BDNF溶于双蒸水中得到内水相W1；

S102：将PLGA溶于二氯甲烷中得到油相O；

S103：将W1倒入O中，冰浴下超声处理得到W1/O初乳；

S104：将PVA溶于去离子水中得到外水相W2；

S105：将W1/O初乳倒入W2中，冰浴下搅拌处理，得到W1/O/W2复乳，磁力搅拌去除有机溶剂；

S106：离心处理后使用去离子水水洗，冷冻干燥，得到PLGA-BDNF纳米微球。

进一步的，步骤S101中BDNF与双蒸水的质量体积比为1～2：5mg/μL；步骤S102中PLGA与二氯甲烷的质量体积比为100～125：2mg/mL；步骤S104中PVA与去离子水的质量体积比为1～2：100mg/mL。

进一步的，步骤S2中含有Zn纳米粒的PLGA-PEG-PLGA水凝胶中含有0.5‰-1.0‰直径为50nm金属锌纳米粒。

进一步的，步骤S2中PLGA-BDNF纳米微球与含有Zn纳米粒的PLGA-PEG-PLGA水凝胶的质量体积比为240～290：2mg/mL。

本发明还包括利用如前所述的制备方法制备得到的温控载药水凝胶。

进一步的，所述温控载药水凝胶为含有PLGA-BDNF纳米微球和金属锌纳米粒的PLGA-PEG-PLGA水凝胶。

进一步的，含有PLGA-BDNF纳米微球和金属锌纳米粒的PLGA-PEG-PLGA水凝胶在高于36℃时为凝胶状态；在15℃-30.5℃时为液体状态。

本发明还包括如前所述的温控载药水凝胶在制备耳聋治疗药物中的应用。

本发明的有益效果是：

1、本发明中的温控载药水凝胶可以高浓度的负载耳聋治疗药物，且该水凝胶的状态随着温度的变化可在液体和半凝胶状态之间转换；在室温状态下，该水凝胶为液体状态，可直接经穿刺针精准地将负载药物的液态水凝胶通过注射递送到中耳；注入中耳后，在人正常体温(36-37℃)下，该水凝胶自动转变为凝胶状态，可较长时间驻留在中耳，药物通过缓释作用持续进入内耳发挥治疗作用；治疗结束后，通过间断(10min/h)向外耳道内注入冰水或采用冰袋冷敷(＜30.5℃)进行降温处理，该水凝胶又转变为液体状态，可以在短时间通过咽鼓管排出体外，不在体内残留，最大程度降低毒副作用。

2、本发明中的温控载药水凝胶中耳递送方法可应用于治疗耳聋，不采用口服、肌注或静脉等常规给药方法，避免了药物的全身毒副作用；经过鼓膜注射给药至中耳，近乎无创，患者基本没有痛苦，该治疗过程极为简单，仅仅在门诊就可以实施；而且经动物实验验证，仅需要一次中耳注射就可以完成全部治疗过程，不需要进行长期输液、打针或口服药物，不需要住院治疗，真正实现一针治疗耳聋的梦想。

附图说明

图1为本发明中温控载药水凝胶的溶胶-凝胶转变相图。

图2为本发明中温控载药水凝胶的溶胶-凝胶-沉淀转变图。

图3为本发明中温控载药水凝胶的BDNF时间--释放量曲线图。

图4为本发明中动物实验流程图。

图5为本发明动物实验中实验组和对照组听力水平ABR阈值结果曲线图。

图6为本发明动物实验中鼓室内注射水凝修复内耳神经连接实验结果。

图7为本发明中水凝胶高浓度负载药物和释放药物示意图。

图8为本发明中水凝胶通过变温调控凝胶状态示意图。

图9为本发明中水凝胶鼓室内驻留、经咽鼓管完全排出示意图。

具体实施方式

为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。

实施例一：

实施例一提供一种温控载药水凝胶的制备方法，包括以下步骤，

S1：制备PLGA-BDNF纳米微球；

具体的，将20mg BDNF(BDNF为治疗耳聋的药物)溶于100μL双蒸水中得到内水相W1；200PLGA溶于4mL二氯甲烷中得到油相O；将W1倒入O中，冰浴下超声30～40s(60-100W超声0.5-0.6min)得到W1/O初乳；

取0.25mg PVA溶于25mL去离子水中得到外水相W2，将W1/O初乳倒入W2中，冰浴下以1500r/min匀速搅拌6min，得到W1/O/W2复乳，常压磁力搅拌过夜挥发有机溶剂；然后12000～15000r/min离心5min，去离子水洗4次，冷冻干燥48h，得到PLGA-BDNF纳米微球，保存于4℃冰箱中。

S2：取240步骤S1中制备得到的PLGA-BDNF纳米微球与2ml含有Zn纳米粒的PLGA-PEG-PLGA水凝胶(溶胶状态)在4℃条件下混合，得到温控载药水凝胶。

其中，含有Zn纳米粒的PLGA-PEG-PLGA水凝胶中含有0.5‰直径为50nm金属锌纳米粒。

实施例二：

实施例二对实施例一中制备得到的温控载药水凝胶(含有PLGA-BDNF纳米微球和金属锌纳米粒的PLGA-PEG-PLGA水凝胶)进行凝胶相变温度测定，具体通过小瓶倒置法测定。将PLGA-BDNF纳米微球与含有Zn纳米粒的PLGA-PEG-PLGA水凝胶(溶胶状态)在4℃条件下混合搅拌均匀后，将0.5mL聚合物溶液转移至内径为11mm的小瓶中，然后将小瓶置于可精确控温的水浴锅中。每次升温1℃，每个温度保持10min，测试范围为10～80℃。倒置小瓶时如果PLGA-PEG-PLGA溶液不发生流动且可保持超过30s，则认为发生了溶胶-凝胶相转变，该温度即为该浓度PLGA-PEG-PLGA溶液的凝胶相变温度。样品均平行测试3次，并计算平均值，结果如附图1和附图2所示。

从附图1和附图2中可以看出，该水凝胶在温度小于30.5℃时为液体状态，在＞36℃为凝胶状态时为凝胶状态，当温度大于60℃时，该水凝胶产生沉淀。由此可得，该水凝胶在低于30.5℃的范围下呈现溶胶的液体状态，可注射到中耳鼓室内稳定以凝胶状态存在，待降解排出时通过降温措施使温度略低于30.5℃，即可恢复溶胶的液体状态。

进一步的，本实施例还对实施例一中制备得到的水凝胶的BDNF药物缓释动力学进行了分析，精密称取100mg BDNF-PLGA微球，溶于2mL含有Zn纳米粒的PLGA-PEG-PLGA水凝胶的溶胶状态中，置于20000的半透膜中，振荡混匀后置于恒温振荡器中，在(37.0±0.5)℃、150r/min的条件下进行释放试验。在预先设定的时间内离心取上清,并补充等量。同温新鲜PBS，继续振荡。所取上清用Micro BCA法测定BNDF浓度，计算BDNF的释放量，结果如附图3所示。

从附图3中可以看出，含有PLGA-BDNF纳米微球的PLGA-PEG-PLGA水凝胶，BDNF浓度在体外模拟扩散中随时间逐渐释放，可持续递增缓释14天。

进一步的，本实施例还对实施例一中制备得到的水凝胶进行了动物实验。实验小鼠在实验前均经过听力检测(ABR检测听力阈值)，听力无异常小鼠分别纳入实验组及对照组；实验组小鼠经过白噪声暴露(white noise)，之后在24小时内单耳注射含有实施例一中制备得到的水凝胶，之后分别于注射后第2、7、14天检测小鼠听力水平，实验流程如附图4所示，实验结果如附图5所示。

从附图5中可以看出，注射水凝胶后14天，噪声暴露+含有PLGA-BDNF纳米微球的PLGA-PEG-PLGA水凝胶(NE+Gel-Drug，紫色折线)和对照组(Crtl,蓝色折线)听力阈值无显著差异。

向小鼠鼓室内注射单次含有PLGA-BDNF纳米微球的温敏PLGA-PEG-PLGA水凝胶，在注射后第14天，噪声性聋小鼠耳蜗顶、中、底回内毛细胞与听神经之间的突触连接结构数量得到完全恢复。免疫荧光实验结果如附图6所示，在附图6中，a为anti-CtBP2特异标记突触前和细胞核(红色荧光)，anti-GluR2标记突触后(绿色荧光)，两者叠加变为橙色，代表了一个完整突触结构组成，图中白色框和右侧放大图像可见突触前后标记和叠加的情况；b为叠加的突触点(橙色)定量统计结果：纵坐标为每个内毛细胞的叠加突触信号数量，横坐标分别为对照组(Ctrl，蓝色)，噪声暴露组(NE，红色)和噪声暴露+鼓室内注射单次含有PLGA-BDNF纳米微球的温敏PLGA-PEG-PLGA水凝胶组(NE+BDNF，绿色)；从附图6中可以看出，注射后第14天，小鼠耳蜗顶(Apex)、中(Middle)、底(Base)三回上，NE+BDNF组合对照组突触数量无显著差异。

由上可得，利用本发明中的制备方法制备得到的水凝胶可高浓度负载药物，其负载和释放的原理如附图7所示，该水凝胶可通过温度变化来控制自身形态，即可通过温度变化使凝胶在液态-胶状两种形态中任意切换；这样可以精准地将负载药物的凝胶通过注射递送到中耳，如附图8所示，进入中耳的凝胶通过变温成为胶状，可较长时间驻留在中耳，药物通过缓释作用持续进入内耳发挥治疗作用；治疗结束后，通过变温将凝胶再变为液态，可以在短时间通过咽鼓管排出体外，不在体内残留，如附图9所示。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。