一种与双棘黄姑鱼生长性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于水产动物分子标记的技术领域，具体涉及一种与双棘黄姑鱼生长性状相关的分子标记及其应用。

背景技术

双棘黄姑鱼，又名双棘原始黄姑鱼，俗称黑鮸、赤嘴鳘，隶属于鲈形目石首鱼科黄姑鱼属。双棘黄姑鱼为暖水性近海底层鱼类，主要活动于10至60米水深的泥底海床，也出现在河口或受潮汐影响的河川下游，主要以小鱼和甲壳动物为食。

双棘黄姑鱼肉味鲜美，是深受欢迎的食用鱼品种，同时其鱼鳔规格大、胶原蛋白丰富，是加工制造上等鱼胶的理想原材料，具有很高的经济价值。双棘黄姑鱼抗病能力强、生长速度快，人工养殖可1年养成达到上市规格，2年体重可达2.5kg，所以是池塘养殖、海水鱼网箱养殖以及海洋牧场养殖的理想品种之一。

目前，在福建和广东沿海双棘黄姑鱼的网箱养殖已较为普及，同时多地也在开展深远海海洋牧场试点养殖。我国对双棘黄姑鱼性状改良和优良品种繁育的研究刚刚起步，缺乏优良品种。利用现代生物技术，培育出具有生长快、产量高等优良生长性状的新品种，是双棘黄姑鱼养殖产业壮大和健康发展的必要条件。

分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。DNA是性状的遗传基础，从基因或基因组与性状的关系获得的分子标记是优良性状选择的强有力工具。分子标记辅助育种是基于与性状紧密相关的分子标记，对具有性状优势的等位基因或基因型的个体进行直接选择育种的技术。单核苷酸多态性(Single nucleotidepolymorphism,SNP)是指由单个核苷酸的替换、颠换、缺失或插入等变化引起的DNA序列多态性。作为第三代分子标记，SNP标记作具有多态性高、遗传稳定性高和检测方便等诸多优点，已广泛应用于动植物分子育种。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种与双棘黄姑鱼生长性状相关的SNP分子标记。

本发明的目的还在于提供一种用于检测上述SNP分子标记的引物或试剂盒。

本发明的最后一个目的在于提供上述SNP分子标记、引物或试剂盒在选育具有优良生长性状的双棘黄姑鱼中的应用。

本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：

一种与双棘黄姑鱼生长性状相关的SNP分子标记，所述生长性状为个体的体重和体长，它位于22号染色体的15374942位碱基处，突变类型为C/G，命名为Chr22:15374942C>G；其中，GG基因型为优选基因型，该基因型个体生长形状优于CC和GC基因型。

本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于检测所述与双棘黄姑鱼生长性状相关的SNP分子标记的引物，包括上游引物和下游引物，其序列分别为：

上游引物SEQ ID NO:1：5’-GCCTCCTACTCGTCCTAAGTTATTC-3’；

下游引物SEQ ID NO:2：5’-TTAAGCCTCCGTCCTCGTGTT-3’。

本发明还提供一种用于检测上述SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物。

本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：

上述SNP分子标记或上述引物或上述试剂盒在选育具有优良生长性状的双棘黄姑鱼中的应用。

具体选育具有优良生长性状的双棘黄姑鱼的方法，包括以下步骤：

提取待测的双棘黄姑鱼个体鳍条DNA；

利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物对提取的DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；

对扩增产物进行测序分析，确定SNP分子标记(Chr22:15374942C>G SNP位点)基因型，然后分析确定个体是否具有优良生长性状潜力。

本发明通过全基因组关联分析解析双棘黄姑鱼混合家系群体的生长性状，筛选到一个同个体体长和体重关联的候选SNP位点，命名为Chr22:15374942C>G；并且在另一个双棘黄姑鱼混合家系群体中进一步验证确定了该SNP位点与生长性状相关联。

结果表明本发明提供的SNP位点在双棘黄姑鱼分子标记辅助育种中具有应用前景。该SNP分子标记不受个体年龄、性别等因素的影响，可用于早期双棘黄姑鱼的筛选，能够显著缩短育种时间。该SNP标记通过一对引物即可判定，操作简单方便，且结果准确可靠。

附图说明

图1为SNP位点Chr22:15374942C>G不同基因型生长性状统计(****：P<0.0001)。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：双棘黄姑鱼生长性状相关SNP分子标记的筛选

实验双棘黄姑鱼为3月龄混合家系。随机取400尾实验鱼，测量记录每尾鱼的生长性状指标，并同时采集保存每尾鱼的尾鳍样品于95％酒精-20℃保存，用于DNA提取和测序。使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit(TaKaRa，日本)试剂盒提取鳍条DNA，具体步骤如下：

1.取20mg鳍条置于1.5mL离心管中，用剪刀尽可能地剪成碎块，加入180μL BufferGL、20μL Proteinase K(20mg/mL)和10μL RNase A(10mg/mL)，56℃水浴过夜消化至组织完全裂解；

2.12000g离心2分钟，将上清液转移至新的离心管，向裂解液中加入200μLBufferGB和200μL无水乙醇，充分吸打混匀；

3.将过滤柱放入收集管中，随后将液体转移至过滤柱中，12000g离心1分钟，弃滤液。

4.往过滤柱中加入500μL Buffer WA，12000g离心1分钟，弃滤液；

5.往过滤柱中加入700μL Buffer WB，12000g离心1分钟，弃滤液；

6.重复操作步骤5；

7.12000g离心2分钟，干燥过滤柱；

8.将过滤柱放入新的1.5mL离心管，开盖室温静置5分钟彻底干燥过滤柱。

9.往过滤柱滤膜中央加入50μL Elution Buffer(预热至65℃)，静置2分钟；

10.12000g离心2分钟，洗脱回收DNA，DNA于-20℃保存备用。

所有DNA均经1％琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)判断电泳结果，以保证基因组完整性。合格DNA样品随后用微量紫外分光光度计(Quawell，美国)测量浓度，并统一调整至50ng/μL。样品随后按标准流程进行建库，合格文库使用Il1umina Nova6000平台测序。获得的原始测序数据经质控和处理后，使用BWA 软件将所有的测序Reads比对到参考基因组上(GenBank：GCA_028641955.1)，使用GATK软件的标准流程检测SNP，进行基因分型。获得SNP位点共计34766个，在过滤后共得到9495个高质量SNP位点。

之后对样本进行完整度过滤，筛选SNP检出率超过80％的样本(即对于单个样本，100个标记中至少有80个标记有确定基因型)，9495个位点全部合格。使用Tassel软件的混合线性模型(Mixed linear model，MLM)进行双棘黄姑鱼个体的体长、体重全基因组关联(Genome-wide association studies，GWAS)分析。随后，基于Bonferroni校正，将全基因组显著性SNP标记阈值设定为-log10(Pvalue＝0.05/9495)＝5.28。

经关联分析发现与个体体重性状紧密关联的SNP标记5个，与个体体长性状紧密关联的SNP标记7个，具体数据见表1。其中发现，有1个SNP位点同时与个体的体重和体长相关，它位于22号染色体第15374942个碱基处，突变类型为C/G，命名为Chr22:15374942C>G，其中GG基因型为优选基因型，其生长性能更佳。

表1与个体体重、体长显著相关SNP位点信息

实施例2：双棘黄姑鱼生长性状相关的SNP分子标记验证

验证试验使用不同的双棘黄姑鱼3月龄混合家系，随机取300尾实验鱼，测量记录每尾鱼生长性状指标，并同时采集保存每尾鱼的尾鳍样品于DNA提取。DNA提取具体流程同实施例1。随后，以上述提取的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物进行PCR扩增，获得包含SNP Chr22:15374942C>G的基因片段。PCR扩增总体积50μL，具体反应体系如表2。

表2 PCR扩增反应体系

具体扩增程序如下：95℃预变性5min；40个循环的95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min；取2μL反应产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测，合格样品用于后续测序，以确定每个个体样本在SNP Chr22:15374942C>G的基因型。

随后统计了不同基因型个体的体长和体重数据，分析结果如表3和图1所示。

表3不同基因型个体生长性状数据统计

*不同字母表示组间具显著差异

结果表明在双棘黄姑鱼中，SNP Chr22:15374942C>G不同基因型个体间体重和体长存在显著差异；其中，GG基因型个体的平均体重和体长均显著优于GC基因型个体和CC基因型个体(p<0.01)。

综上，SNP Chr22:15374942C>G与双棘黄姑鱼生长性状紧密关联，其基因型可通过一对引物判定，操作简单可靠，该SNP位点在双棘黄姑鱼分子标记辅助育种中具有应用前景。

以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。