一种双层水凝胶生物活性支架及其制备方法和应用
文献发布时间:2024-05-24 17:48:49
技术领域
本发明属于生物活性支架技术领域,具体涉及一种双层水凝胶生物活性支架及其制备方法和应用。
背景技术
随着社会人口老龄化及运动损伤的增多,骨关节病变的发生率在不断上升,严重影响着人类生活质量。各种退变性疾病以及创伤性损害,随着年龄增加而发生软骨组织的自然磨损导致骨关节炎发生,是骨软骨损害的主要原因。
目前针对软骨损伤的治疗可概括为三类:①骨髓刺激技术:钻孔术、微骨折术、自体基质诱导软骨再生等;②直接软骨替代:骨软骨移植、马赛克移植等;③细胞疗法:自体软骨细胞移植、基质诱导自体软骨细胞移植等。这些治疗方式具有供体来源有限、治疗部位易病变、大面积损伤(>2cm
发明内容
本发明的目的在于构建一种新型的一种双层水凝胶生物活性支架,并将其应用于关节软骨缺损的修复。
为了达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:一种双层水凝胶生物活性支架的制备方法,该方法具体为:先采用生物打印工艺对第一生物水凝胶进行沉积,形成软骨层;再在所述软骨层上采用生物打印工艺对第二生物水凝胶进行沉积,形成软骨下骨层,即得到双层水凝胶生物活性支架;
其中,所述软骨层的孔径为100-300um;所述软骨下骨层的孔径为300-600um。
优选地,所述第一生物水凝胶和第二生物水凝胶均为可光固化成型的生物墨水。
优选地,所述第一生物水凝胶是以甲基丙烯酸化明胶为原料制成;所述第二生物水凝胶是以甲基丙烯酸化海藻酸盐为原料制成。
优选地,所述第一生物水凝胶是由甲基丙烯酸化明胶前驱体溶液与光引发剂I2959混合后,采用365nm的紫外照射进行光聚合制成。
优选地,所述第二物水凝胶是由甲基丙烯酸化海藻酸盐前驱体溶液与光引发剂I2959混合后,采用365nm的紫外照射进行光聚合制成。
优选地,所述甲基丙烯酸化明胶前驱体溶液中甲基丙烯酸化明胶的质量浓度为8~12%;所述甲基丙烯酸化海藻酸盐前驱体溶液中甲基丙烯酸化海藻酸盐的质量浓度为1~3%。
优选地,所述甲基丙烯酸化明胶是通过将甲基丙烯酸酯单体和明胶在40~60℃的CB缓冲液中溶解2~4h,得到甲基丙烯酸酯与明胶的胺基反应后的甲基丙烯酸酐化明胶。
优选地,所述甲基丙烯酸化海藻酸盐是采用甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐结合被1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活海藻酸钠的羧基后得到的。
本发明的第二技术方案是这样实现的:一种采用上述制备方法制得的双层水凝胶生物活性支架,该双层水凝胶生物活性支架具有多孔结构。
本发明的第三技术方案是这样实现的:一种上述双层水凝胶生物活性支架在创面修复中的应用。
与现有技术相比,本发明在制备双层水凝胶生物活性支架的过程中,通过采用第一生物水凝胶和第二生物水凝胶分别沉积形成软骨层和软骨下骨层,并且将软骨层的孔径设置为100-300um,将软骨下骨层的孔径设置为300-600um,使得获得的双层水凝胶生物活性支架具有较好的生物相容性,对创面渗出液具有吸附效果,进而在修复创面时,为提供修复能力奠定了基础;此外,本发明获得的双层水凝胶生物活性支架,具有多孔结构,软骨层的孔径为100-300um,软骨下骨层的孔径为300-600um,有利于细胞及其生长因子在多孔结构中缓慢释放到关节缺损的位置,达到一个长效修复的效果。
附图说明
图1为本发明实施例获得的双层水凝胶生物活性支架示意图;
图2为本发明实施例获得的双层水凝胶生物活性支架下层软骨示意图,其中:A为支架下层软骨下骨层示意图;B为支架下层软骨层示意图;
图3为本发明实施例中动物实验模型制备流程示意图,其中:A为大鼠的膝关节软骨造软骨缺损的示意图;B为软骨缺损(直径3mm,深度2mm,属于大面积深度缺损)的示意图;C为将样品植入缺损部位的示意图;
图4为大鼠软骨修复示意图;
图5为大鼠软骨修复示意图,其中:A为大鼠软骨修复的HE检测示意图;B为大鼠软骨修复的苯胺蓝检测示意图;
图6为细胞在材料表面生长情况示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
在本发明的描述中,需要明确的是,术语“垂直”、“横向”、“纵向”、“前”、“后”、“左”、“右”、“上”、“下”、“水平”等指示方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系,仅仅是为了便于描述本发明,而不是意味着所指的装置或元件必须具有特有的方位或位置,因此不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中,需要说明的是,除非另有明确的规定和限定,术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解,例如,可以是固定连接,也可以是可拆卸连接,或一体地连接;可以是直接相连,也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言,可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本发明实施例提供的一种双层水凝胶生物活性支架的制备方法,该方法具体为:先采用生物打印工艺对第一生物水凝胶进行沉积,形成软骨层;再在所述软骨层上采用生物打印工艺对第二生物水凝胶进行沉积,形成软骨下骨层,即得到双层水凝胶生物活性支架;
其中,所述软骨层的孔径为100-300um;所述软骨下骨层的孔径为300-600um。
所述第一生物水凝胶和第二生物水凝胶均为光固化成型的生物墨水;所述第一生物水凝胶是以甲基丙烯酸化明胶为原料制成;所述第二生物水凝胶是以甲基丙烯酸化海藻酸盐为原料制成;所述第一生物水凝胶是由甲基丙烯酸化明胶前驱体溶液与光引发剂I2959混合后,采用365nm的紫外照射进行光聚合制成;所述第二物水凝胶是由甲基丙烯酸化海藻酸盐前驱体溶液与光引发剂I2959混合后,采用365nm的紫外照射进行光聚合制成;所述甲基丙烯酸化明胶前驱体溶液中甲基丙烯酸化明胶的质量浓度为8~12%;所述甲基丙烯酸化海藻酸盐前驱体溶液中甲基丙烯酸化海藻酸盐的质量浓度为1~3%;
所述甲基丙烯酸化明胶是通过将甲基丙烯酸酯单体和明胶在40~60℃的CB缓冲液中溶解2~4h,得到甲基丙烯酸酯与明胶的胺基反应后的甲基丙烯酸酐化明胶;通过调整添加到反应混合物中甲基丙烯酸酯(MA)的量,可以在甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)中实现不同程度的甲基丙烯酰基取代,从而产生具有不同物理特性的甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)。由于在明胶分子骨架上引入甲基丙烯酰基团取代明胶分子中的氨基,甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)获得了具有一定的光敏性,在光引发剂和一定波长的光照射下甲基丙烯酸酯基团会发生交联,形成具有可调机械性能的水凝胶;
所述甲基丙烯酸化海藻酸盐是采用甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐结合被1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活海藻酸钠的羧基后得到的;通过调整反应混合物中甲基丙烯酸化海藻酸盐(AEMA)的量可以获得不同的甲基丙烯酸化程度,最终得到具有不同的物理和机械性能的甲基丙烯酸化海藻酸盐(AEMA)。甲基丙烯酸化度可以根据海藻酸盐中被甲基丙烯酸酯基团取代的羧基的百分比来判断,并且使用
本实施例关于生物医用材料具体如下:
明胶来源广泛,具有非常好的生物相容性、亲水性、可生物降解性,而且可塑性强,是常用于软骨再生的一种水凝胶材料。不过明胶本身机械性能较差,受热时不稳定,可通过改性或者复合其它材料来提升。目前常用的是将明胶甲基丙烯酸酯化后利用紫外光交联的方式提升其生物力学强度。另外,明胶也可以使用戊二醛作为交联剂来提升材料的机械强度。但是,用戊二醛作为交联剂会显著降低明胶的粘性和弹性,而且戊二醛有毒性对细胞生长影响较大。明胶因为富含氨基、羧基、酰胺基等基团,所以目前较多的研究集中于利用接枝甲基丙烯酸酯,通过光聚合来交联增强明胶的力学强度,可以有效避免化学的交联剂对细胞的毒性作用。Chen等人通过光固化3D打印工艺生成了软骨细胞外基质/甲基丙烯酸明胶外泌体负载支架。植入体内的支架有效修复软骨细胞线粒体功能障碍,强化软骨,显著促进兔关节软骨缺损的软骨再生。Zhang等人采用光固化3D打印技术制作了3D的聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)网格支架。PEGDA网格支架用作软骨支架的机械支撑。而后用甲基丙烯酸化明胶(GelMA)/海藻酸盐复合水凝胶包裹细胞,然后将带有细胞的甲基丙烯酸化明胶(GelMA)/海藻酸盐复合水凝胶填充到聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)网格支架中,制备出一种生物相容性好、机械性能强、可促进细胞粘附、可降解的软骨支架。高等人制造了一体化的交联的甲基丙烯酸化明胶(GelMA)和GelMA-羟基磷灰石(HAp)的双层水凝胶支架,以评估3D打印细丝的间距对兔模型中骨软骨再生的影响。间距适中的多孔支架具有较好的软骨腔的软骨再生和软骨下骨的形成。因此,甲基丙烯酸化明胶(GelMA)水凝胶流变性能的控制可用于改进3D打印,而连续3D打印产生的一体化双层混合支架有望作为再生关节软骨的生物材料。
藻酸盐(Alg),它是从褐藻、海苔、日本海带、子囊菌和大孢子虫等海藻中提取的物质,Alg是含有(1,4)-D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸残基的线性共聚物,与二价阳离子(例如Ca
以下为具体实施例
实施例1
本发明实施例1提供的双层水凝胶生物活性支架是通过如下方法制得:
先采用生物打印工艺对由甲基丙烯酸化明胶为原料制成的第一生物水凝胶进行沉积,形成软骨层;再在所述软骨层上采用生物打印工艺对由甲基丙烯酸化海藻酸盐为原料制成的第二生物水凝胶进行沉积,形成软骨下骨层,且所述软骨层的孔径为200um;所述软骨下骨层的孔径为500um,即得到双层水凝胶生物活性支架;
其中,所述第一生物水凝胶是由质量浓度为10%的甲基丙烯酸化明胶前驱体溶液与光引发剂I2959混合后,采用365nm的紫外照射进行光聚合制成;所述第二物水凝胶是由质量浓度为2%的甲基丙烯酸化海藻酸盐前驱体溶液与光引发剂I2959混合后,采用365nm的紫外照射进行光聚合制成;所述甲基丙烯酸化明胶是通过将甲基丙烯酸酯单体和明胶在50℃的CB缓冲液中溶解3h,得到甲基丙烯酸酯与明胶的胺基反应后的甲基丙烯酸酐化明胶;所述甲基丙烯酸化海藻酸盐是采用甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐结合被1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活海藻酸钠的羧基后得到的。
实施例2
本发明实施例2提供的双层水凝胶生物活性支架是通过如下方法制得:
先采用生物打印工艺对由甲基丙烯酸化明胶为原料制成的第一生物水凝胶进行沉积,形成软骨层;再在所述软骨层上采用生物打印工艺对由甲基丙烯酸化海藻酸盐为原料制成的第二生物水凝胶进行沉积,形成软骨下骨层,且所述软骨层的孔径为100um;所述软骨下骨层的孔径为300um,即得到双层水凝胶生物活性支架;
其中,所述第一生物水凝胶是由质量浓度为8%的甲基丙烯酸化明胶前驱体溶液与光引发剂I2959混合后,采用365nm的紫外照射进行光聚合制成;所述第二物水凝胶是由质量浓度为1%的甲基丙烯酸化海藻酸盐前驱体溶液与光引发剂I2959混合后,采用365nm的紫外照射进行光聚合制成;所述甲基丙烯酸化明胶是通过将甲基丙烯酸酯单体和明胶在40℃的CB缓冲液中溶解2h,得到甲基丙烯酸酯与明胶的胺基反应后的甲基丙烯酸酐化明胶;所述甲基丙烯酸化海藻酸盐是采用甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐结合被1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活海藻酸钠的羧基后得到的。
实施例3
本发明实施例3提供的双层水凝胶生物活性支架是通过如下方法制得:
先采用生物打印工艺对由甲基丙烯酸化明胶为原料制成的第一生物水凝胶进行沉积,形成软骨层;再在所述软骨层上采用生物打印工艺对由甲基丙烯酸化海藻酸盐为原料制成的第二生物水凝胶进行沉积,形成软骨下骨层,且所述软骨层的孔径为300um;所述软骨下骨层的孔径为600um,即得到双层水凝胶生物活性支架;
其中,所述第一生物水凝胶是由质量浓度为12%的甲基丙烯酸化明胶前驱体溶液与光引发剂I2959混合后,采用365nm的紫外照射进行光聚合制成;所述第二物水凝胶是由质量浓度为3%的甲基丙烯酸化海藻酸盐前驱体溶液与光引发剂I2959混合后,采用365nm的紫外照射进行光聚合制成;所述甲基丙烯酸化明胶是通过将甲基丙烯酸酯单体和明胶在60℃的CB缓冲液中溶解4h,得到甲基丙烯酸酯与明胶的胺基反应后的甲基丙烯酸酐化明胶;所述甲基丙烯酸化海藻酸盐是采用甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐结合被1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活海藻酸钠的羧基后得到的。
实施例4
本发明实施例4提供的双层水凝胶生物活性支架是通过如下方法制得:
先采用生物打印工艺对由甲基丙烯酸化明胶为原料制成的第一生物水凝胶进行沉积,形成软骨层;再在所述软骨层上采用生物打印工艺对由甲基丙烯酸化海藻酸盐为原料制成的第二生物水凝胶进行沉积,形成软骨下骨层,且所述软骨层的孔径为200um;所述软骨下骨层的孔径为500um,即得到双层水凝胶生物活性支架;
其中,所述第一生物水凝胶是由质量浓度为12%的甲基丙烯酸化明胶前驱体溶液与光引发剂I2959混合后,采用365nm的紫外照射进行光聚合制成;所述第二物水凝胶是由质量浓度为1%的甲基丙烯酸化海藻酸盐前驱体溶液与光引发剂I2959混合后,采用365nm的紫外照射进行光聚合制成;所述甲基丙烯酸化明胶是通过将甲基丙烯酸酯单体和明胶在40℃的CB缓冲液中溶解4h,得到甲基丙烯酸酯与明胶的胺基反应后的甲基丙烯酸酐化明胶;所述甲基丙烯酸化海藻酸盐是采用甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐结合被1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活海藻酸钠的羧基后得到的。
实施例5
本发明实施例5提供的双层水凝胶生物活性支架是通过如下方法制得:
先采用生物打印工艺对由甲基丙烯酸化明胶为原料制成的第一生物水凝胶进行沉积,形成软骨层;再在所述软骨层上采用生物打印工艺对由甲基丙烯酸化海藻酸盐为原料制成的第二生物水凝胶进行沉积,形成软骨下骨层,且所述软骨层的孔径为200um;所述软骨下骨层的孔径为500um,即得到双层水凝胶生物活性支架;
其中,所述第一生物水凝胶是由质量浓度为8%的甲基丙烯酸化明胶前驱体溶液与光引发剂I2959混合后,采用365nm的紫外照射进行光聚合制成;所述第二物水凝胶是由质量浓度为3%的甲基丙烯酸化海藻酸盐前驱体溶液与光引发剂I2959混合后,采用365nm的紫外照射进行光聚合制成;所述甲基丙烯酸化明胶是通过将甲基丙烯酸酯单体和明胶在60℃的CB缓冲液中溶解2h,得到甲基丙烯酸酯与明胶的胺基反应后的甲基丙烯酸酐化明胶;所述甲基丙烯酸化海藻酸盐是采用甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐结合被1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活海藻酸钠的羧基后得到的。
为了验证本发明实施例获得的双层水凝胶生物活性支架的性能如何,现对实施例1获得的双层水凝胶生物活性支架进行表征,具体表征结果如下:
表1实施例1获得的双层水凝胶生物活性支架的力学测试结果
通过上表1中的数据可以,本发明获得的双层水凝胶生物活性支架力学测试达到405kPa,符合软骨植入要求。
生物相容性测试,如图2和3所示,细胞在支架材料表面可以很好的生长,繁殖,生物相容性好。
CCK-8测试生长情况,电镜看细胞在材料表面的生长情况。在大鼠体内进行一个降解测试。以及体内的生物相容性测试。
大鼠的软骨缺损修复测试,如图4所示,
此外,需要注明的是:本发明实施例中的水凝胶由甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)或甲基丙烯酸化海藻酸盐(AEMA)前驱体溶液与光引发剂I2959,然后注入打印机装料槽中,在打印过程中,使用365nm的紫外照射进行光聚合制成(如图1所示)。打印的形状设置为立方体(长宽为=25毫米,高度=10.0毫米),打印出来后进行进一步的压缩测试。
根据前期研究测试的水凝胶负荷强度与细胞在低粘度前体溶液中更易增殖、分化等因素,最终选定GelMA(G10,10%w/v)与ALMA(A2,2%w/v)来作为制备双层水凝胶支架的前体溶液,并对制备完成的双层水凝胶支架进行机械强度测试。用动态机械分析仪(DMA)对样品凝胶化以10%应变/分钟进行压载测试,并计算在从10%到20%的应变区间内的弹性模量。
此外,本实施例还提供了将上述获得的双层水凝胶生物活性支架在关节软骨缺损修复中的应用,具体的应用步骤为:
将3D生物打印的双层水凝胶生物活性支架填充软骨缺损位置,在修复12周后,达到良好的修复效果,组织切片显示关节缺损修复良好,HE染色,甲苯胺蓝染色,番红O染色显示成软骨细胞呈有序排列,I型胶原有序排列,关节软骨组织修复良好,具体详见图5和图6所示。
综上所述,本发明在制备双层水凝胶生物活性支架的过程中,通过采用第一生物水凝胶和第二生物水凝胶分别沉积形成软骨层和软骨下骨层,并且将软骨层的孔径设置为100-300um,将软骨下骨层的孔径设置为300-600um,使得获得的双层水凝胶生物活性支架具有较好的生物相容性,对细胞及其生长因子具有归巢效果,进而在软骨修复时,提供修复能力奠定了基础;此外,本发明获得的双层水凝胶生物活性支架,具有多孔结构,软骨层的孔径为100-300um,软骨下骨层的孔径为300-600um,有利于细胞及其生长因子在多孔结构中缓慢释放到关节软骨缺损位置,达到一个长效修复的效果。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
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