一种结肠靶向PLGA/DDAB纳米粒的构建方法及其给药系统

技术领域

本发明涉及靶向药技术领域，具体为一种结肠靶向PLGA/DDAB纳米粒的构建方法及其给药系统。

背景技术

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)是一种以结肠黏膜损伤和黏膜炎症为主要特征的慢性消化道疾病。其病程通常是发病-缓解-复发，患者大多需要终身治疗。目前大多数可用的口服制剂需要每日多次给药，每次给药多片，这种复杂且不方便的给药方案会影响UC患者的治疗依从性，导致发病率及复发率增加，提升转结直肠癌的风险。中医药治疗UC历史悠久，优势明显，经验丰富。中药厚朴自古便是治中焦脾胃病常用药。厚朴酚(Magnolol，Mag)是从厚朴树皮中提取的一种木脂素类化合物，该化合物具有神经保护、抗痉挛、抗抑郁、抗肿瘤、抗血栓、抗菌、镇痛和抗炎等广泛的药理作用。已有研究报道Mag可以减轻葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium，DSS)诱导的小鼠结肠炎，与调节炎症和修复黏膜损伤有关。但Mag口服后面临溶解性差(仅40μg/mL)、胃肠道稳定性差、对UC病变部位的靶向性差，全身消除快等问题，导致其生物利用率低，影响UC的治疗效果。

基于此，本发明设计了一种结肠靶向PLGA/DDAB纳米粒的构建方法及其给药系统，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结肠靶向PLGA/DDAB纳米粒的构建方法及其给药系统，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种结肠靶向PLGA/DDAB纳米粒的构建方法，包括采用乳化法制备PLGA纳米粒，以纳米粒的粒径、Zeta电位、多分散指数、包封率和载药量为指标，对双十八烷基二甲基溴化铵用量、Mag投药量、超声功率以及HA浓度进行单因素考察，确定最佳制备工艺，最佳制备工艺具体包括如下步骤：

步骤一：称取PLGA 100mg，DDAB 20mg，Mag 10mg共同溶于2mL二氯甲烷中，涡旋使之溶解作为油相；

步骤二：量取20mL 1％浓度的PVA水溶液作为水相；

步骤三：取油相，在冰浴超声条件下将油相逐滴加入水相中；

步骤四：将步骤三中将所得乳液减压旋蒸除去有机溶剂，使纳米粒固化得到Mag-NPs纳米混悬液；

步骤四：将步骤四中将所得纳米混悬液按1：1(v/v)滴入20mL 0.2％浓度的HA溶液中，室温下搅拌3h，即得HA@Mag-NPs纳米混悬液。

优选的，所述超声条件包括：功率：300W、开5s关3s、时间5min。

本发明的另一目的在于提供一种结肠靶向PLGA/DDAB纳米粒的给药系统，包括PLGA、Mag和HA，所述PLGA作为载体将Mag包封于纳米粒中，并通过静电吸附效应实现的表面功能化，形成用于通过结肠炎部位激活的CD44受体而特异性地靶向结肠巨噬细胞的HA@Mag-NPs纳米粒。

优选的，所述HA@Mag-NPs纳米粒的最佳储存稳定为4℃。

优选的，所述HA@Mag-NPs纳米粒呈规整球形核壳结构。

优选的，所述HA@Mag-NPs纳米粒的粒径为(287.68±7.30)nm，PDI为(0.17±0.08)，Zeta电位为(-18.04±0.78)mV(n＝3)。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明设置的构建方法可以很好的形成HA@Mag-NPs纳米粒，制备的HA@Mag-NPs粒径均一、呈规整球状，可清晰看到核壳结构，具有较高的包封率及载药量，DSC分析、红外光谱等均证明HA@Mag-NPs被成功制备，在研究周期内我们制备的纳米粒在4℃储存时稳定性良好，并具有缓慢的释药行为，在7天内能持续释放药物。

2.本发明设置的给药系统，口服后，基于PLGA聚合物的保护作用，制备的HA@Mag-NPs能克服胃肠环境的破坏，顺利到达结肠靶部位，并在结肠靶部位有效滞留，实现Mag的持续释放，为提高药物的生物利用度以及对UC的精准治疗提供新思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为Mag的HPLC色谱图；(a)Mag对照品；(b)HA@Mag-NPs；(c)HA@Blank-NPs；

图2为Mag标准曲线；

图3为Mag-NPs及HA@Mag-NPs的粒径及电位分布图；

图4为纳米粒的形态；(a)HA@Mag-NPs溶液外观；(b)Mag-NPs透射电镜形态；(c)HA@Mag-NPs透射电镜形态；

图5为不同样品的DSC分析图；

图6为不同样品的FT-IR图谱；

图7为纳米粒在不同储存温度下的稳定性；

图8为在37℃不同释放介质中的累积释药曲线；(a)人工胃液中释放；(b)人工小肠液中释放；(c)人工结肠液中释放；(d)连续释放(n＝3)；

图9小鼠体内生物分布；(a)，(b)Free DIR、DIR-NPs、HA@DIR-NPs的小鼠体内生物分布；(b)Free DIR、DIR-NPs、HA@DIR-NPs的肠道内分布；

图10Free C6、C6-NPs和HA@C6-NPs在给药后不同时间的结肠组织内分布；

图11小鼠体重变化及疾病活动指数(DAI)评分；(a)小鼠体重变化；(b)DAI评分(n＝8)；

图12小鼠结肠长度评价；(a)小鼠结肠图；(b)小鼠结肠长度直方图(n＝8)；

图13小鼠结肠、心、肝、脾、肺、肾的病理变化；(a)结肠组织H&E及PAS染色；(b)小鼠脏器H&E染色。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器

1.2主要试剂

2试验方法

2.1HA@Mag-NPs的制备方法

本实验采用乳化法制备PLGA纳米粒：称取PLGA，DDAB，Mag共同溶于2mL二氯甲烷中，涡旋使之溶解作为油相。量取20mL 1％浓度的聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol，PVA)水溶液作为水相。取油相，在冰浴超声条件下将油相逐滴加入水相中，将所得乳液减压旋蒸除去有机溶剂，使纳米粒固化得到Mag-NPs纳米混悬液。将所得纳米混悬液按1：1(v/v)滴入HA溶液中，室温下搅拌3h，即得HA@Mag-NPs纳米混悬液。

2.2Mag含量测定方法的建立

2.2.1色谱条件

色谱柱：Welchrom-C18(4.6×250mm，5μm)；

流动相：甲醇-水(78︰22)

检测波长：294nm；

体积流量：1mL/min

柱温：35℃

进样量：10μL

2.2.2对照品溶液的配制

取Mag对照品适量，精密称量，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，配制成Mag对照品溶液质量浓度为1.042mg/mL，并作为母液。

2.2.3供试品溶液的配制

取HA@Mag-NPs纳米混悬液1mL至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，于超声波清洗机1000W超声10min，破坏纳米粒，使HA@Mag-NPs中Mag完全释放，溶液过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。同法制得不载药的HA@Blank-NPs供试品溶液。

2.2.4专属性考察

取Mag对照品溶液，HA@Mag-NPs、HA@Blank-NPs供试品溶液各10μL用高效液相色谱(High-performance liquid chromatography，HPLC)分析，通过获得的色谱图形来判断方法的专属性。

2.2.5线性关系考察

取Mag对照品溶液适量加入10mL容量瓶中，用甲醇配制成质量浓度分别为521、260.5、130.25、65.125、32.5625、16.28125μg/mL的系列对照品溶液，将稀释液取相同体积过0.22μm微孔滤膜，进样10μL检测峰面积。

2.2.6精密度考察

精密吸取同一供试品溶液10μL，同日内连续进样6次，记录Mag的峰面积，计算峰面积相对标准偏差值(Relative standard deviation，RSD)。

2.2.7重复性考察

同一批次制备6份HA@Mag-NPs纳米粒供试品溶液，按上述色谱条件进样测定峰面积，计算Mag峰面积的RSD值。

2.2.8加样回收率

取6份已知含量的HA@Mag-NPs溶液，分别加入Mag对照品溶液(1.042mg/mL)120μL，随后按供试品制备方法制备供试品溶液，过0.22μm微孔滤膜。进样10μL，根据线性曲线计算Mag浓度，并以药物计算量/实际加入药物量计算加样回收率。

2.2.9稳定性考察

取同一供试品溶液，于室温在0、2、4、8、12、18、24h进样检测，记录Mag峰面积，计算RSD值，考察其室温稳定性。

2.3HA@Mag-NPs的处方筛选

2.3.1DDAB用量考察

按照处方工艺，保持其他参数不变，考察PLGA：DDAB＝20：1、10：1、5：1、2.5：1时对PLGA纳米粒的影响，以粒径、多分散指数(Polydispersion index，PDI)、包封率(Encapsulation efficiency，EE)及载药量(Loading efficiency，LE)为评价指标，对DDAB用量进行筛选。将上述各投药比例下所制得的纳米混悬液按1：1(v/v)滴入0.1％浓度的HA溶液中，室温下搅拌3h得到HA@Mag-NPs，检测其粒径、PDI及Zeta电位，评估与HA结合的能力。

2.3.2投药量考察

按照处方工艺，保持其他参数不变，考察PLGA：Mag＝20：1、10：1、5：1、2.5：1时对PLGA纳米粒的影响，以粒径、PDI、包封率、载药量为评价指标，对Mag投药量进行筛选。

2.3.3超声功率考察

按照处方工艺，保持其他参数不变，考察超声功率为60％、45％、30％、15％(总功率1000W)时对PLGA纳米粒的影响，以粒径、PDI、包封率、载药量为评价指标，对超声功率进行筛选。

2.3.4HA浓度考察

按照上述筛选出的最佳工艺，制备一批Mag-NPs纳米混悬液，将所得纳米混悬液按1：1(v/v)分别滴入浓度为0.4％、0.2％、0.1％、0.05％的溶液中，室温下搅拌3h，得到HA@Mag-NPs纳米混悬液。以粒径、PDI、Zeta电位为评价指标，对HA的浓度进行筛选。

2.4Mag-NPs及HA@Mag-NPs的基本表征

2.4.1粒径及电位

对于纳米粒来讲，粒径是衡量纳米粒整体的一个极其重要的指标，它的大小以及分布对于其自身以及后续实验都会产生很大的影响。我们利用纳米激光粒度仪动态光散射法(Dynamic light scattering，DLS)测定PLGA纳米粒的粒径分布以及其Zeta电位。

取0.3mL过膜后的NPs置于粒径杯中，用超纯水稀释至3mL，使用粒径分析仪测量NPs的粒径、PDI；再置于特制电极中，使用粒径分析仪测量NPs的Zeta电位。平行测量3次。

2.4.2形态观察

采用透射电子显微镜来进行纳米粒的外貌表征，取适量Mag-NPs及HA@Mag-NPs滴至覆有支持膜的铜筛网上，用2％磷钨酸染色2min后用滤纸吸去多余的染液，自然干燥后用透射电镜观察其轮廓和形态，并拍摄照片。

2.4.3包封率及载药量

采用高速离心法结合HPLC法，测定PLGA纳米粒中Mag的含量，并计算其包封率及载药量。将制备得到的纳米粒溶液离心(4℃，10000rpm，20min)，取上清液400μL，加入10倍量甲醇，超声10min(25℃，1000W)，另取制备得到的纳米粒溶液400μL，加入10倍量甲醇，超声10min(25℃，1000W)，破乳释放出药物。0.22μm微孔滤膜过滤，按照2.2.1项下色谱条件检测，分别测得游离药物的浓度和总药物的浓度，计算出游离药物的质量W游离，总药物的质量W总。

包封率的计算公式：EE％＝(W总-W游离)/W总×100％

载药量的计算公式：LE％＝(W总-W游离)/Wm×100％

(Wm表示纳米粒中Mag的质量加上载体材料的质量)

2.4.4差示扫描量热法分析

为了确定制备的NPs中Mag的物理状态，将制备的HA@Mag-NPs及空白对照制剂HA@Blank-NPs冻干，在铝坩埚中称重，使用热分析工作站软件，在氮气环境下，以10℃/min的加热速率在30至300℃的范围内加热，对HA@Mag-NPs、HA@Blank-NPs、游离Mag及材料物理混合物进行DSC分析。

2.4.5傅立叶变换红外光谱分析

红外吸收光谱(IR)是根据分子振动确定具有红外辐射吸收特性的分子结构的方法。进行FT-IR测定以确定HA@Mag-NPs的结构表征。通过400到4000cm

2.4.6稳定性考察

按照最优制备方法，制备三批Mag-NPs及HA@Mag-NPs，分别置于室温(25-30℃)或4℃下储存，在每天相同时间内分别测定粒径及电位，考察其稳定性。

2.4.7体外释放行为考察

透析介质的配制：

人工胃液(Simulated gastric fluid，SGF)：称取胃蛋白酶10g，用适量水溶解后加水稀释至1000mL，用盐酸调节pH至1.2，即得。

人工小肠液(Small intestinal fluid，SIF)：称取胰蛋白酶10g，磷酸二氢钾6.8g，适量水溶解后加水稀释至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节pH至6.8，即得。

人工结肠液(Simulated colonic fluid，SCF)：称取磷酸氢二甲5.59g，磷酸二氢钾0.41g，适量水溶解后加水稀释至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4，即得。

由于Mag难溶于水，在人工胃液、人工小肠液、人工结肠液中加入适量吐温-80，配制成含2％(w/v)吐温-80的透析介质，以促进Mag的溶解。

(2)采用透析法进行体外释放研究，设定空气摇床温度为37℃，振荡频率为恒速100r·min

a.不同透析介质释放：分别取2mL游离Mag溶液，2mL HA@Mag-NPs纳米溶液，2mLMag-NPs纳米溶液放入透析袋中(截留分子量：14000)，两端扎紧，分别置于50mL各释放介质中，在时间点(0，0.5，1，1.5，2，3，4，5，6，8，10，12，24，36，48，72，96，120，144，168h)取样0.5mL，并补充等体积等温的新鲜释放介质。

b.连续释放：分别取2mL游离Mag溶液，2mL HA@Mag-NPs纳米溶液，2mL Mag-NPs纳米溶液放入透析袋中(截留分子量：14000)，两端扎紧，在0-2h内置于人工胃液中，分别在0，0.5，1，1.5，2h取0.5mL释放液，并补充等体积等温的新鲜人工胃液；在2-6h内，将透析袋转移至人工小肠液中，在3，4，5，6h取0.5mL释放液，并补充等体积等温的新鲜人工小肠液；6h后将透析袋转移至人工结肠液中，在8，10，12，24，36，48，72，96，120，144，168h取0.5mL释放液，并补充等体积等温的新鲜人工结肠液。

将上述所取样品加入4倍量甲醇，超声提取10min，于离心机10000r·min

2.5HA@Mag-NPs的结肠靶向性及体内药效评价

2.5.1动物造模及给药

参照文献所述建模方法，小鼠适应性饲养一周后，将48只小鼠(体重28±2g)随机分为对照组、阳性组、DSS模型组、Free Mag组和Mag-NPs组、HA@Mag-NPs组，每组8只，除空白组小鼠以外的各组小鼠均建立UC小鼠模型。用2.5％的DSS诱导小鼠结肠炎，连续造模7天，期间时刻观察并记录小鼠精神及体重变化情况，评估造模是否成功。判断UC模型成功的标准：小鼠反复出现大便稀溏，严重者出现便血，身形瘦弱，进食欲望及体重均较造模前显著降低；小鼠毛色黯淡无光泽，精神萎靡。

在造模第4天造模成功，开始给药。Free Mag组和Mag-NPs组、HA@Mag-NPs组剂量为10mg/kg(以Mag含量计算)，阳性组剂量为20mg/kg(以5-ASA含量计算)，空白组和模型组给予等剂量生理盐水。给药周期为7天。

2.5.2动物组织采集

小鼠治疗周期结束后，脱椎处死小鼠，剖取小鼠结肠，测量结肠长度。部分结肠用4％多聚甲醛固定，用于组织病理切片。部分结肠保存在-80℃以便后续进行酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)及蛋白印迹法(Western Blotting，WB)分析。接着将小鼠的心、肝、脾等主要器官完整取出，去除表面多余黏膜，冰PBS溶液中漂洗，滤纸吸干，称量后置于4％多聚甲醛溶液中固定，用于组织病理切片。

2.5.3小鼠疾病活动指数评分

每天记录体重、粪便特征和便血程度。每个参数的评分如下：体重下降(0，<1％；1，1-5％；2，5-10％；3，10％-15％；4，>15％)，粪便中是否有血(0，阴性；2，大便中隐藏血液；4，大便出血)，以及大便一致性(0，阴性；2，大便稀松；4，腹泻)。

2.5.4组织的H&E染色及PAS染色

取出4％多聚甲醛固定后的结肠、心、肝、脾等主要器官，通过石蜡包埋后切片，用苏木精-伊红(Hematoxylin&Eosin，H&E)染色，待封片后，置于光学显微镜下成像，观察各组织结构。结肠组织另进行过碘酸雪夫(Periodic Acid-Schiff stain，PAS)染色，以标记杯状细胞。

2.5.5活体成像

为了研究HA@Mag-NPs的体内分布情况，利用动物成像系统进行体内荧光成像。使用荧光化合物DIR代替Mag药物，按制备工艺将其包载于PLGA纳米粒中，分别制成Free DIR、DIR-NPs及HA@DIR-NPs。将DSS(2.5％，w/v)添加到饮用水中，连续给雄性ICR小鼠饮用7天，以诱导UC小鼠模型。造模成功的小鼠按1mg/kg(以DIR计)的剂量分别给予Free DIR、DIR-NPs及HA@DIR-NPs。然后将小鼠于麻醉后用成像系统进行成像(激发波长745nm，发射波长800nm)，成像时间点为0.5、2、6、12、24h。并在各时间点处死小鼠，分离小肠和远端结肠，并立即进行荧光检测，无需冲洗。通过Living Image Version 4.5软件，分析小鼠整体及局部组织的荧光强度。

2.5.6组织渗透及滞留

为了确定HA@Mag-NPs的结肠靶向性及组织滞留性，我们使用荧光显微镜观察了不同制剂在UC结肠组织中的渗透及滞留情况。UC模型造模成功的小鼠单次口服Free C6、HA@C6-NPs及C6-NPs，分别在给药6、12、24h后处死小鼠。在黑暗环境中收集结肠，将结肠切成小段，用OCT包埋剂包埋后立即放入液氮中冷冻成型，使用冷冻切片机进行切片，每次切片厚度为10μm。制得的切片标本用纯水轻轻润洗2-3次，滴加少量DAPI细胞核染液覆盖组织进行细胞核染色，使用荧光显微镜进行拍照。

2.6数据处理

所有数据均以均值±标准差表示，并用GraphPad Prism 8.0软件中one-wayanalysis of varian进行分析，*p<0.05表示具有显著性差异。

3实验结果

3.1Mag的HPLC含量测定方法

3.1.1专属性考察

专属性考察结果如图1所示，供试品色谱峰与对照品色谱峰保留时间一致，且分离度和峰形均符合含量测定要求。HA@Blank-NPs供试品溶液在Mag出峰处(约11min)无干扰，说明本方法专属性良好。

3.1.2线性关系考察

以浓度为横坐标(X)，峰面积(Y)为纵坐标作图，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程Y＝15948042.62210X+43651.1095，R2＝0.9999，结果表明Mag在16.28125～521μg/mL呈良好的线性关系。

3.1.3精密度

实验结果见表1-1，计算得到Mag的峰面积RSD值为0.068％，表明该方法的日内精密度良好，符合含量测定标准。

表1-1精密度考察结果

3.1.4重复性考察

实验结果见表1-2，计算得到重复性考察结果RSD值为1.40％，表明制备方法重复性良好。

表1-2重复性考察结果

3.1.5加样回收率

实验结果见表1-3，Mag的平均回收率为98.97％，RSD为1.70％，结果表明该方法准确度良好。

表1-3Mag回收率考察结果

3.1.6稳定性考察

稳定性考察结果见表1-4，在24h内测得的Mag峰面积的RSD为1.18％，表明样品24h内在室温下稳定性良好，符合方法学要求。

表1-4稳定性考察结果

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3.2HA@Mag-NPs的处方筛选结果

3.2.1DDAB用量筛选

DDAB用量筛选结果如表1-5所示，将制得的各样品与HA结合后结果如表1-6所示。PLGA：DDAB＝5：1时制备的纳米制剂粒径较小且包封率、PDI值在适宜范围波动，电位适中，吸附HA后粒径增加幅度小。综上，选择PLGA：DDAB＝5：1进行后续实验。

表1-5DDAB的含量对Mag-NPs的影响(n＝3)

表1-6不同DDAB含量的Mag-NPs与HA结合能力评估结果(n＝3)

3.2.2投药量考察

Mag投药量考察结果如表1-7所示，PLGA：Mag＝10：1时制备的纳米制剂粒径及PDI值较小，且包封率、载药量在适宜范围波动，Zeta电位适中，综上，选择PLGA：Mag＝10：1进行后续实验。

表1-7Mag的加入量对Mag-NPs的影响(n＝3)

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3.2.3超声功率考察

超声功率考察结果如表1-8所示，探头超声仪总功率为1000W，超声功率在30％功率，即300W以上时对纳米粒的粒径、PDI值、包封率等影响不大，从节能角度考虑，选择超声功率为30％进行后续实验。

表1-8超声功率对Mag-NPs的影响(n＝3)

3.2.4HA浓度考察

HA浓度考察结果如表1-9所示，随着HA浓度增大，纳米粒的粒径增大，电位负值的绝对值增大，表明HA能有效吸附于纳米粒表面，屏蔽DDAB带来的正电荷，当HA浓度达到0.2％时，电荷绝值不再增加，表明在这个浓度下，不再有剩余正电荷可以吸附HA，HA已经在纳米粒表面吸附完全，因此选择0.2％浓度的HA溶液进行后续实验。

表1-9HA浓度对HA@Mag-NPs的影响(n＝3)

3.2.5Mag-NPs及HA@Mag-NPs制备工艺和处方的确定

根据上述单因素考察结果，优选Mag-NPs及HA@Mag-NPs处方和制备工艺如下：称取PLGA 100mg，DDAB 20mg，Mag 10mg共同溶于2mL二氯甲烷中，涡旋使之溶解作为油相，量取20mL 1％浓度的PVA水溶液作为水相。取油相，在冰浴超声条件下(300W，开5s关3s，时间5min)将油相逐滴加入水相中，将所得乳液减压旋蒸除去有机溶剂，使纳米粒固化得到Mag-NPs纳米混悬液。将所得纳米混悬液按1：1(v/v)滴入20mL 0.2％浓度的HA溶液中，室温下搅拌3h，即得HA@Mag-NPs纳米混悬液。

3.3Mag-NPs及HA@Mag-NPs的表征

3.3.1粒径、电位、包封率及载药量

按制备工艺制备3批样品，测得其粒径为(237.78±3.99)nm，PDI为(0.12±0.02)，Zeta电位为(13.14±1.69)mV(n＝3)。HA包裹后粒径稍微增大，粒径为(287.68±7.30)nm，PDI为(0.17±0.08)，Zeta电位为(-18.04±0.78)mV(n＝3)。

3.3.2形态观察

如图4(a)所示，制备好的纳米混悬液呈乳白色，质地均一，透光观察显淡蓝色乳光，表明将Mag包封于纳米粒中，能够较好地增加其溶解度，改善其水溶性差的问题。

如图4(b)(c)所示，TEM结果表明所制备的Mag-NPs及HA@Mag-NPs的形态均呈球形，比较规则，圆整，大小比较均一。同时，HA包裹的纳米粒可清晰看到核壳结构，表明HA能有效吸附于纳米粒表面。

3.3.3包封率及载药量

根据标准曲线计算HA@Mag-NPs中被包载的Mag含量，以及未包载的Mag含量，代入包封率及载药率公式计算，HA@Mag-NPs中Mag包封率达到了(80.99±1.65)％，载药量达到了(6.38±0.13)％。

表1-10包封率及载药量(n＝3)

3.3.4差示扫描量热法分析

DSC分析结果如图5，Free Mag的热分析图在100℃有一个吸热峰，对应于其熔点，这表明该药物可能是结晶形式。HA+DDAB+PLGA+Mag(物理混合物)的热分析图在100℃也有一个吸热峰，表明材料和药物经过物理混合后其中药物仍以晶体状态存在，然而负载的HA@Mag-NPs的热谱图中没有尖峰，表明药物的晶体形式在制备的NPs中已经减少，它可能被包封或处于无定形状态。

3.3.5傅立叶变换红外光谱分析

FT-IR图谱如图6所示，我们观察到了游离Mag的FT-IR特征峰，分别为3165.68、1496.19和816.35cm

3.3.6Mag-NPs及HA@Mag-NPs纳米粒稳定性考察

稳定性考察结果见图7，在室温时，Mag-NPs的平均粒径、PDI及电位在15天内保持稳定，但HA@Mag-NPs平均粒径从第5天开始有上升趋势且电荷绝对值减小，可能是由于纳米粒表面HA解吸附造成的。4℃时，Mag-NPs及HA@Mag-NPs的平均粒径、PDI及Zeta电位值没有明显变化，纳米粒子没有发生聚集和融合，因此，在研究周期内Mag-NPs及HA@Mag-NPs纳米粒在4℃储存时质量稳定。

3.3.7体外释放行为考察

图8显示为在37℃不同释放介质中的累积释药曲线，由图可知，在人工胃液中，游离Mag及纳米制剂释放速率相差不多，而在人工小肠液及人工结肠液中，纳米制剂相较游离Mag，其释放速率明显减慢。为了更好的模拟药物从胃到小肠再到结肠的流体环境，我们同时进行了药物在不同释放介质中连续释放的实验，结果显示，在0-2h，游离药及纳米制剂在人工胃液中极少释放；在2-6h，游离Mag释放率约为2％-4％，HA@Mag-NPs及Mag-NPs纳米制剂释放率约为6％-8％，可能是由于纳米制剂中含有的少量未包载的药物产生突释；在6h后，游离药物在人工结肠液中的释放速率明显快于纳米制剂，表明Mag在被PLGA包裹后表现出较慢的释药行为，在7天内能持续释放药物，可发挥长效治疗作用。同时释药曲线显示，HA@Mag-NPs及Mag-NPs纳米制剂在从胃到小肠再到结肠的流体环境中，不会被胃液及小肠液的环境破坏而发生药物泄露，表明HA@Mag-NPs及Mag-NPs纳米制剂具有结肠靶向释药特性。

3.4HA@Mag-NPs的结肠靶向性及药效

3.4.1活体成像

体内生物分布分析是研究药物在病变部位的滞留或靶向性的重要策略。FreeDIR、DIR-NPs、HA@DIR-NPs在小鼠体内分布结果如图9所示。如图a、b所示，给药后2h内，HA@DIR-NPs组小鼠活体荧光强度与Free DIR组具有显著性差异，而与DIR-NPs组无明显差异，表明经制剂材料的包裹，能有效避免荧光材料的破坏，我们的制剂系统对药物具有良好的保护作用。在小鼠灌胃给药12h后，HA@DIR-NPs的荧光强度明显高于Free DIR和DIR-NPs组。24小时后，在小鼠体内几乎看不到Free DIR的荧光，而纳米给药组的荧光相对保留得较多，尤其在HA@DIR-NPs组中仍能观察到明显荧光。结果表明，HA@DIR-NPs在小鼠体内的荧光保留时间较长，说明制剂能对药物进行有效保护并有助于缓释。为了反映DIR在胃肠道中的分布，我们对胃肠道荧光进行进一步检测。如图c，0.5h时，Free DIR的荧光主要聚集在胃内，6h后药物到达结肠部位并聚集，HA@DIR-NPs组在结肠部荧光明显强于其他两组，12h后HA@DIR-NPs组几乎完全在结肠部位聚集，而Free DIR组药物大部分已经排出体外，24h后，药物均几乎完全排出体外。结果表明，纳米粒不被胃肠道破坏，并能特异性地聚集到结肠炎部位，证实了HA@DIR-NPs具有良好的结肠靶向性。

3.4.2组织渗透及滞留

Free C6、C6-NPs和HA@C6-NPs在UC组织中的摄取结果如图10所示，与Free C6和C6-NPs组相比，HA@C6-NPs组在炎症结肠组织中具有最强的荧光，并且HA@C6-NPs能够随着时间在结肠病变组织中累积，表明HA@C6-NPs能有效渗透并蓄积到UC病变组织中，并能长时间滞留发挥缓释作用。

3.4.3小鼠体重变化及疾病活动指数评分

小鼠体重变化如图11(a)所示，正常组随着时间的增加体重明显增长，模型组在造模过程中体重出现下降，当停止造模药后体重有所回升。其他治疗组由于药物作用的维持，体重仅在小范围波动，且与其他组相比，经Mag-NPs及HA@Mag-NPs治疗后对DSS诱导的体重减轻症状改善效果最好。

DAI评分趋势图如图11(b)所示，正常组小鼠在实验过程中没有出现腹泻以及便血等情况；其余组小鼠在第5、6、7天普遍出现精神萎靡，毛色凌乱暗淡，稀便或便血等现象，因此DAI评分达到峰值。治疗组由于药物的治疗作用，各种症状逐渐改善，到第10天HA@Mag-NPs治疗组基本恢复正常状态，HA@Mag-NPs治疗组与模型组相比具有显著性差异(p＜0.001)。

3.4.4小鼠结肠长度评价

小鼠结肠长度变化如图12(a)所示，模型组的小鼠结肠组织充血水肿明显，粪便可见明显血迹，且结肠有明显缩短变粗的现象。如图12中(b)所示，模型组结肠长度约6.23cm，与正常组相比显著缩短(p＜0.001)。经过药物治疗后，结肠长度缩短水肿的症状得到改善，HA@Mag-NPs治疗组的结肠长度约9.87cm，接近于正常组，且明显长于Free Mag组。HA@Mag-NPs治疗组及Mag-NPs治疗组与模型组相比具有显著性差异(p＜0.001)，表明HA@Mag-NPs更能有效改善DSS诱导的UC结肠缩短。

3.4.5组织病理学观察

H&E染色结果图13显示，正常结肠组织隐窝表面规则，可见大量杯状细胞，模型组隐窝缺失，杯状细胞消失，炎症细胞浸润，在4个治疗组中HA@Mag-NPs组的结肠组织的炎症症状得到最明显的改善。PAS染色的原理是细胞中的糖原、多糖类物质经PAS染色后呈紫红色阳性反应物，这里我们用PAS染色来显示杯状细胞。对照组小鼠结肠隐窝内可见密集分布的杯状细胞，而模型组小鼠结肠杯状细胞几乎完全破坏。在4个治疗组中HA@Mag-NPs组对结肠组织的杯状细胞具有最明显的保护作用。

通过对实验小鼠心、肝、脾等主要器官进行H&E染色分析，我们发现各组主要器官的H&E染色拍照结果无明显差异，各给药组对小鼠的心、肝、脾等主要器官并未造成损伤，表明制剂及材料的生物安全性较好。

4小结

本章实验采用乳化法制备PLGA/DDAB纳米粒。建立含量测定方法，并对其进行方法学考察，结果显示含量测定方法符合测定条件。以纳米的粒径、Zeta电位、多分散指数、包封率和载药量为指标，对DDAB用量、Mag投药量、超声功率以及HA浓度等进行单因素考察，确定最佳制备工艺。最终优选Mag-NPs及HA@Mag-NPs处方和制备工艺如下：称取PLGA 100mg，DDAB 20mg，Mag 10mg共同溶于2mL二氯甲烷中，涡旋使之溶解作为油相，量取20mL 1％浓度的PVA水溶液作为水相。取油相，在冰浴超声条件下(300W，开5s关3s，时间5min)将油相逐滴加入水相中，将所得乳液减压旋蒸除去有机溶剂，使纳米粒固化得到Mag-NPs纳米混悬液。将所得纳米混悬液按1：1(v/v)滴入20mL 0.2％浓度的HA溶液中，室温下搅拌3h，即得HA@Mag-NPs纳米混悬液。按最佳制备工艺制备的样品，粒径均一，测得其粒径为(237.78±3.99)nm，PDI为(0.12±0.02)，Zeta电位为(13.14±1.69)mV(n＝3)。HA包裹后粒径稍微增大，粒径为(287.68±7.30)nm，PDI为(0.17±0.08)，Zeta电位为(-18.04±0.78)mV(n＝3)。通过高效液相色谱法测定药物含量，利用包封率和载药率公式计算得到其包封率为(80.99±1.65)％，载药量为(6.38±0.13)％，符合制剂要求。

TEM拍摄结果显示HA@Mag-NPs呈规整球状，可清晰看到核壳结构，表明HA能有效吸附于纳米粒表面。DSC分析、红外光谱等分析结果均证明Mag被成功地包裹到纳米粒中。在4℃储存条件下时，纳米粒的平均粒径、PDI及Zeta电位值没有明显变化，纳米粒子没有发生聚集和融合，因此，在研究周期内我们制备的纳米粒在4℃储存时质量稳定。同时，通过体外释放研究表明Mag在被PLGA包裹后表现出较慢的释药行为，在7天内能持续释放药物。同时释药曲线显示，HA@Mag-NPs及Mag-NPs纳米制剂在从胃到小肠再到结肠的流体环境中，不会被胃液及小肠液的环境破坏而发生药物泄露，从而能够保持其稳定的药物递送功能。

我们成功构建了小鼠UC模型并进行了制剂的结肠靶向性及体内药效学评估。活体成像技术证明了我们的制剂可克服苛刻的胃环境，能特异性地到达结肠炎症部位，具有明显的结肠靶向性，并能有效渗透并蓄积到组织中，从而在UC病灶长效释放药物发挥治疗作用。在体内药效实验研究中，HA@Mag-NPs能有效改善DSS诱导的UC小鼠体重减轻，精神萎靡，毛色凌乱暗淡，稀便或便血，结肠水肿及缩短等现象，对UC有较好的治疗效果。小鼠结肠H&E染色结果显示，HA@Mag-NPs组能明显改善由DSS诱导引起的隐窝缺失，杯状细胞消失，炎症细胞浸润等现象，具有良好的抗炎作用，小鼠主要器官的H&E染色结果显示，各药物对小鼠器官未造成损伤，表明我们的材料及制剂具有良好的生物安全性。

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