一种咪唑酮丙酸酶BT6、编码基因、重组工程菌及其在水解赭曲霉毒素上的应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及一种咪唑酮丙酸酶BT6、编码基因、重组工程菌及其在水解赭曲霉毒素上的应用。

背景技术

赭曲霉毒素主要包括赭曲霉毒素A（ochratoxin A, OTA）、赭曲霉毒素B（ochratoxinB, OTB）和赭曲霉毒素C（ochratoxin C, OTC），其中OTA毒性最强，被国际癌症研究中心（IARC）认定为2B级致癌物。OTA具有强烈的肝脏毒性和肾脏毒性，并且具有致畸性、致癌性和致突变性。赭曲霉毒素主要由赭曲霉、纯绿青霉、疣孢青霉和黑曲霉等霉菌产生，在果汁、咖啡、葡萄酒和饲料中经常检出，严重威胁人类和动物健康。

有效防控和消减食品和饲料中赭曲霉毒素污染对于保障人类和动物健康具有重要意义。通过微生物及其产生的酶将赭曲霉毒素转化成无毒或低毒代谢产物被认为是最有应用前景的赭曲霉毒素脱毒方法，具有安全高效、绿色环保、对饲料和食品营养价值和感官品质影响小以及易于规模化推广应用等优点。专利CN111607579A公开了一种赭曲霉毒素水解酶，该酶在温和条件下处理赭曲霉毒素12小时，OTA降解率达到60%；专利CN109913435B公开了一种羧肽酶，该酶在温和条件下处理赭曲霉毒素24小时，OTA降解率达到36.8%；专利CN116064465A公开了一种分子量为17kDa的水解酶NUDIX，具有降解OTA功能；此外专利CN116240180 A公开了一种赭曲霉毒素降解酶BnOTase4，具有降解OTA和OTB活性；专利CN116024191 A公开了一种赭曲霉毒素水解酶BdOTase，其对OTA的6h降解率达到69%；专利CN111394342 B公开了一种能够水解OTA的酰胺酶；专利CN 111394333 A公开了一种来源于溶杆菌的赭曲霉毒素解毒酶，能够脱除小麦粉和茶叶中OTA。作为一种饲料和食品用酶，不仅要有较高的活性，更需要有较好的热稳定性，目前已知的赭曲霉毒素水解酶仍然存在热稳定性较差的问题，限制了其大规模商业化应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种咪唑酮丙酸酶BT6、编码基因、重组工程菌及其在水解赭曲霉毒素上的应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种咪唑酮丙酸酶BT6，其包含与序列SEQ ID No.1有90%以上相似性的氨基酸序列。

优选的，所述咪唑酮丙酸酶BT6的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

编码上述咪唑酮丙酸酶BT6的基因。

上述的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种重组载体，包含上述的编码基因。

一种重组工程菌，由上述的重组载体转化宿主菌株中得到。

所述宿主菌株为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、黑曲霉、米曲霉和里氏木霉中的任一种。

进一步的，本发明还提供了采用大肠杆菌制备咪唑酮丙酸酶BT6的方法，包括以下步骤：

（1）用包含咪唑酮丙酸酶BT6编码基因的重组表达载体pET-31b-BT6转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌株；

（2）培养所述重组菌株，诱导咪唑酮丙酸酶BT6表达。

一种生物降解剂，包括上述的咪唑酮丙酸酶BT6及其生理上可接受的载体。

优选的，咪唑酮丙酸酶BT6在生物降解剂中的占比为0.01wt%-5wt%；载体为麦芽糖糊精、水溶性淀粉和葡萄糖中的一种或者几种。

上述生物降解剂在脱除饲料、果汁、啤酒、葡萄酒、咖啡或玉米浆液中赭曲霉毒素的应用，所述赭曲霉毒素为赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B或赭曲霉毒素C。

本发明具有以下有益效果：

（1）本发明提供的咪唑酮丙酸酶BT6和过往报道的其他具有水解赭曲霉毒素功能的蛋白的氨基酸序列（NCBI登录号：WP_024354266; WP_121480904; WP_024353354; WP_134582203; KHF78480; WP_052103234.1; WP_082595003; AIG55189; OSZ37025;QOF98847.1）的一致性低于50%，属于一种新的赭曲霉毒素降解酶，对OTA、OTB和OTC降解率分别达到100%、96%和92%。

（2）本发明提供的咪唑酮丙酸酶BT6具有较好的热稳定性，在70℃条件下水浴热处理5min后残余酶活维持在初始酶活的82%，能够较好地适用于饲料和食品高温调制过程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为咪唑酮丙酸酶BT6和OTA分子对接结果图。

图2为本发明纯化的咪唑酮丙酸酶BT6的SDS-PAGE分析结果。

图3为本发明制备的咪唑酮丙酸酶BT6降解OTA的HPLC分析结果。

图4为咪唑酮丙酸酶BT6对OTA、OTB和OTC的降解率。

图5为咪唑酮丙酸酶BT6在70℃条件下水浴热处理后的残余酶活。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中使用的主要实验材料和试剂包括：

大肠杆菌表达载体pET-31b和大肠杆菌Rosetta(DE3)均购自Invitrogen公司，PfuPCR Mix购自NEB公司，赭曲霉毒素标准品购自Sigma公司。

实施例1：咪唑酮丙酸酶BT6基因克隆

将本实验室前期筛选得到的具有降解赭曲霉毒素功能的短波单胞菌接种于5mLLB液体培养基中，37℃、180r/min震荡培养过夜，12000r/min离心1min收集菌体，采用天根公司细菌基因组DNA提取试剂盒（货号DP302）提取基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，采用人工合成的引物P1和P2进行PCR扩增克隆BT6基因。

上游引物P1（SEQ ID NO.3）：5' TTGTCATCTAAGAAATCATGGGTCG 3'

下游引物P2（SEQ ID NO.4）：5' TCAGTCGTTCCGATAGGTCAC 3'

PCR反应体系如下：1μL模板DNA，2μL上游引物P1，2μL下游引物P2，25μL 2×PfuPCR Mix和20μL ddH2O。

扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，反应30个循环；72℃彻底延伸10min。

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，采用天根公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（货号DP209）回收PCR产物，送往上海生工公司测序。

根据测序结果可知，咪唑酮丙酸酶BT6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因序列全长如SEQ ID NO.2所示。

通过ColabFold对咪唑酮丙酸酶BT6蛋白的三维结构进行模拟，并采用AutoDock4.2对BT6和OTA进行分子对接分析，如图1所示结果可知：BT6结合OTA的底物口袋主要由H93、N96、Q98、R106、H173、L223、S224、H256、H258、A301、V305、D350和V353氨基酸残基组成，其中H93、H176和H256可以和OTA形成分子间氢键。

实施例2：包含咪唑酮丙酸酶BT6基因的重组质粒构建

采用诺唯赞公司同源重组试剂盒（货号C112-01）构建咪唑酮丙酸酶BT6重组质粒。以实施例1胶回收的PCR产物为模板，采用人工合成的引物P3和P4进行PCR扩增BT6基因，PCR反应体系和扩增条件以及胶回收过程同实施例1。

上游引物P3（SEQ ID NO.5）：

5' TAAGAAGGAGATATACATATGCAACAGGCCGCCGCCGCT 3'

下游引物P4（SEQ ID NO.6）：

5' GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTCGTTCCGATAGGTCACGC 3'

通过同源重组方法构建重组质粒pET-31b-BT6，同源重组反应体系如表1所示：

表1同源重组构建重组质粒pET-31b-BT6反应体系

重组反应条件为50℃孵育5 min，之后立即置于冰上冷却，即获得重组质粒pET-31b-BT6。

实施例3：咪唑酮丙酸酶BT6表达与纯化

重组质粒pET-31b-BT6转化大肠杆菌感受态细胞Rosetta(DE3)。将转化有pET-31b-BT6质粒的重组大肠杆菌Rosetta(DE3)接种于5mL LB液体培养基中活化过夜，按照1：100比例转接到1L装液量为500mL的三角瓶中，37℃、180r/min震荡培养至OD600为0.6时，添加0.4mM IPTG，28℃、180r/min震荡培养6h诱导目的蛋白表达。

收集发酵液，4℃、10000rpm离心30min，弃上清；用pH7.0的磷酸盐缓冲液重悬菌体，4℃、12000rpm离心30min，弃上清，重复洗涤菌体三次。将菌体细胞重悬于Bindingbuffer中，在冰水浴中超声破碎菌体，4℃、10000rpm离心10min，收集菌体破碎后上清得到BT6粗酶。

BT6粗酶液经0.45μm滤膜过滤后，采用镍离子亲和层析柱（Ni

纯化后的蛋白用10kDa截留管超滤去除其中含有的咪唑，纯化的BT6进行SDS-PAGE电泳分析。

结果如图2所示，泳道1为纯化的BT6蛋白迁移条带，分子量约为44kDa，与理论分子量大小一致。

实施例4：咪唑酮丙酸酶BT6水解OTA活性检测

将固体OTA标准品溶解到甲醇中配成100μg/mL的母液，按如下500μL反应体系进行实验：485μL磷酸钠缓冲液（100mM，pH7.0），5μL实施例3制备得到的BT6酶液（1mg/mL），10μLOTA母液；对照组（CON组）中用等体积的磷酸钠缓冲液（100mM，pH7.0）替换BT6酶液；37℃水浴孵育30分钟和60分钟后加入500μL甲醇终止反应，采用高效液相色谱检测反应体系中OTA含量。

高效液相色谱检测OTA的色谱条件为：色谱柱：Agilent C18色谱柱，4.6mm×150mm×5μm；流动相：乙腈-水-冰乙酸（99：99：2）；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL；荧光检测器检测波长：λex=333nm，λem=477nm；采集时间为15分钟。

图3所示为BT6蛋白降解OTA的HPLC分析结果，BT6具有降解OTA活性，反应进行30分钟后，OTA（保留时间11.4分钟）峰面积相对于对照组减少70%，反应进行60分钟后OTA被完全降解。OTA被降解后能够在色谱图中观察到降解产物赭曲霉毒素α（OTα）色谱峰（保留时间4.0分钟），随着反应时间的延长，OTα产物峰峰面积逐渐增加。

实施例5：咪唑酮丙酸酶BT6水解OTA、OTB和OTC活性比较

分别将固体OTA、OTB和OTC标准品溶解到甲醇中配成100μg/mL的母液，按如下500μL反应体系进行实验：485μL磷酸钠缓冲液（100mM，pH7.0），5μL实施例3制备得到的BT6酶液（1mg/mL），10μL OTA、OTB或OTC母液；对照组（CON组）中用等体积的磷酸钠缓冲液替换BT6酶液；37℃水浴孵育60分钟后加入500μL甲醇终止反应，采用上述实施例4中的高效液相色谱分析方法检测反应体系中OTA、OTB和OTC含量，计算降解率。

结果如图4所示，OTA、OTB和OTC降解率分别达到100%、96%和92%。

实施例6：咪唑酮丙酸酶BT6在70℃条件下水浴热处理后的残余酶活

将实施例3制备得到的BT6酶液（1mg/mL）在70℃条件下水浴热处理0到5分钟后，测定剩余酶活。酶活测定方法如下：

将固体OTA标准品溶解到甲醇中配成1000μg/mL的母液，按如下500μL反应体系进行实验：485μL磷酸钠缓冲液（100mM，pH7.0），5μL水浴热处理不同时间的BT6酶液，10μL OTA母液；对照组（CON组）中用等体积的磷酸钠缓冲液（100mM，pH7.0）替换BT6酶液；37℃水浴孵育30分钟后加入500μL甲醇终止反应，采用高效液相色谱检测反应体系中OTA含量，根据底物降解量计算酶活，酶活定义为在37℃和pH 7.0条件下，每分钟降解1ng OTA所需要的BT6酶量。以热处理0分钟的BT6的酶活定义为100%，计算热处理1、2、3、4和5分钟后的BT6的剩余酶活。

结果如图4所示，咪唑酮丙酸酶BT6在70℃条件下水浴热处理1、2、3、4和5分钟后，剩余酶活分别保持在热处理前的97%、95%、90%、85%和82%，由此可知咪唑酮丙酸酶BT6具有较好的热稳定性。

实施例7：含有BT6蛋白的赭曲霉毒素生物降解剂

在100mL 实施例3制备得到的BT6酶液（1mg/mL）中加入20g载体，载体由水溶性淀粉、麦芽糖糊精和葡萄糖按照质量比4:5:1比例混合得到。将上述混合物真空冷冻干燥，即得到一种含有BT6蛋白的赭曲霉毒素生物降解剂。

实施例8：含有BT6蛋白的赭曲霉毒素生物降解剂用于脱除葡萄汁中OTA

在500mL三角瓶中加入100mL含有12.3ng/mL OTA的葡萄汁，加入0.5g实施例7制备的赭曲霉毒素生物降解剂，室温反应1h、2h和3h后测定葡萄汁中OTA残留量。

测定方法如下：取10mL葡萄汁，加入5mL甲醇-水混合液（体积比1:4），涡旋振荡10min后经玻璃纤维滤纸过滤，滤液经免疫亲和柱（中检维康产品，产品编号：IAC112）净化后，采用实施例4所述的高效液相色谱分析方法检测OTA含量。

结果如表2所示，反应1h、2h和3h后葡萄汁中OTA含量由12.3ng/mL分别下降至6.1ng/mL、2.4ng/mL和0.4ng/mL。

表2 含有BT6蛋白的赭曲霉毒素生物降解剂对葡萄汁中OTA的脱除效果

以上结果证明了含有BT6蛋白的赭曲霉毒素生物降解剂降解葡萄汁中OTA的可行性。显而易见，除了葡萄汁，含有BT6蛋白的赭曲霉毒素生物降解剂还可以推广应用于脱除饲料、啤酒、葡萄酒、咖啡和玉米浆液中的赭曲霉毒素。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。