用于评估和治疗年龄相关病况的组合物和方法

相关申请

本申请要求2021年8月26日递交的第63/237,147号美国临时专利申请的优先权，其内容在此通过引用整体并入本文中，用于所有目的。

背景技术

组织再生潜力的下降是老化过程的结果(Brack和

SCs在静息肌肉中保持静止，但在肌肉损伤后迅速激活，随后是快速肌源性谱系进展，以进行肌肉修复(Cheung和Rando,2013；Cheung et al.,2012；Shi和Garry,2006；So和Cheung,2018)。作为对损伤或疾病的响应，SCs经历快速激活，然后进行强健的增殖，以产生表达肌源性转录因子Myod1的祖细胞库(Yin et al.,2013；Yue et al.,2020；Zammit etal.,2006)。之后，祖细胞表达肌细胞生成素，并开始分化形成新再生的肌纤维。祖细胞的一个子集进行自我更新以补充静止的SC群体(Kuang etal.,2008；Motohashi和Asakura,2014；Urbán和Cheung,2021)。在老化过程中，SCs激活、增殖和分化的能力降低(Brett etal.,2020；Li et al.,2019；Sousa-Victor et al.,2014)。然而，这种下降背后的机制仍然难以捉摸。强健的肌源性谱系进展需要足够的能量供应(Bhattacharya和Scimè,2020；Salaet al.,2019)，其中线粒体是能量代谢的中心(Cogliati et al.,2016；Friedman和Nunnari,2014；Wallace et al.,2010)。然而，在SCs中，线粒体蛋白质组和活性是否在老化过程中发生改变在很大程度上仍然未知。

细胞质聚腺苷酸化元件结合蛋白1-4(CPEB1-4)是与细胞质聚腺苷化元件(CPE)序列结合并通过诱导其多聚(A)尾的细胞质操纵来调节其靶标转录物翻译的RNA结合蛋白(Bava et al.,2013；Cao et al.,2018；Fernández-Miranda和Méndez,2012；Ford et al.,2019；Lu et al.,2017a)。CPEs位于3’UTRs中，发现于约20％的哺乳动物转录物上(Bava etal.,2013；Piquéet al.,2008)。在与CPE结合后，CPEB蛋白募集细胞质多聚(A)聚合酶GLD2以延长多聚(A)尾，以维持mRNA稳定性(Richter,2007)。mRNA稳定性与翻译输出呈正相关(Baek et al.,2008)。CPEB1-4的表达是组织特异性的，并与特异性转录物结合以调节其相应的细胞功能(Cao etal.,2018；Chen和Huang,2012；Ford et al.,2019；Kochanek和Wells,2013；Lu et al.,2017b；Parras et al.,2018；Zhang et al.,2020)。然而，对老化过程中SCs中的CPEB蛋白家族的功能知之甚少。

总之，与年龄相关的干细胞功能损伤与组织损伤后或疾病期间体细胞组织再生能力的下降相关。细胞代谢的改变与老化过程中的细胞衰老相关。因此，操纵新陈代谢以使老化细胞重新年轻化的方法在抗老化治疗应用中具有重要意义。显然需要开发新的和有效的治疗方法，以用于与年龄相关的病况和疾病。本发明满足了这一需求和其他相关需求。

发明内容

本申请提供了对细胞质聚腺苷酸化元件结合蛋白(CPEB)4的首次公开，其是与细胞质聚腺苷化元件(CPE)序列结合并通过诱导转录物的多聚(A)尾的细胞质操纵来调节其靶标转录物翻译的RNA结合蛋白家族的成员，在线粒体活性的调节中发挥作用。重要的是，CPEB4的表达水平在老化过程中下降。因此，根据这一发现设计了通过增加CPEB4活性来治疗老化相关疾病和病症的新的组合物和方法。

因此，在第一方面，本发明提供了使细胞重新年轻化或减少细胞衰老的方法。该方法包括增加细胞中CPEB4蛋白的表达水平或活性水平的步骤。在一些实施方案中，所述细胞是肌肉细胞或肌肉干细胞。在一些实施方案中，步骤(1)包括将编码CPEB4蛋白的核酸引入细胞中，使得有效量的CPEB4蛋白在细胞中表达。在一些实施方案中，所述细胞在人体内。

在相关方面，本发明提供了通过向人类给予包含编码CPEB4蛋白的多核苷酸序列的表达载体的方式来治疗人类患者中与年龄相关的病况或疾病的方法。在一些实施方案中，表达载体通过皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内注射，或者通过经口给药来进行给药。在一些实施方案中，在细胞被重新引回人体中之前，在离体下进行增加细胞中CPEB4蛋白的表达水平或活性水平的步骤。在一些实施方案中，细胞是肌肉干细胞，并且其中所述细胞被重新引到肌肉损伤部位。在一些实施方案中，表达载体包含可操作地连接到编码CPEB4蛋白的多核苷酸序列的肌肉细胞特异性的启动子，例如，Pax7启动子。

在第二方面，本发明提供了通过上述和本文所述的方法产生的重新年轻化的细胞以及包含此类细胞的组合物。在一些实施方案中，细胞是肌肉细胞或肌肉干细胞。在一些实施方案中，细胞存在于还包含一种或多种药学/生理学可接受的赋形剂的药物或生理学组合物中。在一些实施方案中，组合物被配制用于皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内注射，或者用于经口给药。还提供了包括容器的试剂盒，所述容器含有：(a)包含表达载体的组合物，所述表达载体包含编码CPEB4蛋白的多核苷酸序列；或者(b)包含通过上述和本文所述方法产生的重新年轻化的细胞的组合物以及包含细胞如肌肉细胞或肌肉干细胞的组合物。在一些实施方案中，表达载体包含可操作地连接到编码CPEB4蛋白的多核苷酸序列的肌肉细胞特异性的启动子(例如，Pax7启动子)。

与本发明的这一方面相关，进一步提供了增加CPEB4蛋白的表达或活性的CPEB4增强剂或化合物用于制造以下物质的新的用途：(1)用于治疗年龄相关疾病的药物；或者(2)含有用于治疗年龄相关疾病的药物的试剂盒。在一些实施方案中，药物包含有效量的增强剂和一种或多种生理学可接受的赋形剂或由其组成。在一些实施方案中，增强剂包含表达载体，所述表达载体包含编码CPEB4蛋白的多核苷酸序列并且能够指导CPEB4蛋白在靶向细胞或组织，特别是肌肉细胞或肌肉组织中的表达。

在第三方面，本发明提供了用于评估细胞衰老状态或用于评估与年龄相关的病况或疾病状态的方法。该方法包括这些步骤：(a)测定第一细胞中CPEB4蛋白的水平；(b)测定与第一细胞相同种类的第二细胞中的CPEB4蛋白水平；以及(c)在测定的所述第一细胞中的CPEB4蛋白水平高于所述第二细胞中的所述CPEB4蛋白水平时，确定所述第一细胞比所述第二细胞衰老程度低。在一些实施方案中，第一和第二细胞是相同的细胞类型：例如，两者都是肌肉细胞或肌肉干细胞。在一些实施方案中，第一细胞和第二细胞取自一个个体的两个解剖学部位或取自两个不同的个体，但优选具有相同的细胞类型或组织类型。

在第四个方面，本发明提供了用于鉴定能够调节细胞衰老或老化过程并因此有效治疗与年龄相关的疾病或病况的化合物的方法或筛选测定法。该方法包括以下步骤：(i)使细胞与候选化合物接触；(ii)在步骤(i)之前和之后测定细胞内CPEB4蛋白的水平；以及(iii)在存在化合物情况下在步骤(ii)中测定的CPEB4蛋白水平低于不存在化合物情况下步骤(ii)之前的细胞中的CPEB4蛋白水平时，将所述化合物鉴定为细胞衰老的增强剂或促进剂，并且在存在化合物情况下在步骤(ii)中测定的CPEB4蛋白水平高于不存在化合物情况下细胞中的CPEB4蛋白水平时，将所述化合物鉴定为细胞衰老的抑制剂或阻抑剂。在一些实施方案中，细胞是肌肉细胞或肌肉干细胞。在一些实施方案中，用于筛选测定中的细胞内源性表达CPEB4蛋白。在一些实施方案中，用于测定中的细胞不内源性地表达CPEB4蛋白，而是重组地表达CPEB4蛋白。

附图说明

图1：老年SCs表现出细胞衰老和线粒体缺陷。a，示意图显示了来自不同年龄PFA灌注小鼠(QSCs)的固定SCs的质谱分析。PFA，多聚甲醛；FACS，荧光激活的细胞分选。b，成年(3～6个月)、老化(18～24个月)和老年(>24个月)SCs的蛋白质表达的主成分分析(PCA)。c，SC特异性蛋白的代表性表达的热图。d，自噬相关蛋白的代表性表达的热图。e，Notch和Wnt信号传导相关蛋白的代表性表达的热图。f，衰老相关蛋白的代表性表达的热图。g，老年SCs中下调蛋白的Venn图以及有多少被鉴定为线粒体蛋白。h，老年SCs中下调线粒体蛋白的Reactome本体论分析。i，成年和老年SCs的Seahorse分析。FCCP，羰基氰化物-对三氟甲氧基苯基腙；Rot，鱼藤酮；AA.，抗霉素a。j，成年和老年SCs的基础和最大耗氧率(OCR)分析。j，*P<0.05，***P<0.001。n＝3。数据显示为平均值±s.d。

图2：CPEB4在老化过程中在各种组织中下调，并且CPEB4的丧失损害成年小鼠中的SC功能。a，各种成年和老年组织中的相对CPEB1-4相对mRNA水平。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。n＝3。数据表示为平均值±s.d。b，对胫骨前(TA)肌进行冷冻切片，然后对CPEB4和Pax7进行免疫染色。细胞核用DAPI染色。c，b中CPEB4相对荧光单位(RFUs)的定量。*P<0.05，n＝3。数据表示为平均值±s.d。d，显示CPEB4 cKO(条件性敲除)小鼠的产生的示意图。IRES，内部核糖体进入位点。STOP，停止盒。下图显示了e和f的实验设计。e，野生型(WT)和CPEB4 cKO SCs的EdU掺入分析。SCs被固定。通过点击化学进行EdU检测，并对细胞核进行染色(用DAPI)。f，EdU+SCs的定量。****P<0.0001。n＝3。数据表示为平均值±s.d。g，显示h-k的实验工作流程的示意图。h，用层粘连蛋白染色损伤后7天(DPI)TA肌肉的冷冻切片。细胞核用DAPI染色。i，h纤维大小的定量。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。n＝3。数据表示为平均值±s.d。j，用层粘连蛋白和Pax7对7块DPI TA肌肉的冷冻切片进行染色。细胞核用DAPI染色。k，j中Pax7+SC数量的定量。**P<0.01。n＝3。数据表示为平均值±s.d。

图3：CPEB4的丧失诱导线粒体缺陷和衰老相关的蛋白质组景观。a，示意图显示了注射他莫昔芬(TMX)两周后WT和CPEB4 cKO SCs的质谱分析的实验设计。b，WT和CPEB4 cKOSCs的蛋白质表达的spearman相关分析的相关性热图。c，CPEB4 cKO SCs中下调的线粒体蛋白的代表性表达的热图。d，显示来自WT和CPEB4 cKO小鼠的SCs的线粒体呼吸分析的实验设计的示意图。e，WT和CPEB4 cKO SCs的线粒体呼吸分析。f，将新鲜分离的SCs用指示的线粒体电子传输链复合物I抑制剂他莫昔芬或复合物III抑制剂抗霉素A处理5天，然后进行SA-β-Gal染色。g，对SA-β-Gal

图4：恢复CPEB4的表达使线粒体功能重新年轻化并防止细胞衰老。a，显示老年SCs的CPEB4或GFP感染的实验设计的示意图。b，对照(GFP感染的)和CPEB4感染的老年SCs的蛋白质表达的spearman相关性分析的相关性热图。c，CPEB4感染的老年SCs和线粒体蛋白中上调蛋白(从蛋白质组中鉴定的)的Venn图。d，CPEB4过表达的老年SCs中上调线粒体蛋白的代表性表达的热图。e，CPEB4过表达的老年SCs中上调线粒体蛋白的功能富集分析(生物过程)。f，GFP和CPEB4感染的SCs的线粒体呼吸分析。g，GFP和CPEB4感染的SCs的基础和最大OCR。h，按照定量细胞ATP产生率中概述的方法，使用Agilent Seahorse XF技术计算GFP和CPEB4感染的SCs的线粒体ATP产生。g和h，**P<0.01，***P<0.001。n＝3。数据表示为平均值±s.d。i，将等量的GFP或CPEB4感染的老年SCs移植到损伤前1天的老年小鼠中，持续两周。对TA肌肉进行切片，并对GFP和层粘连蛋白进行染色。细胞核用DAPI染色。j，GFP

图5：SC激活和肌肉再生在老化过程中延迟。a-d，成年和老年SCs的体外激活分析。a，新鲜分离的成年和老年SCs中Myod1蛋白的免疫染色。细胞核用DAPI染色。b，a中Myod1

图6：老年SCs显示出受损的转录和翻译蛋白质组景观。a，成年和老年SCs的蛋白质表达的spearman相关性分析的相关性热图。b，成年和老年SCs中Pax7蛋白的免疫染色。c，b中Pax7 RFUs的定量。****P<0.0001。n＝3。数据表示为平均值±s.d。d，成年、老化和老年SCs中剪接体相关蛋白的代表性表达的热图。e，成年、老化和老年SCs中核糖体相关蛋白的代表性表达的热图。f，来自老化SCs相对于成年SCs的差异表达蛋白的功能富集分析。g，来自老年SCs相对于成年SCs的差异表达蛋白的功能富集分析。f-h，显示显著更高表达的蛋白质显示为黑条；表达显著降低的蛋白质显示为白条(P<0.05)。

图7：老年SCs显示线粒体蛋白质组和活性的缺陷。a，成年、老化和老年SCs中氧化磷酸化或糖酵解相关蛋白的代表性表达的热图。b，老年SCs中下调的线粒体蛋白的代表性表达的热图。还显示了老年SCs中三种上调的线粒体蛋白。c，成年和老年SCs的细胞外酸化率(ECAR)分析。d，来自成年和老年SCs的线粒体ATP产生，*P<0.05。n＝3。数据表示为平均值±s.d。

图8：CPEB4在老年SCs中下调，但CPEB4的丧失不会影响未受损肌肉中的干细胞库和肌肉纤维大小。a，对新鲜分离的成年或老年SCs进行CPEB4和Pax7蛋白染色。细胞核用DAPI染色。b，a中CPEB4 RFUs的定量。****P<0.0001，n＝3。数据表示为平均值±s.d。c，显示d-g的实验工作流程的示意图。d，对冷冻切片的未损伤的TA肌肉进行层粘连蛋白染色，并用DAPI对细胞核染色。e，d中纤维大小的定量。n＝3。数据表示为平均值±s.d。f，对未注射的TA肌肉进行层粘连蛋白和Pax7染色。细胞核用DAPI染色。g，f中Pax7

图9：CPEB4敲低延迟肌源性谱系进展。a，对新鲜制备的单个肌纤维进行Pax7和CPEB4蛋白染色。对培养48小时的单个肌纤维进行Myod1和CPEB4染色。细胞核用DAPI染色。b，a中CPEB4 RFUs的定量。****P<0.0001。n＝3。数据表示为平均值±s.d。c，使用实时PCR评估用CPEB4 siRNA转染48小时的原代成肌细胞的CPEB4 mRNA。d，通过蛋白质印迹评估用CPEB4 siRNA转染48小时的原代成肌细胞的CPEB4蛋白表达。β-微管蛋白用作负载对照。***P<0.001。n＝3。数据表示为平均值±s.d。e，肌纤维上阴性对照(siNC)和CPEB4敲低(siCPEB4)SCs中EdU掺入的分析。在EdU存在下用CPEB4/对照siRNA转染新鲜制备的单个肌纤维。转染后30小时，收获纤维用于EdU检测和Myod1和CPEB4的免疫染色。f，EdU

图10：CPEB4的丧失导致线粒体蛋白质组和活性的缺陷。a，TMX注射后两周WT和CPEB4 cKO SCs的质谱分析。WT和CPEB4cKO SCs中差异表达蛋白的数量。b，Reactome通路中CPEB4 cKO SCs中的上调蛋白的功能富集分析。c，Reactome通路中CPEB4 cKO SCs中的下调蛋白的功能富集分析。d，与线粒体蛋白重叠的CPEB4 cKO SCs中下调的蛋白的Venn图。e，Reactome通路中CPEB4 cKO SCs中的下调的线粒体蛋白的功能富集分析。f，来自WT对照和CPEB4 cKO小鼠的SCs的Seahorse分析。来自WT对照和CPEB4 cKO小鼠的SCs的OCR分析。g，来自WT对照和CPEB4 cKO小鼠的SCs的ECAR通量分析。h，来自WT对照和CPEB4 cKO小鼠的SCs的线粒体ATP产生。f-h，**P<0.01，***P<0.001。n＝3。数据表示为平均值±s.d。

图11：CPEB4敲低会损害线粒体功能。a，用FCCP培养原代成肌细胞，然后进行JC-1FACS分析。b，象限2(Q2)中原发性成肌细胞百分比的计算。c，用CPEB4 siRNA转染SCs。转染后48小时，收获SCs以用于JC-1FACS分析。d，Q2中SCs百分比的计算。**P<0.01，***P<0.001，n＝3。数据表示为平均值±s.d。e，CPEB4敲低后的相对ATP水平。**p<0.01，***P<0.001，n＝3。数据表示为平均值±s.d。

图12：CPEB4与线粒体蛋白质编码转录物结合，并与线粒体翻译机制相互作用。a，使用RNA免疫沉淀测序(RIP-seq)进行的CPEB4相关基因分析。显示CPEB4 RIP-seq的工作流程的示意图。b，通过两个独立的CPEB1 RIP实验检测的基因的火山图。每个点代表一个基因。X轴表示-log(adj-P值)，Y轴表示log2(IP相对于IgG的倍数变化)。红点表示与CPEB4显著相关的基因。c，Reactome通路中CPEB4相关基因的功能分析。d，KEGG通路中CPEB4相关基因的功能分析。

图13：CPEB4相互作用蛋白与线粒体蛋白翻译相关。a，24小时培养的活化SCs的CPEB4和Tomm20免疫染色。通过结构光照明显微镜(SIM)对细胞进行成像。b，显示CPEB4 IP和随后的质谱分析的工作流程的示意图。c，在SCs中的IgG或CPEB4抗体免疫沉淀后，通过质谱分析检测的蛋白质的Venn图。红色矩形显示了CPEB4靶向的蛋白质。d，细胞组分(CC)通路中CPEB4相关蛋白的功能富集分析。e，CPEB4特异性相关蛋白的功能蛋白关联网络。f，这些CPEB4相关蛋白的不同簇的Reactome通路分析。

图14：线粒体代谢抑制诱导细胞衰老。a，将原代成肌细胞用指示的线粒体电子传输链复合物I抑制剂鱼藤酮或复合物III抑制剂抗霉素A处理5天，然后进行SA-β-Gal染色。b，SA-β-Gal

图15：CPEB4的长期丧失引起线粒体蛋白质组的严重缺陷。a，TMX注射后三个月WT和CPEB4 cKO SCs的质谱分析。WT和CPEB4cKO SCs中差异表达蛋白的数量。b，与线粒体蛋白重叠的CPEB4 cKO SCs中上调蛋白的Venn图。c，Reactome通路中CPEB4 cKO SCs中的下调蛋白的功能富集分析。d，与线粒体蛋白重叠的CPEB4 cKO SCs中下调蛋白的Venn图。e，Reactome通路中CPEB4 cKO SCs中的下调线粒体蛋白的功能富集分析。f，CPEB4 cKO SCs中差异表达线粒体蛋白的热图。

图16：恢复CPEB4表达使老年细胞重新年轻化。a，GFP和CPEB4感染的老年SCs的质谱分析。CPEB4蛋白在受感染的老年SCs中的表达(原始光谱数)。b，Reactome通路中过表达CPEB4的老年SCs中的上调蛋白的功能富集分析。c，Reactome通路中过表达CPEB4的老年SCs中的下调蛋白的功能富集分析。d，GFP和CPEB4感染的老年SCs的RNA测序。GFP和CPEB4感染的老年SCs中的CPEB4 RNA表达(原始读数计数)。e，Reactome通路中过表达CPEB4的老年SCs中的上调基因的功能富集分析。f，Reactome通路中过表达CPEB4的老年SCs中下调基因的功能富集分析。g，表达CPEB4的老年SCs中代表性的差异表达的蛋白质和RNAs的热图。h，显示CPEB4感染的老年SC移植实验的工作流程的示意图。i，将相等数量的GFP或CPEB4感染的老年SCs移植到损伤前1天的老年小鼠中，持续两周。对TA肌肉进行切片，并对GFP、Pax7和层粘连蛋白进行染色。对细胞核进行DAPI染色。j，GFP

定义

术语“CPEB4”是指细胞质聚腺苷酸化元件结合蛋白4或编码该蛋白的基因。人CPEB4基因位于人染色体5q35.2上，并且其cDNA序列被称为NM_030627.4，并且在本公开中如SEQ ID NO:1所示。如本文所用，术语“CPEB4”包括人CPEB4以及在其他物种中具有至少80％、85％、90％、95％或更高序列同源性并保持相同或相似生物活性的该蛋白质的同源物或直系同源物。该术语还包括由于替代剪接引起的基因产物(尤其是人CPEB4)的所有变体。示例性的人CPEB4氨基酸序列被称为NP_085130.2、NP_001295118.1、NP_001295120.1、NP_001295121.1和NP_001295122.1，在本文中如SEQ ID NOs:2、4、6、8和10所示。

术语“与年龄相关的病况”包括主要由老化引起的任何病况、疾病或病症，并且涉及随着时间的推移，组织、器官或整个生物体的正常生物功能逐渐减弱。老化的几种机制已经被确定，其包括基因组不稳定、端粒缩短和细胞衰老。老化是主要驱动因素，各种疾病现在被认为是与年龄相关的疾病，包括神经退行性疾病(痴呆症、阿尔茨海默病、帕金森病等)、炎症性疾病、心血管疾病、脑血管疾病(例如，中风)、癌症、关节炎、2型糖尿病、慢性阻塞性肺病(COPD)、高血压、骨关节炎/骨质疏松症、白内障、年龄相关性黄斑变性(AMD)、听力损失、免疫系统病症和肌肉骨骼病症。

如本文所用，术语“衰老”是指生物老化过程，在此过程中，细胞或活的生物体表现出其功能特征的逐渐退化或丧失。细胞衰老是其中细胞不能再分裂并因此不能再支持组织稳态的状态，例如，由于病理状况。衰老细胞通常表现出一系列决定性特征：除了不能进行细胞分裂和端粒长度显著缩短外，衰老细胞通常比同类型的正常细胞大，并且表达和分泌某些正常细胞不分泌或以更少的量分泌的分子(例如，衰老相关的β-半乳糖苷酶或SA-β-gal、肿瘤抑制因子p16INK4a、生长因子、细胞因子和衰老相关分泌表型(SASPs)等)。减少或逆转细胞或生物体的衰老状态或其特征的过程被称为“重新年轻化”(或其他语法衍生版本)。

“肌肉细胞”是指成肌细胞或肌细胞，这是一种特殊的动物前体细胞，当分化时，其可以通过使用一系列特别排列在细胞中的运动蛋白来缩短其长度。与其他细胞类型相比，肌肉细胞是一种长细胞。多个肌肉细胞融合在一起，以产生存在于肌肉组织中的长肌肉纤维。肌肉细胞是构成身体的三种类型的肌肉组织的特化细胞：心肌、骨骼肌和平滑肌。“肌肉干细胞”是存在于基底层下但在骨骼肌纤维的基底膜外的骨骼肌纤维之间的成体干细胞。由于肌肉干细胞位于肌肉纤维之外，因此被称为“卫星细胞”，其负责肌肉生长和响应于损伤进行终生修复。肌肉干细胞是一种异质性细胞群体，其特征是成对的盒转录因子Pax7的表达，这对肌肉干细胞的功能至关重要。激活后，肌肉干细胞增殖，然后分化，以用新纤维重新填充肌肉组织。

术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非具体限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNPs和互补序列，以及明确指出的序列。具体地，可以通过生成其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；以及Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA和由基因编码的mRNA互换使用。

术语“基因”意指参与产生多肽链的DNA片段。它可以包括编码区之前和之后的区域(前导和尾部)以及单个编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指结构具有不同于氨基酸的一般化学结构，但以类似于天然氨基酸的方式发挥功能的化合物。

本领域中存在各种已知的方法，其允许以位点特异性的方式将非天然氨基酸衍生物或类似物掺入多肽链中，参见例如WO 02/086075。

氨基酸在本文中可以通过通常已知的三个字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指代。同样，核苷酸也可以通过它们普遍接受的单字母代码来指代。

“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于特定的核酸序列，“保守修饰的变体”是指那些编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下，指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每个位置处，密码子可以被改变为所描述的任何相应的密码子，而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰变异的一种。本文中编码多肽的每一个核酸序列也描述了核酸的每一种可能的沉默变异。技术人员将认识到核酸中的每个密码子(除了AUG和TGG，AUG通常是蛋氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异都隐含在每种所描述的序列中。

关于氨基酸序列，技术人员将认识到，在编码序列中改变、添加或删除单个氨基酸或一小部分氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个取代、缺失或添加是一种“保守修饰变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学相似的氨基酸取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表在本领域是众所周知的。这种保守修饰的变体补充并且不排除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因。

以下八种基团各自包含彼此保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；以及

8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)。

(参见例如，Creighton,Proteins,W.H.Freeman和Co.,N.Y.(1984))。

氨基酸在本文中可以通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指代。同样，核苷酸可以通过它们普遍接受的单字母代码来指代。

在本申请中，氨基酸残基根据其在未修饰的野生型多肽序列中距编号为1的最左边的残基的相对位置进行编号。

“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指氨基酸残基的聚合物。所有这三个术语都适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基聚合物和非天然存在的氨酸聚合物。如本文所用，该术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。

术语“重组”当参考例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时，表示该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或者天然核酸或蛋白质的改变而被修饰，或者该细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中未发现的基因，或者表达在其他情况下异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。

“启动子”被定义为指导多核苷酸序列转录的核酸控制序列阵列。如本文所用，启动子包括转录起始位点附近的必要多核苷酸序列，如在聚合酶II型启动子的情况下，TATA元件。启动子还任选地包括远端增强剂或阻遏物元件，其可以位于距转录起始位点多达几千个碱基对的位置。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是仅在环境或发育调控下具有活性的启动子。术语“可操作连接”是指多核苷酸表达控制序列(如启动子或转录因子结合位点阵列)和第二多核苷酸序列之间的功能连接，其中所述表达控制序列指导对应于第二序列的多核苷酸序列的转录。

“表达盒”是一种核酸构建体，与一系列允许在宿主细胞中转录特定的多核酸序列的特定多核苷酸元件重组或合成产生。表达盒可以是质粒、病毒基因组(例如，病毒载体如腺病毒载体或腺相关病毒载体)或核酸片段的一部分。通常，表达盒包括待转录的多核苷酸，其可操作地连接到启动子和转录终止元件。

如在描述两个元件的相对位置的上下文中使用的术语“异源的”是指非天然存在于相同的相对位置中的两个元件，如多核苷酸序列(例如，启动子或蛋白质/多肽编码序列)或多肽序列(例如，作为融合蛋白内的融合伴侣的两种肽)。因此，基因的“异源启动子”是指不可天然与该基因操作性地连接的启动子。类似地，特定蛋白质或其编码序列的“异源多肽”或“异源多核苷酸”是来源于与该特定蛋白质不同的来源的那些，或者如果来源于相同的来源但不是以相同的方式与该特定蛋白或其编码序列天然连接。一种多肽(或其编码序列)与异源多肽(或多核苷酸序列)的融合不会导致可以在天然下发现的更长的多肽或多核苷酸顺序。

“宿主细胞”是含有表达载体并支持表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌(E.coli)，或者真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞如CHO、HeLa、肌肉细胞等，例如培养的细胞、外植体和体内细胞。

本文所用的术语“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指对靶标生物过程，如蛋白质磷酸化、细胞信号转导、蛋白质合成、细胞增殖、致瘤性和转移潜能等的任何可检测的负面影响。通常，抑制反应在当与对照相比时，靶标过程(例如，肌肉细胞中的CPEB4蛋白水平)的至少10％、20％、30％、40％或50％的减少中，或者上述任何一个下游参数。类似地，术语“增加(increasing)”或“增加(increase)”等用于描述对靶标生物过程的任何可检测的正面影响，例如肌肉细胞中的CPEB4蛋白水平，如与对照相比时，至少25％、50％、75％、100％或高达2、3、4、5或高达10或20倍的正面变化。

本文中使用的术语“有效量”是指足以产生物质给药的预期效果的量。该效果可以包括生物过程中的期望变化(例如，增加的CPEB4蛋白水平)，以及在任何可检测的程度上预防、纠正或抑制疾病/病况的症状和相关并发症的进展。对实现期望效果“有效”的确切量将取决于治疗剂的性质、给药方式和治疗目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,TheArt,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；以及Pickar,Dosage Calculations(1999))。

术语“约”表示预定值的+/-10％的范围。例如，“约10”设置了10的90％-110％的范围，即9-11。

具体实施方式

I.前言

SCs的蛋白质组景观在老化过程中发生了改变，显示出衰老的蛋白质组特征和维持基底干细胞细胞活性的功能下降，其中在老化过程中转录和翻译相关蛋白的表达被下调。从功能上讲，线粒体蛋白的一个子集在老化过程中下调，其中海马(Seahorse)线粒体活性测定揭示SCs的线粒体代谢受损。在本文所述的研究中，本发明人鉴定了CPEB蛋白家族的一个成员CPEB4，其在各种老化组织中的水平下降，并发挥功能以调节SCs中线粒体蛋白质组景观和活性。进一步的分析揭示，CPEB4与线粒体蛋白编码转录物结合，并与线粒体翻译机制相互作用，表明CPEB4参与了线粒体翻译的调节。此外，抑制线粒体活性会诱导细胞衰老，并且CPEB4的长期丧失会导致细胞衰老。恢复CPEB4的表达挽救了老化细胞中受损的线粒体代谢，并阻止了衰老表型。因此，提供了用于评估细胞衰老、老化细胞的重新年轻化和鉴定能够调节衰老的试剂的方法。

作为证明CPEB4的治疗益处的概念证明，用含有CPEB4表达序列的腺病毒感染的老化干细胞导致老化干细胞的重新年轻化。此外，将重新表达CPEB4的老化干细胞移植到老化小鼠的肌肉中，证明了CPEB4在植入后使老年SCs的干细胞功能重新年轻化的能力。CPEB4在老化过程中的丧失和老化细胞中CPEB4的恢复为治疗年龄相关病症提供了诊断生物标志物和治疗靶标。

II.一般重组技术

公开重组遗传学领域中的一般方法和技术的基础文本包括Sambrook和Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版2001)；Kriegler,Gene Transfer andExpression:A Laboratory Manual(1990)；以及Ausubel et al.,编辑,CurrentProtocols in Molecular Biology(1994)。

对于核酸，大小以千碱基(kb)或碱基对(bp)给出。这些是来源于琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、来源于测序的核酸或来源于已发表的DNA序列的估计值。对于蛋白质，大小以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数给出。从凝胶电泳、测序的蛋白质、来源的氨基酸序列或已发表的蛋白质序列来估计蛋白质大小。

不可商购获得的寡核苷酸可以化学合成，例如，根据Beaucage&Caruthers,Tetrahedron Lett.22:1859-1862(1981)首次描述的固相亚磷酰胺三酯法，使用自动合成器，如Van Devanter et.al.,Nucleic Acids Res.12:6159-6168(1984)中所述的。使用任何本领域认可的策略进行寡核苷酸的纯化，例如，如Pearson&Reanier,J.Chrom.255:137-149(1983)中所述的天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换HPLC。

可以在克隆或亚克隆后，使用例如Wallace et al.,Gene 16:21-26(1981)的用于双链模板测序的链终止方法验证目标基因、编码目标多肽的多核苷酸和合成寡核苷酸的序列。

III.组织样品的获取和CPEB4 mRNA的分析

本发明涉及测量在生物组织样品如肌肉样品中发现的CPEB4 mRNA的量，作为评估这些组织的干细胞中衰老水平的方式。因此，实施本发明的第一步是从测试对象获得合适的组织样品并从样品中提取mRNA。

A.组织样品的获取和制备

使用本发明的方法从待测试或监测组织/细胞衰老的人获得组织样品。根据医院或诊所通常遵循的标准方案，如在活检期间，从个体采集适当的组织样本。收集适量的组织，并可在进一步处理之前根据标准程序进行储存。

根据本发明，可以使用例如骨骼肌组织进行在患者的组织样品中发现的CPEB4mRNA的分析。制备用于核酸提取的组织样品的方法在本领域技术人员中是众所周知的。例如，应首先处理对象的组织样品以破坏细胞膜，从而释放细胞内包含的核酸。

B.RNA的提取和定量

有许多从生物样品中提取mRNA的方法。可以遵循mRNA制备的一般方法(例如，由Sambrook和Russell,Molecular Cloning:ALaboratory Manual第3版,2001描述的)；各种可商购获得的试剂或试剂盒，如Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)、Oligotex DirectmRNA试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)、RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)和

从RNA制剂中清除所有污染DNA是至关重要的。因此，在扩增和定量步骤中，应采用仔细的处理样品、用DNA酶彻底处理，以及适当的阴性对照。

1.mRNA水平的基于PCR的定量测定

一旦从样品中提取出mRNA，就可以定量人CPEB4 mRNA的量。用于测定mRNA水平的优选方法是基于扩增的方法，例如通过聚合酶链式反应(PCR)，特别是逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)。

在扩增步骤之前，必须合成人CPEB4 mRNA的DNA拷贝(cDNA)。这是通过逆转录实现的，逆转录可以作为一个单独的步骤进行，或者可以在同源逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)中进行，这是用于扩增RNA的聚合酶链式反应的一种修改。适用于核糖核酸的PCR扩增的方法由Romero和Rotbart，Diagnostic Molecular Biology:Principles andApplications第401-406页；Persing et al.,编辑,Mayo Foundation,Rochester,MN,1993；Egger et al.,J.Clin.Microbiol.33:1442-1447,1995；以及第5,075,212号美国专利描述。

PCR的一般方法在本领域中是众所周知的，并因此在本文中不进行详细描述。关于设计引物的PCR方法、方案和原理的综述，参见例如Innis,et al.,PCR Protocols:A Guideto Methods and Applications,Academic Press,Inc.N.Y.,1990。PCR试剂和方案也可从商业供应商处获得，如Roche Molecular Systems。

PCR最通常是用热稳定酶作为自动化过程进行的。在该过程中，反应混合物的温度自动循环通过变性区域、引物退火区域和延伸反应区域。专门适用于此目的的机器可商购获得。

尽管靶标mRNA的PCR扩增通常用于实践本发明。然而，本领域技术人员将认识到，可以通过任何已知的方法完成样品中mRNA物质的扩增，如连接酶链式反应(LCR)、转录介导的扩增和自维持序列复制或基于核酸序列的扩增(NASBA)，每种方法都提供足够的扩增。最近开发的分支DNA技术也可用于定量测定样品中mRNA物质的量。关于用于直接定量临床样品中核酸序列的分支DNA信号扩增的综述，参见Nolte,Adv.Clin.Chem.33:201-235,1998。

2.其他定量方法

也可以使用本领域技术人员熟知的其他标准技术检测CPEB4 mRNA。尽管检测步骤之前通常是扩增步骤，但在本发明的方法中不需要扩增。例如，无论前面是否有扩增步骤，都可以通过尺寸分级(例如，凝胶电泳)来鉴定mRNA。在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中运行样品并根据众所周知的技术(参见，例如，Sambrook和Russell，同上)用溴化乙锭标记后，与标准比较相同大小的条带的存在是靶标mRNA存在的指示，然后可以基于条带的强度将其量与对照进行比较。可选地，可以使用对CPEB4 mRNA特异性的寡核苷酸探针来检测这种mRNA物质的存在，并基于探针所赋予的信号强度，指示与标准比较相比的mRNA的量。

序列特异性探针杂交是检测包含其他种类核酸的特定核酸的公知方法。在足够严格的杂交条件下，探针仅与实质上互补的序列特异性杂交。杂交条件的严格性可以放宽以容忍不同量的序列错配。

本领域熟知的多种杂交形式，包括但不限于溶液相、固相或混合相杂交测定。以下文章提供了各种杂交测定形式的概述：Singer et al.,Biotechniques 4:230,1986；Haaseet al.,Methods in Virology,第189-226页,1984；Wilkinson,In situ Hybridization,Wilkinson编辑,IRL Press,Oxford University Press,Oxford；以及Hames和Higgins编辑,Nucleic Acid Hybridization:APractical Approach,IRL Press,1987。

根据众所周知的技术检测杂交复合物。可以通过几种通常用于检测杂交核酸存在的方法中的任何一种标记能够与靶标核酸，即mRNA或扩增的DNA特异性杂交的核酸探针。一种常见的检测方法是使用放射自显影，其使用

可以使用众所周知的技术合成和标记实施本发明所需的探针和引物。可以根据Beaucage和Caruthers,Tetrahedron Letts.,22:1859-1862,1981首次描述的固相亚磷酰胺三酯法，使用自动合成器化学合成用作探针和引物的寡核苷酸，如Needham-VanDevanteret al.,Nucleic Acids Res.12:6159-6168,1984中所述。是通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或通过阴离子交换HPLC进行寡核苷酸的纯化，如Pearson和Regnier,J.Chrom.,255:137-149,1983中所述。

IV.多肽的定量

A.获得样品

实施本发明的第一步是从正在测试、评估或监测衰老的对象获得目标组织(例如，骨骼肌)的样品。应从对照组(具有预定性别和实足年龄的健康个体)和测试组(例如，为评估其衰老和生物年龄而测试的对象)中采集相同类型的样本。如前一节中所述，为此目的，通常会遵循医院或诊所常规采用的标准程序。

为了评估测试对象中的生物年龄和衰老水平的目的，可以采集个体的组织样品，并可以测量人CPEB4蛋白的水平，然后与标准对照进行比较。如果当与对照组相比时，观察到人CPEB4蛋白水平下降，则认为测试对象在其采集进行评估的组织样品中有更多的衰老细胞，或者与对照对象相比，具有更高的生物年龄。为了监测或评估对象中的衰老水平，可以在不同的时间点采集单个对象的组织样品，从而可以测量人CPEB4蛋白的水平，以提供指示生物老化状态和衰老进展的信息。例如，当人的CPEB4蛋白(或mRNA)水平显示出随着时间的推移比对照对象中观察到的下降速度更快的总体趋势时，该人被认为比其相同实足年龄的同龄人老化更快或经历更快的衰老。另一方面，人的CPEB4蛋白(或mRNA)水平的下降速率缺少实质性变化将指示与其相同实足年龄的同龄人相比，患者中的老化过程或衰老水平相当。相反，当人的CPEB4蛋白(或mRNA)水平显示出随着时间的推移下降速率比在对照对象中观察到的下降速率慢的总体趋势时，该人被认为与其相同实足年龄的同龄人相比，老化更慢或以降低的速率经历衰老。通常，在患者中看到的较低的CPEB4蛋白(或mRNA)水平指示更晚期的衰老程度和更晚期的老化程度。这种比较在相似实足年龄的个体中是有意义的。

B.制备用于CPEB4蛋白检测的样品

来自适用于本发明的对象的组织样品可以通过公知的方法获得，并且如前一节中所述。在本发明的某些应用中，肌肉组织可以是用于CPEB4蛋白检测的优选样品类型。

C.确定人CPEB4蛋白的水平

任何特定特性的蛋白质，如CPEB4蛋白，可以使用各种免疫测定法进行检测。在一些实施方案中，可以通过用对多肽具有特异性结合亲和力的抗体从测试样品捕获多肽来进行夹心测定。然后可以用对多肽具有特异性结合亲和力的标记抗体检测多肽。可以使用微流体设备如微阵列蛋白质芯片进行这样的免疫测定。也可以通过凝胶电泳(如二维凝胶电泳)，然后使用特异性抗体进行蛋白质印迹分析来检测目标蛋白质(例如，人CPEB4蛋白)。可选地，标准免疫组织化学技术可以用于使用适当的抗体检测给定的蛋白质(例如，人CPEB4蛋白)。单克隆抗体和多克隆抗体(包括具有所需结合特异性的抗体片段)均可用于多肽的特异性检测。可以通过已知技术产生这种抗体及其对特定蛋白质(例如，人CPEB4蛋白)具有特异性结合亲和力的结合片段。

在实施本发明中，也可以采用其他方法来测量CPEB4蛋白的水平。例如，已经开发了基于质谱技术的各种方法来快速且准确地定量甚至大量样品中的靶标蛋白。这些方法涉及高度复杂的设备，如使用多重反应监测(MRM)技术的三重四极杆(triple Q)仪器、基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱仪(MALDI TOF/TOF)、使用选择性离子监测SIM)模式的离子捕获仪器和基于电喷雾电离(ESI)的QTOP质谱仪。参见例如，Pan et al.,J ProteomeRes.2009年2月；8(2):787–797。

V.确立标准对照

为了建立用于实施本发明方法的标准对照或比较基础，首先选择一组没有常规定义的任何已知疾病(尤其是与炎症或异常代谢有关的任何形式的疾病或病症)的健康人。为了使用本发明的方法评估衰老/老化的目的，这些个体在适当的参数范围内(如果适用的话)。任选地，这些个体与测试对象具有相同的性别、相似的年龄(例如，在预定年龄的+/-5或4、3或2岁或1岁以内)或相似的种族背景。

通过成熟的、常规采用的方法确认所选个体的健康状态，包括但不限于对个体的一般身体检查和对其医疗史的一般审查。

此外，所选择的健康个体组必须具有合理的大小，使得从该组获得的组织样品中人CPEB4 mRNA或CPEB4蛋白的平均量/浓度可以合理地被视为代表特定实足年龄的健康人的一般人群中的正常或平均水平。优选地，所选择的组包括至少10个人类对象。

一旦基于在所选健康对照组的每个对象中发现的单个值建立了CPEB4 mRNA或蛋白质的平均值，则将该平均值或中值或代表性值或特征视为标准对照。在相同的过程中也确定了标准偏差。在一些情况下，可以为具有不同特征如年龄、性别或种族背景的单独定义的组建立单独的标准对照。

VI.CPEB4增强剂和衰老抑制剂

通过说明CPEB4蛋白的表达抑制与细胞衰老增加的相关性，本发明进一步提供了一种使衰老细胞重新年轻化和治疗患有老化或衰老相关病况的患者的方式：通过增加细胞或相关组织中CPEB4蛋白的表达水平或生物活性。如本文所用，老化或衰老相关病况的治疗包括减少、逆转、减轻或消除此类病况的一种或多种症状，以及预防或延迟一种或多种相关症状的发作。另外，由于加速的老化过程的某些风险因素(使用烟草制品、过度饮酒、不健康的饮食习惯、缺乏体育锻炼、高压力的生活或工作环境等)是众所周知的，可以为有过早老化风险的患者制定预防措施，如减少或消除酒精和烟草消费，并采取健康饮食和积极生活方式。对于通过本发明的方法被认为具有增加的老化速率的个体，可以采用各种治疗策略来治疗这些患者中的过早老化，包括但不限于给予抗衰老药物、抗炎药物或有效增加或增强受影响细胞或组织中CPEB4的表达水平的试剂(例如，CPEB4的增强剂)，或者以上的任意组合。

A.增加CPEB4表达

1.编码CPEB4蛋白的核酸

可以通过使用编码功能性CPEB4蛋白的核酸来增强CPEB4基因表达。这样的核酸可以是在有利条件下翻译成CPEB4蛋白的活性形式的单链核酸(如mRNA)或双链核酸(如DNA)。

在一实施方案中，编码CPEB4的核酸以表达盒的形式提供，所述表达盒通常是重组产生的，具有可操作地连接到编码所述CPEB4蛋白的多核苷酸序列的启动子。在一些情况下，启动子是指导所有或大多数组织类型中的基因表达的通用启动子；在其他情况下，启动子是专门指导肌肉干细胞中的基因表达的启动子，例如Pax7启动子。给予这样的核酸可以增加CPEB4蛋白在靶标组织，例如，肌肉，尤其是骨骼肌中的表达。由于人CPEB4基因序列被称为GenBank登录号GeneID:80315，并且其cDNA序列在本文中被提供为SEQ ID NO:1，因此可以从这些序列的序列、物种同源物和变体中获得合适的编码CPEB4的核酸。

2.CPEB4蛋白

通过将有效量的活性CPEB4蛋白直接给予衰老细胞中或患有过早老化并表现出CPEB4蛋白质表达或活性被抑制的患者，细胞/组织或患者也可以得到有效治疗和重新年轻化。例如，这可以通过将具有其生物活性的重组产生的CPEB4蛋白递送到/给予受影响的细胞/组织或患者来实现。用于递送基于蛋白质或多肽的治疗剂的制剂和方法是本领域公知的。

3.CPEB4蛋白的活化剂

可以用能够激活CPEB4蛋白质表达或增强CPEB4蛋白活性的试剂来实现增加的CPEB4蛋白活性。例如，活化剂可能能够通过激活CPEB4基因的启动子区来激活该基因的表达。其他激活剂可以包括对CPEB4促进剂和/或增强剂特异性的转录激活剂。可以使用本文的实例中描述的CPEB4表达测定法来筛选和鉴定这样的激活剂。

相反，CPEB4在mRNA或蛋白质水平上表达的激动剂是CPEB4表达的另一种类型的激活剂。这种性质的激活剂，如激活抗体，可以通过增强CPEB4蛋白的生物活性来起作用，通常(但不一定)通过与CPEB1蛋白和/或其相互作用蛋白直接结合。这种激动剂的初步筛选可以从结合测定开始，以用于鉴定与CPEB4蛋白物理相互作用的分子。B.鉴定另外的CPEB4增强剂

能够调节(特别是增强)CPEB4表达的化合物实际上可以具有任何化学和结构性质：它们可以是大分子，如多肽、多核苷酸、脂质或小分子，包括无机化合物。只要它们对促进CPEB4表达具有已证实的积极作用，这些增强剂就可用于促进CPEB4表达，并因此可用于减少或逆转细胞衰老以及治疗与年龄相关的病况和病症。

CPEB4的调节物因其调节细胞衰老状态的能力而有用，可作为患有涉及因老化而丧失生物功能的疾病或病况的患者的抗老化疗法。用于确认调节物的这种调节效应的测定可以在体外或体内进行。体外测定通常涉及将培养的细胞(如肌肉细胞)暴露于候选化合物，并监测细胞中CPEB4水平或活性随后的变化。例如，在暴露于足够浓度的CPEB4的抑制剂或增强剂适当的持续时间后，通过免疫测定如蛋白质印迹和原位免疫染色等检查合适的细胞(如肌肉细胞或肌肉干细胞)的其CPEB4合成速率的任何潜在变化。与不存在化合物情况下细胞中的CPEB4蛋白水平相比，由于暴露于化合物而导致的CPEB4表达水平的正变化或增加表明该化合物作为CPEB4的增强剂的作用；相反，负变化或减少表明该化合物作为CPEB4的抑制剂的作用。例如，当观察到CPEB4水平降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高时，检测到抑制效应，而当观察到CPUB4水平增加至少50％、80％、100％或至少2倍、3倍、5倍、10倍、20倍或更大时，检测到增强效应。

CPEB4增强剂或抑制剂对CPEB4表达的增强或抑制效应也可以使用体内测定来证明。例如，提议为CPEB4抑制剂或增强剂的化合物可以被递送(例如，通过注射)到动物中，并且可以在给予该化合物之前和之后评估CPEB4的细胞水平。注射方法在性质上可以是皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内。随后可以通过各种方式监测CPEB4水平的变化和指示细胞衰老的其他特征，如用具有相似实足年龄/身体状况但未给予该化合物的对照组动物测量治疗动物的相关生物学功能。本公开的实施例章节提供了一些示例性体内测定的详细描述。当在测试组中确立衰老的减少或生物功能的保存/恢复的增加时，检测到增强效应。优选地，在功能保存方面，所述正效应是至少10％的增加，更优选地，所述增加是至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、500％或更高。

如上所述，CPEB4调节物可以具有不同的化学和结构特征。例如，抑制剂可以是保留CPEB4与其上游或下游效应分子的结合能力的非功能性CPEB4突变体、干扰CPEB4介导的活性的CPEB4的中和抗体，或者简单阻碍CPEB4与其上游或下游效应分子之间的相互作用的任何小分子或大分子。相反，增强剂可以是对CPEB4的上游或下游效应分子具有增加的结合能力的CPEB4变体，或者促进CPEB4与其上游或下游效应分子之间的相互作用的任何小分子或大分子。基本上任何化合物都可以作为CPEB4的潜在抑制剂或增强剂进行测试。最优选的通常是可以溶解在水性溶液或有机(特别是基于DMSO的)溶液中的化合物。抑制剂可以通过筛选含有许多潜在有效化合物的组合文库来鉴定。如本文所述，可以在一项或多项测定中筛选这样的组合化学文库，以鉴定那些表现出所需特征活性的文库成员(特定化学物质或亚类)。由此鉴定的化合物可以作为常规的“先导化合物”，或者可以本身用作潜在或实际的治疗剂。

组合化学文库的制备和筛选是本领域技术人员众所周知的。这种组合化学文库包括但不限于肽文库(参见例如，美国专利5,010,175、Furka,Int.J.Pept.Prot.Res.37:487-493(1991)和Houghton et al.,Nature354:84-88(1991))和碳水化合物文库(参见例如，Liang et al.,Science,274:1520-1522(1996)和美国专利5,593,853)。也可以使用用于产生化学多样性文库的其他化学物质。这样的化学物质包括但不限于：类肽(peptoids)(第WO91/19735号PCT公开)、编码的肽(PCT公开WO 93/20242)、随机生物寡聚物(第WO 92/00091号PCT公开)、苯二氮卓类(第5,288,514号美国专利)、潜入物(diversomers)如乙内酰脲类(hydantoins)、苯二氮卓类和二肽(Hobbs et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90:6909 6913(1993))、插烯(vinylogous)多肽(Hagihara et al.,J.Amer.Chem.Soc.114:6568(1992))、具有β-D-葡萄糖支架的非肽类肽模拟物(Hirschmann et al.,J.Amer.Chem.Soc.114:9217-9218(1992))、小化合物文库的类似有机合成(Chen et al.,J.Amer.Chem.Soc.116:2661(1994))、低聚氨基甲酸酯(Cho et al.,Science 261:1303(1993))和/或肽基膦酸酯(Campbell et al.,J.Org.Chem.59:658(1994))、核酸文库(参见Ausubel,Berger和Sambrook,均同上)、肽核酸文库(参见例如，美国专利5,539,083)、抗体文库(参见例如Vaughn et al.,Nature Biotechnology,14(3):309-314(1996)和PCT/US96/10287)、小有机分子文库(参见例如，苯二氮卓类，Baum C&EN,1月18日,第33页(1993)；类异戊二烯，美国专利5,569,588；噻唑啉酮(thiazolidinones)和间噻唑酮(metathiazanones)，美国专利5,549,974；吡咯烷类，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；以及苯二氮卓类，美国专利5,288,514)。

V.药物组合物和给药

本发明还提供了包含有效量的化合物的药物组合物或生理学组合物，所述化合物在用于使老化细胞、组织或生物体重新年轻化的预防和治疗应用中增强CPEB4表达，如编码活性CPEB4蛋白的核酸、小化学物质、肽、蛋白质、大分子等。这样的药物或生理学组合物还包括一种或多种药物或生理学可接受的赋形剂或载体。本发明的药物组合物适用于各种药物递送系统。用于本发明的合适制剂可在Remington's Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Company,Philadelphia,PA,第17版(1985)中找到。关于药物递送方法的简要综述，参见例如，Langer,Science 249:1527-1533(1990)。

本发明的药物组合物可以通过各种途径给药，例如经口、皮下、透皮、肌肉内、静脉内或腹膜内。给予药物组合物的优选途径是对于70kg的成人，以每天约0.01-2500mg，优选2.5-500mg或10-100mg的CPEB4增强剂的每日剂量局部递送至患有涉及过早老化的病况的患者中的相关器官或组织。可以以单一的每日剂量或作为以适当的间隔呈现的分剂量给予适当的剂量，例如作为每天两剂、三剂、四剂或更多剂子剂量。

使用了制备含有CPEB4增强剂和一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物。药物载体可以是固体或液体。固体形式的制剂包括例如，粉末、片剂、分散颗粒、胶囊、扁囊剂和栓剂。固体载体可以是一种或多种物质，其也可以用作稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂或片剂崩解剂；它也可以是封装材料。

在粉末中，载体通常是与细碎活性组分的混合物中的细碎固体，例如米哚妥林(midostaurin)、阿西替尼、博苏替尼或鲁索替尼。在片剂中，将活性成分(例如，CPEB4的增强剂)与具有必要结合特性的载体以合适的比例混合，并压实成所需的形状和尺寸。

为了制备栓剂形式的药物组合物，首先将低熔点蜡如脂肪酸甘油酯和可可脂的混合物熔化，并通过例如搅拌将活性成分分散在其中。然后将熔融的均质混合物倒入尺寸合适的模具中，并允许其冷却和固化。

粉末和片剂优选按重量计含有约5％至约70％的CPEB4的增强剂的活性成分。合适的载体包括例如，碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、乳糖、糖、果胶、糊精、淀粉、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。

药物组合物可以包括CPEB4增强剂的活性化合物的制剂，其具有作为载体的包封材料，提供其中抑制剂(具有或不具有其他载体)被载体包围的胶囊，使得载体因此与化合物结合。以类似的方式，也可以包括扁囊剂。片剂、粉末、扁囊剂和胶囊可用作适合于经口给药的固体剂型。

液体药物组合物包括例如适用于经口或肠胃外给药的溶液、适用于经口给药的悬浮液和乳液。活性组分(例如，CPEB4增强剂)的无菌水溶液或活性组分在包括水、缓冲水、盐水、PBS、乙醇或丙二醇的溶剂中的无菌溶液是适用于胃肠外给药的液体组合物的实例。所述组合物可包含接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、洗涤剂等。

可以通过将活性组分(例如，CPEB4增强剂)溶解在所需的溶剂系统中，然后使所得溶液通过膜过滤器以对其进行灭菌，或者可选地，通过在无菌条件下将无菌化合物溶解在先前灭菌的溶剂中来制备无菌溶液。所得的水性溶液可按原样包装使用，或者冻干，冻干的制剂在给药前与无菌水性载体合并。制剂的pH通常为3-11，更优选5-9，且最优选7-8。

可给予含有CPEB4增强剂的药物组合物，以用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗应用中，将组合物以足以预防、治愈、逆转或至少部分减缓或阻止病况的症状及其并发症，如疾病的发作、进展、持续时间和严重程度的量给予已经患有涉及老化过程或因老化过程而加剧的病况的患者。足以达到这一目的的量被定义为“治疗有效剂量”。对于这一应用有效的量将取决于疾病或病况的严重程度以及患者的体重和一般状态，但对于70kg的患者，范围通常为每天约0.1mg至约2,500mg的CPEB4增强剂，对于70kg的患者，更常用的剂量为每天约2.5mg至约500mg的CPEB4增强剂。

在预防性应用中，将含有CPEB4增强剂的药物组合物以足以延缓或防止症状发作的量给予易感或在其他情况下有发展涉及老化过程或因老化过程而加重的疾病风险的患者。这样的量被定义为“预防有效剂量”。在这种使用中，CPEB4增强剂的精确量再次取决于患者的健康状态和体重，但对于70kg的患者，范围通常为每天约0.1mg至约2,500mg的CPEB4增强剂，对于70kg患者，更通常为每天约2.5mg至约500mg。

可以以由治疗医生选择的剂量水平和模式进行组合物的单次或多次给药。在任何事件中，药物制剂应提供一定量的CPEB4增强剂，该增强剂足以有效地促进CPEB4在患者中的表达，无论是治疗性的还是预防性的。

VI.使用核酸的治疗应用

可以通过治疗方法来治疗各种病况，所述治疗方法涉及将编码CPEB4的多肽增强剂的核酸引入细胞中，使得编码序列被转录并且在细胞中产生多肽增强剂。关于基因治疗在治疗遗传性疾病以及获得性疾病方面的应用的讨论，参见Miller Nature 357:455-460(1992)；以及Mulligan Science 260:926-932(1993)。

A.用于基因递送的载体

为了递送到细胞或生物体，可以将编码增强CPEB4表达的多肽(包括活性形式或CPEB4蛋白本身)的多核苷酸掺入载体中。用于这种目的的载体的实例包括能够指导核酸在靶细胞中表达的表达质粒。在其他情况下，载体是病毒载体系统，其中多核苷酸被掺入病毒基因组中。携带这种多核苷酸的病毒能够转染靶细胞。在一实施方案中，编码多核苷酸可以与表达和控制序列可操作地连接，所述表达和控制序列可以指导多肽或寡核苷酸在所需靶细胞中的表达。因此，可以在适当的条件下在靶细胞中实现多肽增强剂的表达；例如，肌肉干细胞特异性启动子(例如，Pax7启动子)可用于表达载体中，以指导CPEB4蛋白在卫星细胞中的表达。

B.基因递送系统

可用于表达CPEB4的多肽增强剂的病毒载体系统包括例如，天然存在的或重组的病毒载体系统。取决于特定的应用，合适的病毒载体包括有复制能力的、有复制缺陷的和条件性复制的病毒载体。例如，病毒载体可以来源于人或牛腺病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、腺相关病毒、小鼠细小病毒(MVM)、HIV、辛德比斯病毒和逆转录病毒(包括但不限于劳氏肉瘤病毒和慢病毒)以及MoMLV的基因组。通常，将目标编码序列(例如，编码本发明的多肽CPEB4增强剂的序列)插入这样的载体中，以允许包装基因构建体，通常与伴随的病毒DNA一起，随后感染靶向宿主细胞并表达目标编码序列(例如，编码CPEB4蛋白的活性形式的序列)。

如本文所用，“基因递送系统”是指将本发明的多核苷酸序列递送到靶细胞的任何方式。在本发明的一些实施方案中，核酸与细胞受体配体缀合，以通过适当的连接部分如DNA连接部分(例如，包被凹坑的内陷和内体的内化)(Wu et al.,J.Biol.Chem.263:14621-14624(1988)；WO 92/06180)，或者通过超声微泡递送系统(Lan HY et al.,J.AmSoc.Nephrol.14:1535-1548)促进摄取。例如，核酸可包含Pax7启动子，其是特异性驱动肌肉干细胞中蛋白质表达的启动子。

类似地，可以通过添加受体配体或对受体特异性的抗体来修饰用于包装包括本发明核酸的基因构建体的病毒包膜，以允许至特定细胞中的受体介导的内吞(参见例如，WO93/20221、WO 93/14188和WO94/06923)。在本发明的一些实施方案中，本发明的DNA构建体连接到病毒蛋白，如腺病毒颗粒，以促进内吞作用(Curiel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:8850-8854(1991))。在其他实施方案中，本发明的抑制剂可以包括微管抑制剂(WO/9406922)、模拟流感病毒血凝素的合成肽(Plank et al.,J.Biol.Chem.269:12918-12924(1994))和核定位信号如SV40 T抗原(WO93/19768)。

逆转录病毒载体也可用于将本发明的多肽CPEB4增强剂的编码序列引入靶细胞、组织或生物体(例如，肌肉、心脏、肝脏、上皮和胃肠道，尤其是小肠中)。通过基因操纵逆转录病毒产生逆转录病毒载体。逆转录病毒的病毒基因组是RNA。在感染时，该基因组RNA被逆转录成DNA拷贝，该DNA拷贝以高度的稳定性和效率整合到转导细胞的染色体DNA中。整合的DNA拷贝被称为原病毒，并且与任何其他基因一样由子细胞遗传。野生型逆转录病毒基因组和原病毒DNA有三个基因：gag、pol和env基因，其两侧有两个长末端重复(LTR)序列。gag基因编码内部结构(核衣壳)蛋白；pol基因编码RNA引导的DNA聚合酶(逆转录酶)；并且env基因编码病毒包膜糖蛋白。5’和3’LTRs用于促进病毒粒子RNAs的转录和聚腺苷酸化。与5’LTR相邻的是基因组的逆转录(tRNA引物结合位点)和将病毒RNA有效封装到颗粒中(Psi位点)所需的序列(参见Mulligan,Experimental Manipulation of Gene Expression,Inouye(编辑),155-173(1983)；Mann et al.,Cell 33:153-159(1983)；Cone和Mulligan,Proceedings of the National Academy of Sciences,U.S.A.,81:6349-6353(1984))。

逆转录病毒载体的设计是本领域普通技术人员所熟知的。简言之，如果病毒基因组中缺少封装(或将逆转录病毒RNA包装到感染性病毒粒子中)所需的序列，则结果会是顺式作用缺陷，其阻止基因组RNA的封装。然而，所产生的突变体仍然能够指导所有病毒粒子蛋白的合成。从中删除了这些序列的逆转录病毒基因组，以及含有稳定整合到染色体中的突变基因组的细胞系是本领域公知的，并用于构建逆转录病毒载体。逆转录病毒载体的制备及其用途在许多出版物中有描述，包括例如，欧洲专利申请EPA 0 178 220；美国专利4,405,712；Gilboa Biotechniques4:504-512(1986)；Mann et al.,Cell 33:153-159(1983)；Cone和Mulligan Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6349-6353(1984)；Eglitis etal.Biotechniques6:608-614(1988)；Miller et al.Biotechniques 7:981-990(1989)；Miller(1992)同上；Mulligan(1993),同上；以及WO 92/07943。

逆转录病毒载体颗粒是通过将所需核苷酸序列重组插入逆转录病毒载体中，并通过使用包装细胞系用逆转录病毒衣壳蛋白包装载体而制备的。所得到的逆转录病毒载体颗粒不能在宿主细胞中复制，但能够作为含有所需核苷酸序列的原病毒序列整合到宿主细胞基因组中。结果，患者能够产生例如本发明的多肽CPEB4增强剂，并因此这可以使靶细胞(例如，肌肉细胞)恢复回到正常表型，例如重新年轻化的细胞或组织，其具有减少的衰老体征，生物功能得到保留或恢复。

用于产生逆转录病毒载体颗粒的包装细胞系通常是哺乳动物组织培养细胞系，其能够高水平表达蛋白质。另一方面，所使用的有缺陷的逆转录病毒载体缺乏这些结构基因，但编码包装所需的剩余蛋白质。为了制备包装细胞系，可以构建所需逆转录病毒的感染性克隆，其中包装位点已被删除。包含该构建体的细胞将表达所有结构病毒蛋白，但引入的DNA将无法被包装。可选地，可以通过用一种或多种编码适当核心和包膜蛋白的表达质粒转化细胞系来产生包装细胞系。在这些细胞中，gag、pol和env基因可以来源于相同或不同的逆转录病毒。

在现有技术中也可获得许多适用于本发明的包装细胞系。这些细胞系的实例包括Crip、GPE86、PA317和PG13(参见Miller et al.,J.Virol.65:2220-2224(1991))。其他包装细胞系的实例描述于Cone和Mulligan Proceedings of the National Academy ofSciences,USA,81:6349-6353(1984)；Danos和Mulligan Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,USA,85:6460-6464(1988)；Eglitis et al.(1988),同上；以及Miller(1990),同上中。

可以使用能够产生具有嵌合包膜蛋白的逆转录病毒载体颗粒的包装细胞系。可选地，双嗜性或异嗜性包膜蛋白，如由PA317和GPX包装细胞系产生的那些，可以用于包装逆转录病毒载体。

C.药物制剂

当用于药物目的时，编码多肽CPEB4增强剂的核酸通常配制于合适的缓冲液中，该缓冲液可以是任何药学上可接受的缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水或磷酸钠/硫酸钠、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水，以及普通技术人员已知的其它缓冲液，如Good etal.Biochemistry 5:467(1966)所描述的那些缓冲液。

组合物可以另外包括稳定剂、增强剂或其他药学上可接受的载体或媒介物。药学上可接受的载体可以包含生理学可接受的化合物，其例如起到稳定本发明核酸和任何相关载体的作用。生理学可接受的化合物可以包括例如碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或右旋糖酐、抗氧化剂，如抗坏血酸或谷胱甘肽、螯合剂、低分子量蛋白质或其他稳定剂或赋形剂。其他生理学可接受的化合物包括润湿剂、乳化剂、分散剂或防腐剂，它们对防止微生物生长特别有用。各种防腐剂是众所周知的，并且包括例如苯酚和抗坏血酸。载体、稳定剂或佐剂的实例可在Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,PA,第17版(1985)中找到。

D.制剂的给药

含有编码多肽CPEB4增强剂的多核苷酸序列的制剂可以使用普通技术人员已知的任何递送方法递送到靶标组织或器官。在本发明的一些实施方案中，编码多核苷酸序列被配制用于皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内注射，或者用于口服，或者用于局部施用。

含有编码本发明增强剂的核酸的制剂通常被给予细胞。细胞可以作为组织的一部分存在，如作为骨骼肌系统的一部分的肌肉细胞或肌肉干细胞，或者作为分离的细胞，如在组织培养中。细胞可以在体内、离体或体外提供。

制剂可以通过各种方法在体内或离体引入目标组织中。在本发明的一些实施方案中，通过诸如显微注射、磷酸钙沉淀、脂质体融合、超声、电穿孔或基因枪法等方法将本发明的核酸引入细胞中。在其他实施方案中，核酸直接被目标组织吸收，例如，当靶向细胞是红细胞时，静脉内注射是合适的。

在本发明的一些实施方案中，将本发明的核酸离体给予从患者移植的细胞或组织，然后返回患者。治疗性基因构建体的离体给药的实例包括Nolta et al.,ProcNatl.Acad.Sci.USA93(6):2414-9(1996)；Koc etal.,Seminars in Oncology 23(1):46-65(1996)；Raper et al.,Annals of Surgery223(2):116-26(1996)；Dalesandro et al.,J.Thorac.Cardi.Surg.,11(2):416-22(1996)；以及Makarov et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1):402-6(1996)。

制剂的有效剂量将取决于许多不同的因素，包括给药方式、靶点、患者的生理状态和给药的其他药物而变化。因此，需要对治疗剂量进行滴定，以优化安全性和疗效。在确定要给药的载体的有效量时，医生应该评估所使用的特定核酸、患者的疾病状态；患者的年龄、体重和总体状况循环血浆水平、载体毒性、疾病进展以及抗载体抗体的产生。剂量也将由伴随特定载体给药的任何不良副作用的存在、性质和程度决定。为了实施本发明，CPEB4增强剂的剂量范围通常为每个患者约0.1μg-100mg。剂量范围通常在每千克体重约0.01至约100μg，优选约0.1至约50μg/kg体重或每次注射约10

VII.试剂盒

本发明还提供了用于根据本发明的方法，逆转细胞衰老并因此用于治疗与年龄相关的病况的试剂盒。试剂盒通常包括容器，所述容器包含：(1)具有有效量的CPEB4的增强剂(例如，CPEB4蛋白的活性形式或编码CPEB4蛋白的活性形式的表达载体)的药物组合物，以及(2)包含关于如何分配药物组合物的说明的信息材料，包括可以治疗的患者类型的描述(例如，患有一种或多种与年龄相关的疾病或病况的人类患者)、给药的时间表(例如，剂量和频率)和给药途径等。在一些情况下，将第二容器包括在试剂盒中，以提供包含有效量的第二抗老化治疗剂的第二药物组合物。

实施例

以下实施例仅通过说明的方式提供，并且不是通过限制的方式提供。本领域技术人员将容易认识到可以改变或修改以产生基本上相似结果的各种非关键参数。

概要

干细胞功能的年龄相关损伤与组织损伤后或疾病期间体细胞组织再生能力的下降相关。细胞代谢在老化过程中发生改变，并因此可以利用改善代谢缺陷的干预措施来使老化细胞重新年轻化。本文提供的组合物和方法用于说明老化过程中蛋白质组景观的整体改变；测定老化细胞中线粒体代谢的缺陷；基于各种老化组织中CPEB4水平降低诊断老化相关的病症；以及通过恢复CPEB4表达以逆转衰老来使老化的细胞重新年轻化。

引言

线粒体功能和干细胞老化

线粒体活性在干细胞命运和功能的调节中很重要，无论其是在健康组织中还是在老化和疾病期间(Ansóet al.,2017；Bhattacharya和Scimè,2020；Khacho et al.,2016；Lisowski et al.,2018；Mohrin et al.,2015；Papa et al.,2019)。线粒体是能量收获的主要细胞器，但也具有信号传导功能，是应激诱导的逆行信号的来源，如活性氧物质(ROS)，它可以影响其他细胞位点，并且已知会影响干细胞功能(Butow和Avadhani,2004；Chandel,2014；Guha et al.,2014；Li et al.,2017)。ROS在老化过程中在SCs中积累，其耗竭导致老年SCs的重新年轻化(García-Prat et al.,2016)。线粒体还划分了数个关键的代谢通路，如三羧酸(TCA)循环、脂肪酸β-氧化，从这些通路中代谢产物也作为逆行信号发挥作用(Chandel et al.,2016；Martínez-Reyes et al.,2016；Ryall et al.,2015；Teperino etal.,2010；Zhang et al.,2016)。由于线粒体在调节干细胞活性中发挥重要作用，已在各种组织中报道了线粒体功能的年龄依赖性下降(Ahlqvist et al.,2015；Chistiakov etal.,2014；Cho et al.,2011；Haas,2019；Payne和Chinnery,2015；Stoll et al.,2011；Sunet al.,2016)。在本文中，我们揭示了SCs的线粒体蛋白质组景观在SC老化过程中发生了改变。此外，在老年SCs中，在OCR和ATP产生方面的线粒体活性显著下降。总之，其他人和我们的工作提供了通过调节线粒体功能或将年轻的线粒体移植到其他组织或其他干细胞中来潜在地治疗与年龄相关的疾病或逆转衰老的证据。

CPEB4功能和线粒体代谢调节

CPEB4通过靶向相应的转录物来调节特定的细胞功能(Calderone et al.,2016；Cao et al.,2018；Lu et al.,2017a；Parras et al.,2018)。众所周知，CPEB蛋白家族通过结合转录物的细胞质聚腺苷酸化来调节翻译(Fernández-Miranda和Méndez,2012；Richter,2007)。例如，CPEB4与CPEB1合作，以通过靶向编码细胞周期相关蛋白的转录物来调节肿瘤进展和有丝分裂(Novoa et al.,2010)。此外，CPEB4参与神经元疾病或神经发育(Huang et al.,2006；Shin et al.,2016)，其中CPEB4的突变与自闭症样疾病相关(Parraset al.,2018)。此外，CPEB4诱导糖酵解并激活肝星状细胞，以通过增加PFKFB3的表达来促进肝纤维化(Mejias et al.,2020)。此外，CPEB4调节线粒体脂肪酸氧化和内质网(ER)相关蛋白的表达，以防止老化过程中肝脏中的脂质积聚(Maillo et al.,2017)。

在本文中，我们揭示了CPEB4参与线粒体蛋白质组和活性的调节。从机制上讲，我们在SCs中鉴定了CPEB4的全转录组靶标，并发现许多与CPEB4结合的转录物是线粒体蛋白编码的转录物。CPEB4相关基因主要在线粒体代谢相关通路中富集。此外，我们的CPEB4和Tomm20共免疫染色的超分辨率SIM图像显示，CPEB4蛋白的一部分位于线粒体内。此外，我们的CPEB4抗体IP-质谱实验确定了CPEB4的相互作用伴侣。令人惊讶的是，CPEB4与线粒体翻译机制相互作用。这些观察结果为CPEB4如何通过独立于细胞质聚腺苷酸化而直接结合翻译机制来调节翻译提供了一个新的视角。详细的机制值得进一步研究。另外，编码转录物的线粒体蛋白的翻译位置也是一个备受争议的话题。除了在细胞质核糖体中的翻译外，编码mRNAs的线粒体蛋白被证明通过线粒体翻译机制转运到线粒体中进行翻译(D’Souza和Minczuk,2018；Eliyahu et al.,2010；Lesnik et al.,2015；Popow et al.,2015)。这里，我们的数据提出了一种可能性，即RNA结合蛋白CPEB4可能作为线粒体蛋白编码转录物的转运蛋白，以用于靶向线粒体翻译机制。

CPEB4和干细胞老化

CPEB4对老化过程中的组织稳态至关重要。例如，CPEB4是适应高脂肪饮食诱导和老化诱导的ER应激以及随后的肝脂肪变性(hepatosteatosis)所必需的(Maillo et al.,2017)。在本文中，我们对CPEB4cKO SCs的蛋白质组景观分析揭示，CPEB4的丧失诱导了衰老相关蛋白的表达。CPEB4在老年SCs中的重新表达改善了老年SCs的功能，包括线粒体代谢、SC激活、肌肉再生和自我更新。这些数据表明，CPEB4是防止干细胞老化的关键参与者，并在线粒体活性和干细胞老化之间提供了联系。此外，CPEB4缺失导致从线粒体产生的细胞ROS的积累(Hu etal.,2018)。ROS的耗竭使老年SCs重新年轻化(García-Prat et al.,2016)。我们观察到，老年SCs和CPEB4 cKO SCs中上调的蛋白质在“氧化应激诱导的衰老”通路中富集。此外，恢复CPEB4的表达使老年SCs重新年轻化。因此，CPEB4还提供了通过防止ROS积累来调节SC老化的潜在机制。

结果

实施例1.老年SCs显示细胞衰老

与先前的研究一致(García-Prat et al.,2016；Sousa-Victor et al.,2014)，我们发现来自非常老的小鼠(>24个月，老年小鼠)的SCs具有的激活和肌肉再生能力降低。当与成年SCs(从3～6个月的成年小鼠分离)相比时，Myod1

为了揭示SCs如何在老化过程中失去激活和肌肉修复能力的机制，我们进行了质谱分析，并通过无标记的定量方法对蛋白质表达进行了定量(图1的a)。主成分分析(PCA)显示，成年、老化和老年SCs彼此不同，但它们相应的生物复制紧密聚集，表明蛋白质组学方法的一致再现性(图1的b)。从全蛋白质组方面来看，老年SCs与成年SCs相距更远，而老化SCs位于成年和老年SCs之间，这表明蛋白质组景观在老化过程中逐渐变化(图6的a)。SC特异性蛋白如Numb、Calcr和Pax7在老化过程中被下调(图1的c，通过免疫染色评估的Pax7蛋白的表达水平，如图6的b、图6的c中所示)。自噬在老年SCs中也受到损害(García-Prat et al.,2016)，自噬相关蛋白的表达下降证明了这一点(图1的d)。过去的研究报道，SC龛在老化过程中随着Notch信号传导相关蛋白水平的降低而改变(Liu et al.,2018)。实际上，我们观察到Notch和Wnt信号传导相关组分的水平降低(图1)。有趣的是，我们还揭示了衰老相关蛋白仅在老年SCs中表达(图1的f)。此外，我们发现剪接体相关蛋白在老年SCs中已经下调，而核糖体相关蛋白仅在老年SCs中显著减少(图6的d、图6的e)，这表明在老化过程中转录和翻译机制逐渐出现功能障碍。总之，我们的蛋白质组景观表明，SC在老年小鼠中进入衰老，转录和翻译能力下降。

通过对成年、老化和老年SCs的逐对比较，我们鉴定了老化过程中各种通路的差异表达蛋白。与成年SCs相比，翻译相关通路如“游离40S亚基库的形成”在老年SCs中富集，而转录相关通路如“mRNA剪接”在成年SCs中富集(图6的f)。与成年SCs相比，老年SCs中上调的蛋白质与衰老通路有关，而下调的蛋白质与转录和翻译有关(图6的g)。我们发现衰老通路在老年SCs中富集，而翻译相关通路在老化SCs中富集(图6的h)。这表明老化SCs可以通过促进蛋白质翻译来补偿降低的转录能力。此外，我们还观察到，当与成年SCs相比时，无义介导的衰变(NMD)通路在老年SCs中富集，并且与老年SCs相比，在成年SCs中也相对更富集，这表明其丧失导致功能失调的蛋白质聚集的NMD在老化SCs中增强，但在老年SCs中缺失(图6的f至图6的h)。总之，我们的蛋白质组景观表明，SCs在进入不可逆衰老之前具有减少老化缺陷的能力。

实施例2.老年SCs中的线粒体缺陷

有趣的是，我们观察到能量代谢通路在老化过程中失调。氧化磷酸化和糖酵解相关蛋白在老化过程中减少(图7的a)。线粒体是能量代谢的中心，因此为了研究线粒体蛋白，我们比较了在老化过程中成年、老化和老年SCs之间的差异表达蛋白。133种线粒体蛋白在老年SCs中下调(图1的g和图7的b)，并且在与线粒体翻译和能量代谢相关的通路中富集(图1的h)。为了检查线粒体活性在老化过程中是否受到影响，我们进行了活细胞流量分析。与蛋白质组学变化一致，我们观察到基础和最大耗氧率(OCR)显著降低，而细胞外酸化率(ECAR)保持不变(图1的i、图1的j和图7的c)。我们还发现，在老年SCs中线粒体ATP生成减少(图7的d)。总之，我们的数据表明，老年SCs中的线粒体蛋白质组和活性受损。

实施例3：CPEB4在老化过程中丧失并调节SC功能

为了研究老化过程中蛋白质组变化背后的机制，我们聚焦于CPEB蛋白家族，其通过翻译控制来调节各种细胞功能，包括癌症发展、细胞周期调节、干细胞分化和组织内稳态。我们观察到，在诸如骨骼肌、心肌、肝和小肠等组织中，CPEB1-3 mRNA的表达水平在很大程度上保持不变，而CPEB4 mRNA水平在老化过程中显著降低(图2的a)。接下来，我们通过对成年和老年SCs中的CPEB4进行免疫染色来检测SC老化过程中的CPEB4蛋白表达，并发现CPEB4蛋白在老化过程中丧失(图2的b、图2的c和图8的a、图8的b)。

为了研究CPEB4在SC功能中的作用，我们利用了功能缺失siRNA介导的方法。免疫染色结果显示CPEB4蛋白在SC激活期间上调(图9的a、图9的b)。敲低CPEB4导致SC激活的延迟，如通过EdU

除了siRNA方法外，我们还使用CPEB4条件敲除(cKO)小鼠研究了CPEB4的功能。与CPEB4 siRNA敲低数据一致，CPEB4 cKO SCs也显示出延迟激活(图2的d至图2的f)。未损伤的TA肌肉切片的染色显示CPEB4 WT和cKO小鼠之间的纤维大小相当(图8的c至图8的e)。Pax7

实施例4：CPEB4保持线粒体功能

关于CPEB4在SC功能中起什么作用，我们分析了CPEB4cKO SCs的蛋白质组景观(在他莫昔芬诱导敲除CPEB4两周后)(图3的a)。从全蛋白质组的角度来看，SCs在CPEB4 WT对照和CPEB4 cKO SCs之间是遥远的(图3的b)。我们发现CPEB4 cKO SCs中上调的蛋白质与翻译相关，而下调的蛋白质与转录、TCA循环、线粒体生物发生和线粒体呼吸的调节有关(图10的a至图10的c)，表明CPEB4调节线粒体能量代谢。为了确定CPEB4缺失是否影响线粒体蛋白质组景观，我们将差异表达的蛋白质与线粒体蛋白质组数据进行了比较。我们在CPEB4 cKOSCs中鉴定了55种下调的线粒体蛋白，包括电子传递链蛋白(图3的c和图10的d)。功能富集分析显示，这些下调的线粒体蛋白在TCA循环和呼吸电子传递中富集(图10的e)，这与观察到的线粒体活性缺陷相关(图3的d、图3的e和图10的f至图10的h)。我们还注意到，在使用JC-1测定敲低CPEB4后，活性线粒体数量减少(线粒体去极化通过红/绿荧光强度比的降低来指示)(图11的a至图11的e)。总之，我们显示CPEB4是线粒体活性维持所必需的。

CPEB4是一种RNA结合蛋白，通过其结合转录物的细胞质聚腺苷酸化来调节翻译。为了鉴定SCs中的全局CPEB4靶向转录物，我们进行了CPEB4抗体免疫沉淀，然后进行RNA分离和测序(RIP-seq)(图12的a)。我们发现CPEB4与许多编码线粒体蛋白如Cox8a的转录物结合(图12的b)。Reactome本体论分析揭示，在“NMD”、“翻译”、“复合体I生物发生”和“TCA循环”中富集的CPEB4相关基因与CPEB4缺失后的蛋白质组景观变化相关(图12的c)。有趣的是，KEGG分析显示，CPEB4相关基因在“冠状病毒疾病”和老年相关疾病如帕金森病和阿尔茨海默病中富集(图12的d)。此外，SCs上的超分辨率结构光照明显微镜(SIM)显示一些CPEB4蛋白确实在线粒体中(图13的a)。为了检查CPEB4是否与线粒体翻译机制相关，我们进行了CPEB4抗体免疫沉淀，然后进行质谱分析(图13的b)。我们鉴定了368种CPEB4结合蛋白(图13的c)，它们是线粒体核糖体或含线粒体蛋白的复合物的组分(图13的d)。功能蛋白网络分析揭示，CPEB4相互作用蛋白聚集成4类，而簇1中的蛋白是线粒体翻译延伸或终止相关蛋白(图13的e、图13的f)。总之，CPEB4是线粒体翻译的关键参与者，靶向编码线粒体蛋白的基因并与线粒体翻译机制相互作用。

实施例5：CPEB4的长期丧失诱导衰老

我们观察到SCs中短期的CPEB4缺失(CPEB4敲除诱导后两周)会导致线粒体缺陷，这也反映在老年SCs中。此外，CPEB4在老化过程中丧失，并且老年SCs表现出衰老相关的蛋白质组学特征。最重要的是，其他研究和我们的数据表明，抑制线粒体代谢导致细胞衰老(图3的f、图3的g和图14)。因此，我们假设CPEB4的长期丧失会诱导衰老。为了验证这一假设，我们对CPEB4长期丧失SCs进行了质谱分析(图3的h，在诱导CPEB4缺失后3个月，小鼠的年龄为6个月)。从全蛋白质组方面来看，SCs在CPEB4 WT和cKO SCs之间是遥远的(图3的i)。不出所料，我们发现CPEB4 cKO SCs中上调的蛋白质在衰老相关通路中富集，如“氧化应激诱导的衰老”和“DNA损伤/端粒应激诱导的衰老”(图3的j、图3的k)。我们还观察到在CPEB4缺失后下调的蛋白质是RNA代谢或稳定性调节和氨基酸代谢或翻译相关的(图15的a、图15的c)。此外，我们发现165种线粒体蛋白在TCA循环和线粒体复合体I生物发生中被下调、富集，而在CPEB4缺失后只有16种线粒体蛋白被上调(图15的b、图15的d至图15的f)。总之，我们证明了CPEB4的长期丧失会导致线粒体蛋白质组景观严重受损，并诱导衰老相关的蛋白质组学特征。

实施例6：通过CPEB4逆转衰老

为了检查恢复CPEB4表达是否使老年SCs重新年轻化，我们用含有CPEB4编码序列的腺病毒感染老年SCs(图4的a)。质谱数据揭示，蛋白质组景观在对照和CPEB4过表达SCs之间是不同的(图4的b)。差异表达蛋白质的Reactome本体论分析显示，上调的蛋白质在细胞周期相关通路如有丝分裂后期中富集，而下调的蛋白质在DNA损伤/端粒应激诱导的衰老通路中富集(图16的a至图16的c、图16的g)。这一观察结果与我们的数据一致，表明CPEB4的丧失影响增殖并诱导衰老。令人惊讶的是，在CPEB4过表达后通过RNA测序鉴定的差异表达mRNAs的富集通路与通过质谱鉴定的通路高度不同(图16的d至图16的f)，这证实了RNA和蛋白质表达之间的不一致(图16的g)。此外，这也揭示了CPEB4作为翻译调节因子的重要性。通过比较CPEB4过表达后上调的蛋白质和线粒体蛋白质组，我们鉴定了在CPEB4病毒感染后上调的23种线粒体蛋白(图4的c、图4的d)。这样的蛋白质与ATP生物合成有关(图4的e)。此外，线粒体呼吸的分析显示，在老年SCs的CPEB4病毒感染后，基础和最大OCR显著增加，并且ATP产生增加(图4的f至图4的h)。

为了研究恢复CPEB4表达是否可以挽救老年SCs的再生阻断和细胞固有的不可逆细胞周期，我们将CPEB4感染的老年YFP

方法

动物及处理

本研究中使用的成年(3-6个月)、老化(18-24个月)和老年小鼠(>24个月)被关养并保持在HKUST的实验动物设施(LAF)中。小鼠年龄的定义遵循Jackson实验室标准。所有动物实验均经HKUST动物伦理委员会批准，并且所有研究均使用雄性小鼠进行每项实验，对照小鼠和实验小鼠的年龄相匹配。从LAF获得C57BL/6小鼠。Pax7CreERT2/+；CPEB4loxp/loxp；ROSA26YFP/+是通过将Pax7CreERT2/+小鼠(Murphy etal.,2011)与CPEB4loxp/loxp或ROSA26YFP/+小鼠杂交而产生的。补充信息中列出了基因分型引物序列。用于Cre重组酶激活的他莫昔芬(TAM)注射是经由腹膜内注射到小鼠中进行的，剂量为每克小鼠0.2mg TAM，频率为每三天注射一次，总共注射5次(Nishijo et al.,2009)。除非另有说明，否则在本研究中使用Pax7CreERT2/+；CPEB4+/+；ROSA26YFP/+小鼠作为对照。对于全小鼠灌注，详细方法请参考先前在我们实验室中进行的研究(Yue和Cheung,2020；Yue et al.,2020)。对于麻醉，通过腹膜内(IP)注射剂量为500mg/kg的三溴乙醇(Avertin)来麻醉小鼠。对于安乐死，通过吸入二氧化碳(CO

肌肉损伤

在损伤前，通过IP注射三溴乙醇对小鼠进行麻醉。通过注射30μL的1.2％氯化钡(BaCl2，Sigma-Aldrich)来损伤TA肌肉。通过均匀注射50μL的1.2％ BaCl

细胞培养和siRNA转染

将新鲜分离的SCs在Ham’s F10(F10,Sigma-Aldrich)、10％马血清(HS,Invitrogen)和青霉素-链霉素(1％ P/S,Invitrogen)中培养。培养基每24小时补充一次。对于siRNA转染(RiboBio)，根据制造商的说明书使用Lipofectamine 3000试剂(Invitrogen)。siRNA序列列于寡聚序列表中。在培养的SCs上进行siRNA介导的敲低的效果。

卫星细胞分离

简言之，解剖后肢肌肉，并在含有胶原酶II(1000U/mL)的洗涤培养基(F10、10％HS、P/S)中消化90分钟。用胶原酶II(100U/mL)和分散酶(1U/mL)进一步消化组织浆液30分钟，以获得用于细胞分选的单细胞悬浮液。详细方案如先前所述(Liu et al.,2015)。对于从整只PFA灌注的小鼠中分离SC，在第一次消化中使用胶原酶II(2,000U/mL)。使用配备有405-nm、488-nm、561-nm和633-nm激光器的BD Influx细胞分选机对细胞进行分选。该机器经过仔细的纯度和活力优化。为了评估纯度，对一小部分分选的细胞进行FACS分析和肌源性标记物Pax7和Myod1的免疫荧光染色。

单纤维外植体的分离

切除小鼠趾长伸(EDL)肌，并用胶原酶II(800U/mL)在洗涤培养基(F10、10％HS、P/S)中消化80分钟，以获得单纤维。然后仔细洗涤单根纤维，并将其置于洗涤介质中(Cheunget al.,2012)。对于siRNA(RiboBio)的转染，根据制造商的说明书使用Lipofectamine3000(Invitrogen)。

克隆

通过用于腺病毒包装的Gibson组装(NEB)将CPEB4编码序列(CDS)克隆到W35-pENTR进入质粒中。根据制造商的说明书，使用Clonase II(Invitrogen)将进入载体重组到pAd/BLOCKitDEST载体中。通过测序确认了正确的克隆。

EdU掺入分析

对于EdU掺入测定，在培养过程中不断向新鲜分离的SCs提供10μM的EdU(Invitrogen)，直到收获或收获前6小时。然后根据制造商的说明，使用Click-iT EdU成像试剂盒(Invitrogen)固定细胞并染色。

组织学和免疫组织化学

首先将胫骨前(TA)肌在0.5％ PFA中固定6小时，然后在20％蔗糖(Sigma-Aldrich)中孵育过夜。然后将肌肉冷冻在最佳切割温度的化合物(OCT,Tissue-Tek)中，使用Cryostat NX 70(Thermo)以6μm的厚度冷冻切片，并根据制造商的说明书，使用Fab抗体(Jackson ImmunoResearch)或APEX抗体标记试剂盒(Invitrogen)进行染色。

免疫荧光

使用配备有Hamamatsu ORCA-ER相机的Zeiss Axio Observer Z1荧光显微镜(Zeiss)观察图像。超分辨率图像是在配备有结构光照明显微镜(SIM)的Elyra 7系统上拍摄的。使用ZEN软件(蓝色版,Zeiss)进行数据采集。

CPEB4 RNA免疫沉淀测序和数据分析

在具有蛋白酶抑制剂(Sigma)和RNA酶抑制剂(Invitrogen)的多聚体裂解缓冲液(PLB)中收获1x 10

实时qPCR

使用NucleoSpin RNA XS试剂盒(Macherey-Nagel)分离总RNA。使用Qubit荧光计(ThermoFisher Scientific)对分离的RNA进行定量。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Invitrogen)产生cDNA。在10μL的含有5μL 2×SYBR Master Mix(Roche)、4μL cDNA模板和1μL 375nM引物的体积中建立实时PCR反应。使用Light-Cycler 480(Roche)进行实时PCR。

蛋白质印迹

将细胞在具有完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的RIPA缓冲液中裂解，并在98℃下煮沸5分钟。将30μg蛋白质提取物在10％-15％聚丙烯酰胺梯度凝胶上电泳，然后转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上。在与一抗一起孵育过夜之前，将膜在封闭缓冲液(于0.05％TBST中的5％牛奶)中孵育1小时。用于蛋白质印迹的抗体是抗CPEB4(ProteinTech Group，1:2000)和抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(UBC,1:5,000，负载对照)。在与相应的荧光二抗(Invitrogen,1:10,000)一起孵育后，使用Odyssey成像系统(LI-COR Biosciences)分析蛋白质条带。

腺病毒包装和感染

为了产生腺病毒，使用Block-iT腺病毒RNAi表达系统(Invitrogen)。简言之，使用Lipofectamine 2000，用携带GFP或CPEB4-GFP的1μg pAd/BLOCKiT-DEST载体转染于6孔板中培养至90％融合度的293A包装细胞。在培养12天后，收获病毒上清液用于随后的扩增和浓缩。腺病毒滴度约为1×10

质谱分析和质谱数据的无标记定量

在RIPA缓冲液中提取SC来源的蛋白质。对于预先固定的QSCs，将蛋白质裂解物在70℃下加热2小时，以使固定的蛋白质去交联，然后通过添加4×体积的预冷丙酮(Honeywell)沉淀蛋白质。将蛋白质颗粒依次用预冷的丙酮、预冷的乙醇洗涤，然后用预冷丙酮洗涤。用UA缓冲液(于0.1M Tris-HCl中的8M尿素)重悬颗粒，然后在30℃下孵育1.5小时之前加入二硫苏糖醇(dithioreitol)(DTT，2mM)。将碘乙酰胺(IAA)(Sigma-Aldrich，10mM)加入样品中，并将样品避光孵育40分钟。然后，将胰蛋白酶(最终浓度0.25μg/μl)加入悬浮液中过夜消化。通过添加三氟乙酸(TFA)(Sigma-Aldrich，最终浓度0.4％)停止消化。使用C18旋转吸头(spin tips)(Thermo Scientific)进行盐耗竭后，按照制造商的说明将物质加载到Bruker timsTOF Pro质谱仪上。对于液相色谱法(LC)，流动相A为98％ MilliQ水、具有0.1％甲酸的2％乙腈，并且流动相B为具有0.1％甲酸的100％乙腈。我们使用了具有CSI的ionoptiks 25cm Aurora系列发射器柱(25cm x 75μm ID，1.6μm C18)。

通过PEAKS软件(版本：X+)处理原始数据。用于检索蛋白质组数据的数据库是Uniprot，并且分类是家鼠(Mus musculus)。亲本离子为15ppm，并且片段离子为0.05Da，蛋白质FDR为1％。我们将光谱计数应用于无标记的定量，然后是标准化的光谱丰度因子(NSAF)方法(Zhu et al.,2010)。我们首先通过用蛋白质的长度标准化蛋白质的光谱数量来获得光谱丰度因子，然后通过除以所有光谱丰度因子的总和来标准化样品之间的光谱丰度因子。由于NSAF非常小，我们将NSAF乘以10

OCR、ECAR和ATP产生的测量

使用Seahorse XFp分析仪(Agilent)，使用“细胞线粒体压力”测试试剂盒测定耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)。简言之，将2x 10

用于质谱分析的CPEB4免疫沉淀

按照CPEB4 RIP测序所述的步骤，在PLB中收获1x 10

SC移植

将1x 10

通过CPEB4病毒感染逆转细胞衰老

将不同细胞系的3x 10

定量和统计学分析

所有统计学分析均使用GraphPad Prism 7(GraphPad软件)或R(版本3.6.1)进行。本文稿中的所有重复均为生物学重复，通过n表示。除非另有说明，否则所有误差条均表示标准偏差(SD)。使用ZEN Lite2.5对免疫荧光图像进行定量和分析，并通过确定荧光信号的平均值来定量相对荧光单位。没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，并且研究人员在实验和结果评估过程中没有对分配进行盲化。

本申请中引用的所有专利、专利申请和其他出版物，包括GenBank登录号，均通过引用整体并入本文中，用于所有目的。

参考文献

Ahlqvist,K.J.,Suomalainen,A.,and

Alt,E.U.,Senst,C.,Murthy,S.N.,Slakey,D.P.,Dupin,C.L.,Chaffin,A.E.,Kadowitz,P.J.,and Izadpanah,R.(2012).Aging alters tissue resident mesenchymalstem cell properties.Stem Cell Res.8,215–225.

Ansó,E.,Weinberg,S.E.,Diebold,L.P.,Thompson,B.J.,Malinge,S.,Schumacker,P.T.,Liu,X.,Zhang,Y.,Shao,Z.,Steadman,M.,et al.(2017).Themitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cellfunction.Nat.Cell Biol.19,614–625.

Baek,D.,Villén,J.,Shin,C.,Camargo,F.D.,Gygi,S.P.,and Bartel,D.P.(2008).The impact of microRNAs on protein output.Nature 455,64–71.

Bava,F.-A.,Eliscovich,C.,Ferreira,P.G.,

495,121–125.

Behrens,A.,van Deursen,J.M.,Rudolph,K.L.,and Schumacher,B.(2014).

Impact of genomic damage and ageing on stem cellfunction.Nat.CellBiol.16,201–207.

Bhattacharya,D.,and Scimè,A.(2020).Mitochondrial Function inMuscleStem Cell Fates.Front.Cell Dev.Biol.8.

Brack,A.S.,and

Brett,J.O.,Arjona,M.,Ikeda,M.,Quarta,M.,de Morrée,A.,Egner,I.M.,Perandini,L.A.,Ishak,H.D.,Goshayeshi,A.,Benjamin,D.I.,et al.

(2020).Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells inoldmice through restoration of Cyclin D1.Nat.Metab.2,307–317.Butow,R.A.,andAvadhani,N.G.(2004).Mitochondrial Signaling:TheRetrograde Response.Mol.Cell14,1–15.

Calderone,V.,Gallego,J.,Fernandez-Miranda,G.,Garcia-Pras,E.,Maillo,C.,Berzigotti,A.,Mejias,M.,Bava,F.-A.,Angulo-Urarte,A.,Graupera,M.,et al.(2016).Sequential Functions of CPEB1 and CPEB4 RegulatePathologic Expressionof Vascular Endothelial Growth Factor andAngiogenesis in Chronic LiverDisease.Gastroenterology 150,982-997.e30.

Cao,G.,Chen,D.,Liu,G.,Pan,Y.,and Liu,Q.(2018).CPEB4 promotesgrowthand metastasis of gastric cancer cells via ZEB1-mediatedepithelial&ndash；mesenchymal transition.

Chandel,N.S.(2014).Mitochondria as signaling organelles.BMC Biol.12,34.Chandel,N.S.,Jasper,H.,Ho,T.T.,and Passegué,E.(2016).Metabolicregulationof stem cell function in tissue homeostasis and organismalageing.Nat.CellBiol.18,823–832.

Chen,P.-J.,and Huang,Y.-S.(2012).CPEB2–eEF2 interaction impedes HIF-1αRNA translation.EMBO J.31,959–971.

Cheung,T.H.,and Rando,T.A.(2013).Molecular regulation of stemcellquiescence.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.14.

Cheung,T.H.,Quach,N.L.,Charville,G.W.,Liu,L.,Park,L.,Edalati,A.,Yoo,B.,Hoang,P.,and Rando,T.A.(2012).Maintenance of muscle stem-

cell quiescence by microRNA-489.Nature 482,524–528.

Chistiakov,D.A.,Sobenin,I.A.,Revin,V.V.,Orekhov,A.N.,and Bobryshev,Y.V.(2014).Mitochondrial Aging and Age-Related DysfunctionofMitochondria.BioMed Res.Int.2014,e238463.

Cho,J.,Hur,J.H.,and Walker,D.W.(2011).The Role of MitochondriainDrosophila Aging.Exp.Gerontol.46,331–334.

Cogliati,S.,Enriquez,J.A.,and Scorrano,L.(2016).MitochondrialCristae:

Where Beauty Meets Functionality.Trends Biochem.Sci.41,261–273.Conboy,I.M.,and Rando,T.A.(2005).Aging,stem cells and tissueregeneration:lessons from muscle.Cell Cycle Georget.Tex 4,407–410.Dobin,A.,Davis,C.A.,Schlesinger,F.,Drenkow,J.,Zaleski,C.,Jha,S.,Batut,P.,Chaisson,M.,andGingeras,T.R.(2013).STAR:ultrafast universalRNA-seqaligner.Bioinforma.Oxf.Engl.29,15–21.

D’Souza,A.R.,and Minczuk,M.(2018).Mitochondrial transcriptionandtranslation:overview.Essays Biochem.62,309–320.

Eliyahu,E.,Pnueli,L.,Melamed,D.,Scherrer,T.,Gerber,A.P.,Pines,O.,Rapaport,D.,and Arava,Y.(2010).Tom20 Mediates Localization ofmRNAs toMitochondria in a Translation-Dependent Manner.Mol.Cell.

Biol.30,284–294.

Fernández-Miranda,G.,and Méndez,R.(2012).The CPEB-family of proteins,translational control in senescence and cancer.Ageing Res.Rev.11,

460–472.

Ford,L.,Ling,E.,Kandel,E.R.,and Fioriti,L.(2019).CPEB3inhibitstranslation of mRNA targets by localizing them to P bodies.Proc.Natl.

Acad.Sci.116,18078–18087.

Friedman,J.R.,and Nunnari,J.(2014).Mitochondrial form and function.

Nature 505,335–343.

García-Prat,L.,Martínez-Vicente,M.,Perdiguero,E.,Ortet,L.,Rodríguez-Ubreva,J.,Rebollo,E.,Ruiz-Bonilla,V.,Gutarra,S.,Ballestar,E.,Serrano,A.L.,etal.(2016).Autophagy maintains stemness by preventing senescence.Nature 529,37–42.

Ge,Y.,Miao,Y.,Gur-Cohen,S.,Gomez,N.,Yang,H.,Nikolova,M.,Polak,L.,Hu,Y.,Verma,A.,Elemento,O.,et al.(2020).The aging skin microenvironment dictatesstem cell behavior.Proc.Natl.Acad.Sci.117,5339–5350.

Guha,M.,Srinivasan,S.,Ruthel,G.,Kashina,A.K.,Carstens,R.P.,Mendoza,A.,Khanna,C.,Van Winkle,T.,and Avadhani,N.G.(2014).Mitochondrial retrogradesignaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breastcancer stem cells.Oncogene 33,5238–5250.

Haas,R.H.(2019).Mitochondrial Dysfunction in Aging and Diseases ofAging.Biology 8.

Hu,J.,Zhang,L.,Chen,Q.,Lin,J.,Wang,S.,Liu,R.,Zhang,W.,Miao,K.,andShou,T.(2018).Knockdown of CPEB4 expression suppresses cell migration andinvasion via Akt pathway in non-small cell lung cancer.Cell Biol.Int.42,1484–1491.

Huang,Y.-S.,Kan,M.-C.,Lin,C.-L.,and Richter,J.D.(2006).CPEB3 andCPEB4 in neurons:analysis of RNA-binding specificity and translationalcontrol of AMPA receptor GluR2 mRNA.EMBO J.25,4865–4876.

Khacho,M.,Clark,A.,Svoboda,D.S.,Azzi,J.,MacLaurin,J.G.,Meghaizel,C.,Sesaki,H.,Lagace,D.C.,Germain,M.,Harper,M.-E.,et al.(2016).MitochondrialDynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating aNuclear Transcriptional Program.Cell Stem Cell 19,232–247.

Kochanek,D.M.,and Wells,D.G.(2013).CPEB1 Regulates the Expression ofMTDH/AEG-1 and Glioblastoma Cell Migration.Mol.Cancer Res.11,149–160.

Kuang,S.,Gillespie,M.A.,and Rudnicki,M.A.(2008).Niche regulation ofmuscle satellite cell self-renewal and differentiation.Cell Stem Cell 2,22–31.

Lesnik,C.,Golani-Armon,A.,and Arava,Y.(2015).Localized translationnear the mitochondrial outer membrane:An update.RNA Biol.12,801–809.

Li,L.,Rozo,M.,Yue,S.,Zheng,X.,Tan,F.,Lepper,C.,and Fan,C.-M.(2019).Muscle stem cell renewal suppressed by Gas1 can be reversed by GDNF inmice.Nat.Metab.1,985–995.

Li,Q.,Gao,Z.,Chen,Y.,and Guan,M.-X.(2017).The role of mitochondria inosteogenic,adipogenic and chondrogenic differentiation of mesenchymal stemcells.Protein Cell 8,439–445.

Liao,Y.,Smyth,G.K.,and Shi,W.(2014).featureCounts:an efficientgeneral purpose program for assigning sequence reads to genomicfeatures.Bioinforma.Oxf.Engl.30,923–930.

Lisowski,P.,Kannan,P.,Mlody,B.,and Prigione,A.(2018).Mitochondria andthe dynamic control of stem cell homeostasis.EMBO Rep.19.

Liu,L.,Cheung,T.H.,Charville,G.W.,and Rando,T.A.(2015).Isolation ofskeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cellsorting.Nat.Protoc.10,1612–1624.

Liu,L.,Charville,G.W.,Cheung,T.H.,Yoo,B.,Santos,P.J.,Schroeder,M.,andRando,T.A.(2018).Impaired Notch Signaling Leads to a Decrease in p53 Activityand Mitotic Catastrophe in Aged Muscle Stem Cells.Cell Stem Cell 23,544-556.e4.

Love,M.I.,Huber,W.,and Anders,S.(2014).Moderated estimation of foldchange and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.Genome Biol.15,550–574.

Lu,R.,Zhou,Z.,Yu,W.,Xia,Y.,and Zhi,X.(2017a).CPEB4 promotes cellmigration and invasion via upregulating Vimentin expression in breast cancer.Biochem.Biophys.Res.Commun.489,135–141.

Lu,W.-H.,Yeh,N.-H.,and Huang,Y.-S.(2017b).CPEB2 Activates GRASP1 mRNATranslation and Promotes AMPA Receptor Surface Expression,Long-TermPotentiation,and Memory.Cell Rep.21,1783–1794.

Maillo,C.,Martín,J.,Sebastián,D.,Hernández-Alvarez,M.,García-Rocha,M.,Reina,O.,Zorzano,A.,Fernandez,M.,and Méndez,R.(2017).Circadian-and UPR-dependent control of CPEB4 mediates a translational response to counteracthepatic steatosis under ER stress.Nat.Cell Biol.19,94–105.

Martínez-Reyes,I.,Diebold,L.P.,Kong,H.,Schieber,M.,Huang,H.,Hensley,C.T.,Mehta,M.M.,Wang,T.,Santos,J.H.,Woychik,R.,et al.(2016).TCA Cycle andMitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse BiologicalFunctions.Mol.Cell 61,199–209.

Mejia-Ramirez,E.,and Florian,M.C.(2020).Understanding intrinsichematopoietic stem cell aging.Haematologica 105,22–37.

Mejias,M.,Gallego,J.,Naranjo-Suarez,S.,Ramirez,M.,Pell,N.,Manzano,A.,

Mohrin,M.,Shin,J.,Liu,Y.,Brown,K.,Luo,H.,Xi,Y.,Haynes,C.M.,and Chen,D.(2015).Stem cell aging.A mitochondrial UPR-mediated metabolic checkpointregulates hematopoietic stem cell aging.Science 347,1374–1377.

Motohashi,N.,and Asakura,A.(2014).Muscle satellite cell heterogeneityand self-renewal.Front.Cell Dev.Biol.2.

Murphy,M.M.,Lawson,J.A.,Mathew,S.J.,Hutcheson,D.A.,and Kardon,G.(2011).Satellite cells,connective tissue fibroblasts and their interactionsare crucial for muscle regeneration.Dev.Camb.Engl.138,3625–3637.

Nishijo,K.,Hosoyama,T.,Bjornson,C.R.R.,Schaffer,B.S.,Prajapati,S.I.,

Bahadur,A.N.,Hansen,M.S.,Blandford,M.C.,McCleish,A.T.,Rubin,

B.P.,et al.(2009).Biomarker system for studying muscle,stem cells,andcancer in vivo.FASEB J.Off.Publ.Fed.Am.Soc.Exp.Biol.23,

2681–2690.

Novoa,I.,Gallego,J.,Ferreira,P.G.,and Mendez,R.(2010).Mitotic cell-cycleprogression is regulated by CPEB1 and CPEB4-dependenttranslationalcontrol.Nat.Cell Biol.12,447–456.

Papa,L.,Djedaini,M.,and Hoffman,R.(2019).Mitochondrial RoleinStemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.StemCellsInt.2019,e4067162.

Parras,A.,Anta,H.,Santos-Galindo,M.,Swarup,V.,Elorza,A.,Nieto-

González,J.L.,Picó,S.,Hernández,I.H.,Díaz-Hernández,J.I.,Belloc,E.,etal.(2018).Autism-like phenotype and risk gene mRNAdeadenylation by CPEB4 mis-splicing.Nature 560,441–446.Payne,B.A.I.,and Chinnery,P.F.(2015).Mitochondrial dysfunction in aging:

Much progress but many unresolved questions.Biochim.Biophys.ActaBBA -Bioenerg.1847,1347–1353.

Piqué,M.,López,J.M.,Foissac,S.,Guigó,R.,and Méndez,R.(2008).Acombinatorial code for CPE-mediated translational control.Cell 132,

434–448.

Popow,J.,Alleaume,A.-M.,Curk,T.,Schwarzl,T.,Sauer,S.,and Hentze,M.W.

(2015).FASTKD2 is an RNA-binding protein required formitochondrialRNA processing and translation.RNA 21,1873–1884.Rando,T.A.(2006).Stem cells,ageing and the quest for immortality.Nature

441,1080–1086.

Rando,T.A.,and Chang,H.Y.(2012).Aging,rejuvenation,andepigeneticreprogramming:resetting the aging clock.Cell 148,46–57.

Raudvere,U.,Kolberg,L.,Kuzmin,I.,Arak,T.,Adler,P.,Peterson,H.,andVilo,J.(2019).g:Profiler:a web server for functional enrichmentanalysisand conversions of gene lists(2019 update).Nucleic Acids Res.47,191–198.

Richter,J.D.(2007).CPEB:a life in translation.Trends Biochem.Sci.32,279–285.

Ryall,J.G.,Dell’Orso,S.,Derfoul,A.,Juan,A.,Zare,H.,Feng,X.,Clermont,D.,Koulnis,M.,Gutierrez-Cruz,G.,Fulco,M.,et al.(2015).The NAD(+)-dependentSIRT1 deacetylase translates a metabolic switch into regulatory epigeneticsin skeletal muscle stem cells.Cell Stem Cell 16,171–183.

Sala,D.,Cunningham,T.J.,Stec,M.J.,Etxaniz,U.,Nicoletti,C.,Dall’Agnese,A.,Puri,P.L.,Duester,G.,Latella,L.,and Sacco,A.(2019).The Stat3-Fam3aaxis promotes muscle stem cell myogenic lineage progression by inducingmitochondrial respiration.Nat.Commun.10,1796.

Schultz,M.B.,and Sinclair,D.A.(2016).When stem cells grow old:phenotypes and mechanisms of stem cell aging.Dev.Camb.Engl.143,3–14.

Shi,X.,and Garry,D.J.(2006).Muscle stem cells in development,regeneration,and disease.Genes Dev.20,1692–1708.

Shin,J.,Salameh,J.S.,and Richter,J.D.(2016).Impaired neurodevelopmentby the low complexity domain of CPEB4 reveals a convergent pathway withneurodegeneration.Sci.Rep.6,29395.

So,W.-K.,and Cheung,T.H.(2018).Molecular Regulation of CellularQuiescence:A Perspective from Adult Stem Cells and Its Niches.MethodsMol.Biol.Clifton NJ 1686,1–25.

Sousa-Victor,P.,Gutarra,S.,García-Prat,L.,Rodriguez-Ubreva,J.,Ortet,L.,Ruiz-Bonilla,V.,Jardí,M.,Ballestar,E.,González,S.,Serrano,A.L.,et al.(2014).Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence intosenescence.Nature 506,316–321.

Stoll,E.A.,Cheung,W.,Mikheev,A.M.,Sweet,I.R.,Bielas,J.H.,Zhang,J.,Rostomily,R.C.,and Horner,P.J.(2011).Aging neural progenitor cells havedecreased mitochondrial content and lower oxidative metabolism.

J.Biol.Chem.286,38592–38601.

Sun,N.,Youle,R.J.,and Finkel,T.(2016).The Mitochondrial Basis ofAging.

Mol.Cell 61,654–666.

Teperino,R.,Schoonjans,K.,and Auwerx,J.(2010).Histonemethyltransferases and demethylases；can they link metabolismandtranscription？Cell Metab.12,321–327.

Urbán,N.,and Cheung,T.H.(2021).Stem cell quiescence:the challengingpathto activation.Development 148.

Wallace,D.C.,Fan,W.,and Procaccio,V.(2010).Mitochondrial EnergeticsandTherapeutics.Annu.Rev.Pathol.5,297–348.

Yin,H.,Price,F.,and Rudnicki,M.A.(2013).Satellite Cells and theMuscleStem Cell Niche.Physiol.Rev.93,23–67.

Yue,L.,and Cheung,T.H.(2020).Protocol for Isolation andCharacterizationof In Situ Fixed Quiescent Muscle Stem Cells.STAR Protoc.1,

100128–100144.

Yue,L.,Wan,R.,Luan,S.,Zeng,W.,and Cheung,T.H.(2020).DekModulatesGlobal Intron Retention during Muscle Stem Cells Quiescence Exit.

Dev.Cell 53,661–676.

Zammit,P.S.,Partridge,T.A.,and Yablonka-Reuveni,Z.(2006).TheSkeletalMuscle Satellite Cell:The Stem Cell That Came in From the Cold.J.

Histochem.Cytochem.54,1177–1191.

Zhang,H.,Ryu,D.,Wu,Y.,Gariani,K.,Wang,X.,Luan,P.,D’Amico,D.,Ropelle,E.R.,Lutolf,M.P.,Aebersold,R.,et al.(2016).NAD+

repletion improves mitochondrial and stem cell function andenhanceslife span in mice.Science 352,1436–1443.

Zhang,H.,Zou,C.,Qiu,Z.,E,F.,Li,Q.,Chen,M.,Wang,D.,Tan,Q.,Yin,W.,Matunda,C.,et al.(2020).CPEB3-mediated MTDH mRNAtranslational suppressionrestrains hepatocellular carcinomaprogression.Cell Death Dis.11,1–17.

Zhu,W.,Smith,J.W.,and Huang,C.-M.(2010).Mass spectrometry-basedlabel-free quantitative proteomics.J.Biomed.Biotechnol.2010,

840518–840526.

序列表

SEQ ID NO:1人CPEB4编码序列，GenBank登录号NM_030627.4

ATGGGGGATTACGGGTTTGGAGTGCTAGTGCAAAGCAATACTGGGAATAAATCTGCTTTTCCAGTCAGATTCCATCCACATCTGCAGCCTCCACACCATCACCAAAATGCCACCCCCAGCCCTGCTGCTTTTATAAATAATAACACAGCTGCCAATGGCAGCAGTGCTGGGTCAGCTTGGCTTTTTCCTGCTCCAGCTACCCATAACATTCAGGATGAGATCTTGGGGTCAGAAAAAGCAAAAAGTCAGCAACAGGAACAGCAAGACCCCTTAGAAAAGCAGCAGCTTTCCCCAAGTCCAGGTCAGGAAGCTGGAATACTGCCTGAAACAGAGAAGGCAAAATCAGAAGAAAATCAAGGGGACAATTCTTCGGAAAATGGCAATGGGAAGGAGAAAATAAGGATCGAATCTCCAGTGTTGACAGGGTTTGATTATCAAGAAGCCACTGGGCTAGGTACTTCAACCCAACCCTTGACATCTAGCGCATCGTCTCTTACTGGTTTCAGTAACTGGTCAGCAGCGATAGCGCCTTCCTCCTCTACAATAATCAATGAAGATGCAAGTTTCTTTCACCAGGGAGGGGTCCCTGCTGCTTCGGCTAATAACGGTGCTCTGTTGTTTCAAAATTTCCCCCATCATGTCAGCCCTGGCTTTGGAGGCAGCTTCTCTCCTCAGATCGGGCCTCTCTCACAGCACCACCCACATCACCCTCATTTCCAGCATCATCACAGCCAGCATCAGCAGCAAAGGAGGTCTCCTGCCAGTCCCCATCCCCCACCCTTCACACATAGAAATGCTGCTTTTAACCAGCTGCCTCATTTGGCGAATAATCTTAACAAACCCCCCTCTCCGTGGAGCAGCTACCAGAGTCCGTCACCAACACCCTCCTCTTCCTGGAGCCCGGGCGGTGGTGGATATGGTGGCTGGGGAGGTTCCCAAGGCCGAGATCACCGCAGAGGGCTGAATGGTGGAATAACGCCCCTGAACTCCATCTCGCCTTTGAAGAAAAATTTTGCAAGCAATCATATTCAGCTCCAGAAGTATGCTCGCCCCAGCTCTGCCTTTGCACCTAAATCCTGGATGGAAGATAGCTTGAACAGGGCTGACAACATTTTTCCTTTTCCGGATCGCCCCAGGACATTCGACATGCACTCACTGGAGAGTTCACTCATTGACATAATGAGAGCTGAAAATGATACCATTAAAGGTCGTCTAAACTATTCATATCCAGGATCCGATAGCTCTCTGCTTATTAATGCAAGGACATATGGGCGAAGGAGAGGTCAGTCTTCACTGTTTCCAATGGAAGATGGATTCTTGGATGATGGCCGTGGGGATCAGCCTCTTCATAGTGGCCTGGGTTCACCTCACTGCTTCAGTCACCAGAATGGGGAAAGAGTGGAACGATATTCTCGAAAGGTGTTTGTAGGCGGATTGCCTCCAGACATTGATGAAGATGAGATCACAGCTAGTTTTCGTCGCTTTGGCCCTCTGATTGTGGATTGGCCTCATAAAGCTGAGAGCAAATCCTATTTTCCTCCTAAAGGCTATGCATTCCTGCTGTTTCAAGATGAAAGCTCTGTGCAGGCTCTCATTGATGCATGCATTGAAGAAGATGGAAAACTCTACCTTTGTGTATCAAGTCCCACTATCAAGGATAAGCCAGTCCAGATTCGGCCTTGGAATCTCAGTGACAGTGACTTTGTGATGGATGGTTCACAGCCACTTGACCCACGAAAAACTATATTTGTTGGTGGTGTTCCTCGACCATTACGAGCTGTGGAGCTTGCGATGATAATGGATCGGCTATATGGAGGTGTGTGCTACGCTGGGATTGATACCGACCCTGAGCTAAAATACCCAAAAGGAGCTGGGAGAGTTGCGTTCTCTAATCAACAGAGTTACATAGCTGCTATCAGTGCCCGCTTTGTTCAGCTGCAGCATGGAGAGATAGATAAACGGGTGGAAGTTAAGCCATATGTCTTGGATGATCAGCTGTGTGATGAATGTCAGGGGGCCCGTTGTGGGGGGAAATTTGCTCCATTTTTCTGTGCTAATGTTACCTGTCTGCAGTATTACTGTGAATATTGCTGGGCTGCTATCCATTCTCGTGCTGGCAGGGAATTCCACAAGCCCCTGGTGAAGGAAGGCGGTGACCGCCCTCGGCATATTTCATTCCGCTGGAACTAA

SEQ ID NO:2人CPEB4蛋白的氨基酸序列，GenBank登录号NP_085130.2

MGDYGFGVLVQSNTGNKSAFPVRFHPHLQPPHHHQNATPSPAAFINNNTAANGSSAGSAWLFPAPATHNIQDEILGSEKAKSQQQEQQDPLEKQQLSPSPGQEAGILPETEKAKSEENQGDNSSENGNGKEKIRIESPVLTGFDYQEATGLGTSTQPLTSSASSLTGFSNWSAAIAPSSSTIINEDASFFHQGGVPAASANNGALLFQNFPHHVSPGFGGSFSPQIGPLSQHHPHHPHFQHHHSQHQQQRRSPASPHPPPFTHRNAAFNQLPHLANNLNKPPSPWSSYQSPSPTPSSSWSPGGGGYGGWGGSQGRDHRRGLNGGITPLNSISPLKKNFASNHIQLQKYARPSSAFAPKSWMEDSLNRADNIFPFPDRPRTFDMHSLESSLIDIMRAENDTIKGRLNYSYPGSDSSLLINARTYGRRRGQSSLFPMEDGFLDDGRGDQPLHSGLGSPHCFSHQNGERVERYSRKVFVGGLPPDIDEDEITASFRRFGPLIVDWPHKAESKSYFPPKGYAFLLFQDESSVQALIDACIEEDGKLYLCVSSPTIKDKPVQIRPWNLSDSDFVMDGSQPLDPRKTIFVGGVPRPLRAVELAMIMDRLYGGVCYAGIDTDPELKYPKGAGRVAFSNQQSYIAAISARFVQLQHGEIDKRVEVKPYVLDDQLCDECQGARCGGKFAPFFCANVTCLQYYCEYCWAAIHSRAGREFHKPLVKEGGDRPRHISFRWN

SEQ ID NO:3人CPEB4同种型b编码序列(变体2)，Genbank登录号：NM_001308189.2

ATGGGGGATTACGGGTTTGGAGTGCTAGTGCAAAGCAATACTGGGAATAAATCTGCTTTTCCAGTCAGATTCCATCCACATCTGCAGCCTCCACACCATCACCAAAATGCCACCCCCAGCCCTGCTGCTTTTATAAATAATAACACAGCTGCCAATGGCAGCAGTGCTGGGTCAGCTTGGCTTTTTCCTGCTCCAGCTACCCATAACATTCAGGATGAGATCTTGGGGTCAGAAAAAGCAAAAAGTCAGCAACAGGAACAGCAAGACCCCTTAGAAAAGCAGCAGCTTTCCCCAAGTCCAGGTCAGGAAGCTGGAATACTGCCTGAAACAGAGAAGGCAAAATCAGAAGAAAATCAAGGGGACAATTCTTCGGAAAATGGCAATGGGAAGGAGAAAATAAGGATCGAATCTCCAGTGTTGACAGGGTTTGATTATCAAGAAGCCACTGGGCTAGGTACTTCAACCCAACCCTTGACATCTAGCGCATCGTCTCTTACTGGTTTCAGTAACTGGTCAGCAGCGATAGCGCCTTCCTCCTCTACAATAATCAATGAAGATGCAAGTTTCTTTCACCAGGGAGGGGTCCCTGCTGCTTCGGCTAATAACGGTGCTCTGTTGTTTCAAAATTTCCCCCATCATGTCAGCCCTGGCTTTGGAGGCAGCTTCTCTCCTCAGATCGGGCCTCTCTCACAGCACCACCCACATCACCCTCATTTCCAGCATCATCACAGCCAGCAT

CAGCAGCAAAGGAGGTCTCCTGCCAGTCCCCATCCCCCACCCTTCA

CACATAGAAATGCTGCTTTTAACCAGCTGCCTCATTTGGCGAATAAT

CTTAACAAACCCCCCTCTCCGTGGAGCAGCTACCAGAGTCCGTCAC

CAACACCCTCCTCTTCCTGGAGCCCGGGCGGTGGTGGATATGGTGG

CTGGGGAGGTTCCCAAGGCCGAGATCACCGCAGAGGGCTGAATGG

TGGAATAACGCCCCTGAACTCCATCTCGCCTTTGAAGAAAAATTTT

GCAAGCAATCATATTCAGCTCCAGAAGTATGCTCGCCCCAGCTCTGC

CTTTGCACCTAAATCCTGGATGGAAGATAGCTTGAACAGGGCTGAC

AACATTTTTCCTTTTCCGGATCGCCCCAGGACATTCGACATGCACTC

ACTGGAGAGTTCACTCATTGACATAATGAGAGCTGAAAATGATACC

ATTAAAGCAAGGACATATGGGCGAAGGAGAGGTCAGTCTTCACTGT

TTCCAATGGAAGATGGATTCTTGGATGATGGCCGTGGGGATCAGCC

TCTTCATAGTGGCCTGGGTTCACCTCACTGCTTCAGTCACCAGAATG

GGGAAAGAGTGGAACGATATTCTCGAAAGGTGTTTGTAGGCGGATT

GCCTCCAGACATTGATGAAGATGAGATCACAGCTAGTTTTCGTCGCT

TTGGCCCTCTGATTGTGGATTGGCCTCATAAAGCTGAGAGCAAATCC

TATTTTCCTCCTAAAGGCTATGCATTCCTGCTGTTTCAAGATGAAAG

CTCTGTGCAGGCTCTCATTGATGCATGCATTGAAGAAGATGGAAAA

CTCTACCTTTGTGTATCAAGTCCCACTATCAAGGATAAGCCAGTCCA

GATTCGGCCTTGGAATCTCAGTGACAGTGACTTTGTGATGGATGGTT

CACAGCCACTTGACCCACGAAAAACTATATTTGTTGGTGGTGTTCCT

CGACCATTACGAGCTGTGGAGCTTGCGATGATAATGGATCGGCTATA

TGGAGGTGTGTGCTACGCTGGGATTGATACCGACCCTGAGCTAAAA

TACCCAAAAGGAGCTGGGAGAGTTGCGTTCTCTAATCAACAGAGTT

ACATAGCTGCTATCAGTGCCCGCTTTGTTCAGCTGCAGCATGGAGA

GATAGATAAACGGGTGGAAGTTAAGCCATATGTCTTGGATGATCAGC

TGTGTGATGAATGTCAGGGGGCCCGTTGTGGGGGGAAATTTGCTCC

ATTTTTCTGTGCTAATGTTACCTGTCTGCAGTATTACTGTGAATATTG

CTGGGCTGCTATCCATTCTCGTGCTGGCAGGGAATTCCACAAGCCC

CTGGTGAAGGAAGGCGGTGACCGCCCTCGGCATATTTCATTCCGCTGGAACTAA

SEQ ID NO:4人CPEB4同种型b(变体2)的氨基酸序列，Genbank登录号：NP_001295118.1

MGDYGFGVLVQSNTGNKSAFPVRFHPHLQPPHHHQNATPSPAAFINNNTAANGSSAGSAWLFPAPATHNIQDEILGSEKAKSQQQEQQDPLEKQQLSPSPGQEAGILPETEKAKSEENQGDNSSENGNGKEKIRIESPVLTGFDYQEATGLGTSTQPLTSSASSLTGFSNWSAAIAPSSSTIINEDASFFHQGGVPAASANNGALLFQNFPHHVSPGFGGSFSPQIGPLSQHHPHHPHFQHHHSQHQQQRRSPASPHPPPFTHRNAAFNQLPHLANNLNKPPSPWSSYQSPSPTPSSSWSPGGGGYGGWGGSQGRDHRRGLNGGITPLNSISPLKKNFASNHIQLQKYARPSSAFAPKSWMEDSLNRADNIFPFPDRPRTFDMHSLESSLIDIMRAENDTIKARTYGRRRGQSSLFPMEDGFLDDGRGDQPLHSGLGSPHCFSHQNGERVERYSRKVFVGGLPPDIDEDEITASFRRFGPLIVDWPHKAESKSYFPPKGYAFLLFQDESSVQALIDACIEEDGKLYLCVSSPTIKDKPVQIRPWNLSDSDFVMDGSQPLDPRKTIFVGGVPRPLRAVELAMIMDRLYGGVCYAGIDTDPELKYPKGAGRVAFSNQQSYIAAISARFVQLQHGEIDKRVEVKPYVLDDQLCDECQGARCGGKFAPFFCANVTCLQYYCEYCWAAIHSRAGREFHKPLVKEGGDRPRHISFRWN

SEQ ID NO:5人CPEB4同种型c编码序列(变体3)，Genbank登录号：NM_001308191.2

ATGGGGGATTACGGGTTTGGAGTGCTAGTGCAAAGCAATACTGGGAATAAATCTGCTTTTCCAGTCAGATTCCATCCACATCTGCAGCCTCCACACCATCACCAAAATGCCACCCCCAGCCCTGCTGCTTTTATAAATAATAACACAGCTGCCAATGGCAGCAGTGCTGGGTCAGCTTGGCTTTTTCCTGCTCCAGCTACCCATAACATTCAGGATGAGATCTTGGGGTCAGAAAAAGCAAAAAGTCAGCAACAGGAACAGCAAGACCCCTTAGAAAAGCAGCAGCTTTCCCCAAGTCCAGGTCAGGAAGCTGGAATACTGCCTGAAACAGAGAAGGCAAAATCAGAAGAAAATCAAGGGGACAATTCTTCGGAAAATGGCAATGGGAAGGAGAAAATAAGGATCGAATCTCCAGTGTTGACAGGGTTTGATTATCAAGAAGCCACTGGGCTAGGTAC

TTCAACCCAACCCTTGACATCTAGCGCATCGTCTCTTACTGGTTTCA

GTAACTGGTCAGCAGCGATAGCGCCTTCCTCCTCTACAATAATCAAT

GAAGATGCAAGTTTCTTTCACCAGGGAGGGGTCCCTGCTGCTTCGG

CTAATAACGGTGCTCTGTTGTTTCAAAATTTCCCCCATCATGTCAGC

CCTGGCTTTGGAGGCAGCTTCTCTCCTCAGATCGGGCCTCTCTCAC

AGCACCACCCACATCACCCTCATTTCCAGCATCATCACAGCCAGCAT

CAGCAGCAAAGGAGGTCTCCTGCCAGTCCCCATCCCCCACCCTTCA

CACATAGAAATGCTGCTTTTAACCAGCTGCCTCATTTGGCGAATAAT

CTTAACAAACCCCCCTCTCCGTGGAGCAGCTACCAGAGTCCGTCAC

CAACACCCTCCTCTTCCTGGAGCCCGGGCGGTGGTGGATATGGTGG

CTGGGGAGGTTCCCAAGGCCGAGATCACCGCAGAGGGCTGAATGG

TGGAATAACGCCCCTGAACTCCATCTCGCCTTTGAAGAAAAATTTT

GCAAGCAATCATATTCAGCTCCAGAAGTATGCTCGCCCCAGCTCTGC

CTTTGCACCTAAATCCTGGATGGAAGATAGCTTGAACAGGGCTGAC

AACATTTTTCCTTTTCCGGATCGCCCCAGGACATTCGACATGCACTC

ACTGGAGAGTTCACTCATTGACATAATGAGAGCTGAAAATGATACC

ATTAAAGGTCAGTCTTCACTGTTTCCAATGGAAGATGGATTCTTGGA

TGATGGCCGTGGGGATCAGCCTCTTCATAGTGGCCTGGGTTCACCTC

ACTGCTTCAGTCACCAGAATGGGGAAAGAGTGGAACGATATTCTCG

AAAGGTGTTTGTAGGCGGATTGCCTCCAGACATTGATGAAGATGAG

ATCACAGCTAGTTTTCGTCGCTTTGGCCCTCTGATTGTGGATTGGCC

TCATAAAGCTGAGAGCAAATCCTATTTTCCTCCTAAAGGCTATGCAT

TCCTGCTGTTTCAAGATGAAAGCTCTGTGCAGGCTCTCATTGATGCA

TGCATTGAAGAAGATGGAAAACTCTACCTTTGTGTATCAAGTCCCA

CTATCAAGGATAAGCCAGTCCAGATTCGGCCTTGGAATCTCAGTGA

CAGTGACTTTGTGATGGATGGTTCACAGCCACTTGACCCACGAAAA

ACTATATTTGTTGGTGGTGTTCCTCGACCATTACGAGCTGTGGAGCT

TGCGATGATAATGGATCGGCTATATGGAGGTGTGTGCTACGCTGGGA

TTGATACCGACCCTGAGCTAAAATACCCAAAAGGAGCTGGGAGAGT

TGCGTTCTCTAATCAACAGAGTTACATAGCTGCTATCAGTGCCCGCTTTGTTCAGCTGCAGCATGGAGAGATAGATAAACGGGTGGAAGTTAAGCCATATGTCTTGGATGATCAGCTGTGTGATGAATGTCAGGGGGCCCGTTGTGGGGGGAAATTTGCTCCATTTTTCTGTGCTAATGTTACCTGTCTGCAGTATTACTGTGAATATTGCTGGGCTGCTATCCATTCTCGTGCTGGCAGGGAATTCCACAAGCCCCTGGTGAAGGAAGGCGGTGACCGCCCTCGGCATATTTCATTCCGCTGGAACTAA

SEQ ID NO:6人CPEB4同种型c(变体3)的氨基酸序列，Genbank登录号：NM_001295120.1

MGDYGFGVLVQSNTGNKSAFPVRFHPHLQPPHHHQNATPSPAAFINNNTAANGSSAGSAWLFPAPATHNIQDEILGSEKAKSQQQEQQDPLEKQQLSPSPGQEAGILPETEKAKSEENQGDNSSENGNGKEKIRIESPVLTGFDYQEATGLGTSTQPLTSSASSLTGFSNWSAAIAPSSSTIINEDASFFHQGGVPAASANNGALLFQNFPHHVSPGFGGSFSPQIGPLSQHHPHHPHFQHHHSQHQQQRRSPASPHPPPFTHRNAAFNQLPHLANNLNKPPSPWSSYQSPSPTPSSSWSPGGGGYGGWGGSQGRDHRRGLNGGITPLNSISPLKKNFASNHIQLQKYARPSSAFAPKSWMEDSLNRADNIFPFPDRPRTFDMHSLESSLIDIMRAENDTIKGQSSLFPMEDGFLDDGRGDQPLHSGLGSPHCFSHQNGERVERYSRKVFVGGLPPDIDEDEITASFRRFGPLIVDWPHKAESKSYFPPKGYAFLLFQDESSVQALIDACIEEDGKLYLCVSSPTIKDKPVQIRPWNLSDSDFVMDGSQPLDPRKTIFVGGVPRPLRAVELAMIMDRLYGGVCYAGIDTDPELKYPKGAGRVAFSNQQSYIAAISARFVQLQHGEIDKRVEVKPYVLDDQLCDECQGARCGGKFAPFFCANVTCLQYYCEYCWAAIHSRAGREFHKPLVKEGGDRPRHISFRWN

SEQ ID NO:7人CPEB4同种型d编码序列(变体4)，Genbank登录号：NM_001308192.2

ATGCACTCACTGGAGAGTTCACTCATTGACATAATGAGAGCTGAAAATGATACCATTAAAGGTCGTCTAAACTATTCATATCCAGGATCCGATAGCTCTCTGCTTATTAATGGTCAGTCTTCACTGTTTCCAATGGAAGATGGATTCTTGGATGATGGCCGTGGGGATCAGCCTCTTCATAGTGGCCTGGGTTCACCTCACTGCTTCAGTCACCAGAATGGGGAAAGAGTGGAACGATATTCTCGAAAGGTGTTTGTAGGCGGATTGCCTCCAGACATTGATGAAGATGAGATCACAGCTAGTTTTCGTCGCTTTGGCCCTCTGATTGTGGATTGGCCTCATAAAGCTGAGAGCAAATCCTATTTTCCTCCTAAAGGCTATGCATTCCTGCTGTTTCAAGATGAAAGCTCTGTGCAGGCTCTCATTGATGCATGCATTGAAGAAGATGGAAAACTCTACCTTTGTGTATCAAGTCCCACTATCAAGGATAAGCCAGTCCAGATTCGGCCTTGGAATCTCAGTGACAGTGACTTTGTGATGGATGGTTCACAGCCACTTGACCCACGAAAAACTATATTTGTTGGTGGTGTTCCTCGACCATTACGAGCTGTGGAGCTTGCGATGATAATGGATCGGCTATATGGAGGTGTGTGCTACGCTGGGATTGATACCGACCCTGAGCTAAAATACCCAAAAGGAGCTGGGAGAGTTGCGTTCTCTAATCAACAGAGTTACATAGCTGCTATCAGTGCCCGCTTTGTTCAGCTGCAGCATGGAGAGATAGATAAACGGGTGGAAGTTAAGCCATATGTCTTGGATGATCAGCTGTGTGATGAATGTCAGGGGGCCCGTTGTGGGGGGAAATTTGCTCCATTTTTCTGTGCTAATGTTACCTGTCTGCAGTATTACTGTGAATATTGCTGGGCTGCTATCCATTCTCGTGCTGGCAGGGAATTCCACAAGCCCCTGGTGAAGGAAGGCGGTGACCGCCCTCGGCATATTTCATTCCGCTGGAACTAA

SEQ ID NO:8人CPEB4同种型d(变体4)的氨基酸序列，Genbank登录号：NP_001295121.1

MHSLESSLIDIMRAENDTIKGRLNYSYPGSDSSLLINGQSSLFPMEDGFLDDGRGDQPLHSGLGSPHCFSHQNGERVERYSRKVFVGGLPPDIDEDEITASFRRFGPLIVDWPHKAESKSYFPPKGYAFLLFQDESSVQALIDACIEEDGKLYLCVSSPTIKDKPVQIRPWNLSDSDFVMDGSQPLDPRKTIFVGGVPRPLRAVELAMIMDRLYGGVCYAGIDTDPELKYPKGAGRVAFSNQQSYIAAISARFVQLQHGEIDKRVEVKPYVLDDQLCDECQGARCGGKFAPFFCANVTCLQYYCEYCWAAIHSRAGREFHKPLVKEGGDRPRHISFRWN

SEQ ID NO:9人CPEB4同种型e编码序列(变体5)，Genbank登录号：NM_001308193.2

ATGCACTCACTGGAGAGTTCACTCATTGACATAATGAGAGCTGAAAATGATACCATTAAAGGTCAGTCTTCACTGTTTCCAATGGAAGATGGATTCTTGGATGATGGCCGTGGGGATCAGCCTCTTCATAGTGGCCTGGGTTCACCTCACTGCTTCAGTCACCAGAATGGGGAAAGAGTGGAACGATATTCTCGAAAGGTGTTTGTAGGCGGATTGCCTCCAGACATTGATGAAGATGAGATCACAGCTAGTTTTCGTCGCTTTGGCCCTCTGATTGTGGATTGGCCTCATAAAGCTGAGAGCAAATCCTATTTTCCTCCTAAAGGCTATGCATTCCTGCTGTTTCAAGATGAAAGCTCTGTGCAGGCTCTCATTGATGCATGCATTGAAGAAGATGGAAAACTCTACCTTTGTGTATCAAGTCCCACTATCAAGGATAAGCCAGTCCAGATTCGGCCTTGGAATCTCAGTGACAGTGACTTTGTGATGGATGGTTCACAGCCACTTGACCCACGAAAAACTATATTTGTTGGTGGTGTTCCTCGACCATTACGAGCTGTGGAGCTTGCGATGATAATGGATCGGCTATATGGAGGTGTGTGCTACGCTGGGATTGATACCGACCCTGAGCTAAAATACCCAAAAGGAGCTGGGAGAGTTGCGTTCTCTAATCAACAGAGTTACATAGCTGCTATCAGTGCCCGCTTTGTTCAGCTGCAGCATGGAGAGATAGATAAACGGGTGGAAGTTAAGCCATATGTCTTGGATGATCAGCTGTGTGATGAATGTCAGGGGGCCCGTTGTGGGGGGAAATTTGCTCCATTTTTCTGTGCTAATGTTACCTGTCTGCAGTATTACTGTGAATATTGCTGGGCTGCTATCCATTCTCGTGCTGGCAGGGAATTCCACAAGCCCCTGGTGAAGGAAGGCGGTGACCGCCCTCGGCATATTTCATTCCGCTGGAACTAA

SEQ ID NO:10人CPEB4同种型e(变体5)的氨基酸序列，Genbank登录号：NP_001295122.1

MHSLESSLIDIMRAENDTIKGQSSLFPMEDGFLDDGRGDQPLHSGLGSPHCFSHQNGERVERYSRKVFVGGLPPDIDEDEITASFRRFGPLIVDWPHKAESKSYFPPKGYAFLLFQDESSVQALIDACIEEDGKLYLCVSSPTIKDKPVQIRPWNLSDSDFVMDGSQPLDPRKTIFVGGVPRPLRAVELAMIMDRLYGGVCYAGIDTDPELKYPKGAGRVAFSNQQSYIAAISARFVQLQHGEIDKRVEVKPYVLDDQLCDECQGARCGGKFAPFFCANVTCLQYYCEYCWAAIHSRAGREFHKPLVKEGGDRPRHISFRWN