一种多年生型水稻雌性核不育系的选育方法

技术领域

本发明涉及一种多年生型水稻雌性核不育系的选育方法，属于水稻遗传育种技术领域。

技术背景

现代社会，持续增加的人口和粮食需求与气候变化、资源匮乏、土地低利用率等问题的矛盾日益突出，传统的一年生作物种植体系使人类赖以生存的农业生态系统受到不可持续的冲击，生物多样性面临严重危机，未来将逐渐难以满足人类社会的生产需求(田超,靳嵩,李集临等.多年生作物的研究进展[J].中国农学通报,2013,29(18):16-20.；RascheF,Blagodatskaya E,Emmerling C,et al.A preview of perennial grain agriculture:knowledge gain from biotic interactions in natural and agriculturalecosystems[J].Ecosphere,2017,8(12):e02048.)。与一年生作物相比，多年生作物以其生长季节长、根系发达、抗逆性强、土壤利用率高以及耕作管理简单等优势受到世界各国关注(Godfray H C J,Beddington J R,Crute I R,et al.Food Security:The Challenge ofFeeding 9Billion People[J],Science,2010(327):812.；Tilman D,Socolow I L,FoleyJ A,et al.Beneficial biofuels-the food,energy,and environment trilcmma[J].Science,2009(325):270-271；Jerry D G,John P R.Perennial Grains Food Securityfor the Future[R].Issues In Science And Technology,winter,2010:42-47.)。目前，多年生作物的创造主要通过直接驯化野生种或一年生栽培种与近源野生种进行远缘杂交两种途径。

江西东乡普通野生稻(Oryza.rufipogon Griff)是迄今世界分布最北的普通野生稻，其自然群体内植株完全依靠休眠芽进行无性繁殖，再生能力强，表现为多年生普通野生稻特性，并具有极强的抗寒、耐旱、抗病虫等抗逆特性(肖晗,应存山.东乡野生稻自然群体内的形态性状变异调查[J].中国水稻科学,1996(4).；陈大洲,张巴克,熊文华等.东乡野生稻种质资源研究与利用进展[J].江西农业学报,2008,20(12):12-16.)。自然条件下，江西东乡普通野生稻植株能够耐受-8.5℃低温越冬存活，并在来年春天发芽(何光存,舒理慧,周一强,等.东乡野生稻在武汉地区越冬性能的观察[J].武汉大学学报(理学版),1996(2):252-254.)。

国内学者对于江西东乡普通野生稻的耐寒性做了比较多的研究。如利用其耐寒越冬特性育成了耐冷再生粳稻品种，如“东野一号”等(陈大洲,肖叶青,皮勇华,等.东乡野生稻耐冷性的遗传改良初步研究[J].江西农业大学学报,2003,25(1):8-11.；陈大洲,肖叶青,皮勇华，等.越冬粳稻品种"东野一号"的选育[J].作物研究,2007,21(3).)。还有学者对其越冬(overwintering)性状进行了QTL定位(Liang Y,Zheng J,Yan C,et al.LocatingQTLs controlling overwintering trait in Chinese perennial Dongxiang wild rice[J].MGG Molecular & General Genetics,2017,293(392):1-13.)。

目前，直接利用江西东乡普通野生稻多年生宿根性的研究较少，在申请号为CN201010283755.9“一种多年生水稻自然越冬稻蔸及其活力鉴定方法”的发明专利中，江西省农业科学院水稻研究所提出利用栽培稻与强耐冷的东乡野生稻进行有性杂交、回交，其后代留蔸自然条件下越冬，次年春，稻蔸休眠芽萌发成苗，通过对稻蔸活力进行鉴定，进而选育多年生耐冷后代。该方法采用留蔸越冬筛选，需要等来年春季休眠芽发芽后进行鉴定，执行周期较长。水稻雌性核不育突变体，雌性核不育基因fst

水稻雌性核不育自然突变体(female-sterile,fst)雌性器官完全败育，由于FST基因MADS-box区域的8bp碱基缺失造成移码突变，导致胚珠发育异常以及合子胚和胚乳完全败育，尽管雄性器官发育正常，花药开裂散粉正常，花粉量充足，花粉可育率大于90％，但无法通过获得种子进行有性繁殖(Lee D S.,Chen L J.,Ha W G.et al.Single RecessiveGenetic Female Sterility In Rice.International Rice Research Notes,2002,27:22-23.；Lee DS.,Chen LJ.,Li CY.,et al.The B

以上现有方法和技术中，对江西东乡普通野生稻宿根性、多年生特性利用很少，同时现有雌性核不育水稻繁殖技术复杂、纯度有限，实际应用局限性较大。如果能有效利用东乡普通野生稻强宿根、多年生特性，创造一种多年生型水稻雌性核不育系显得十分必要。

发明内容

为充分利用江西东乡普通野生稻多年生宿根再生特性解决水稻雌性核不育系繁殖技术问题，本发明提供一种多年生型水稻雌性核不育系的选育方法。将江西东乡野生稻强宿根性这一多年生习性，通过杂交方法引入雌性核不育水稻中，同时聚合栽培稻的优良特性，培育具有多年生习性、能够无性繁殖的水稻雌性核不育系，在大田生产中可实现轻简化栽培。同时，由于本发明多年生型水稻雌性核不育系自身完全不结实，可在杂交水稻种子生产中作为理想的花粉供体，不用单收父本，有利于机械化制种，提高种子纯度，并为推进杂种优势利用技术体系的创新发展奠定了良好基础。为解决上述技术问题和实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种多年生型水稻雌性核不育系的选育方法，包括如下步骤：

(1)选用江西东乡普通野生稻作母本，用水稻雌性核不育突变体作父本进行杂交；

(2)对上述步骤(1)中获得的单交子代F

(3)结合多年生习性的表型鉴定和水稻雌性不育基因FST分子鉴定的方法辅助选择，在上述步骤(2)所述F

(4)在步骤(3)所述的第一聚合杂交F

或(5)结合育种目标，在步骤(3)所述的第一聚合杂交F

(6)从步骤(4)所述的第一聚合杂交F

(7)以步骤(6)所述按株系种植50-100株自交加代的株系，结合育种目标，采用多年生习性和雌性核不育败育表型鉴定，继续选择具有多年生习性的雌性核不育育性分离株系，从每个育性分离群体中选择5个以上可育单株，按株系种植50-100株自交加代，直至加代到F

进一步，所述多年生型雌性核不育系包含fst基因突变位点。

进一步，步骤(1)中所述的水稻雌性核不育突变体为G39。

本发明还提供了采用上述多年生型水稻雌性核不育系的选育方法在进一步选育水稻品种中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.江西东乡普通野生稻为多年生型，耐冷性强，具有以休眠芽越冬，次年再次萌发成苗的多年生特性，利用杂交育种、聚合育种方法将该特性转入雌性核不育系水稻中，育成具有宿根、越年再生等多年生习性的水稻雌性核不育系，同时可以通过无性繁殖手段解决雌性核不育系的繁殖问题。

2.在多年生型水稻雌性核不育系选育过程中，杂交后代成熟期可在纯合体雌性核不育株基部观察到新生分蘖，即表现出多年生习性，有利于直接对性状进行筛选；同时，将稻蔸保留在田中，通过常规肥水管理，稻桩休眠芽越季再生。

3.本发明选育的多年生型水稻雌性核不育系，雌性器官100％败育，天然自交和/或异交结实率为0，花粉量充足且正常可育，由于自身完全不结实，可在杂交水稻种子生产中作为理想的花粉供体，不用单收父本，有利于机械化制种，提高种子纯度，并为推进杂种优势利用技术体系的创新发展奠定了良好基础。

4.培育的多年生型水稻雌性核不育系可在东南亚热带、亚热带地区推广应用，利用其宿根再生特性，可在杂交稻制种田中留桩再生，一次栽秧，多季使用，节约生产成本，提高生产效率。

附图说明

图1：多年生雌性核不育系宿根再生特征。其中，A:多年生型雌性核不育系云岭301FS成熟期株型，a：云岭301FS成熟期新生分蘖局部放大图；B:多年生型雌性核不育系云岭314FS成熟期株型，b：云岭301FS成熟期新生分蘖局部放大图。

图2：多年生雌性核不育系越年再生长势表现。C:云岭301FS田间越年再生长势；D:云岭314FS田间越年再生长势。

图3：云岭301FS系谱图。

图4：云岭314FS系谱图。

具体实施方式

术语：

多年生或多年生习性：是指江西东乡普通野生稻或通过江西东乡普通野生稻与栽培稻杂交后代选育的具有强宿根性，在成熟期仍能产生新生分蘖、稻桩可多年越年再生的特性(图1)。

FST基因：野生型FST基因，英文全称FEMALE-STERILE，GeneBank注册编号：DQ004266。

雌性核不育基因fst或fst基因：FST基因的突变型，用小写字母表示。

雌性核不育或雌性核不育系：是指杂交或回交后代具有fst基因突变位点的植株或株系,其基因型纯合(-/-)；而与之对应的近等位基因系即雌性可育株系，其基因型杂合或纯合(-/+或+/+)。

多年生型雌性核不育系：是指在成熟期时仍不断产生新分蘖，具有江西东乡普通野生稻宿根越年再生的多年生习性和fst基因的雌性核不育系。

下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有的常规方法，所使用的试剂和水稻材料，如无特殊说明，均可通过商业途径或按国家相关规定获得。

所述的昆明温室是云南省昆明市云南农业大学稻作研究所的温室。试验在云南省昆明市、云南省元江县、云南省元阳县、云南省楚雄彝族自治州禄丰县进行。

合系41：粳稻品种(刘吉新,赵国珍,蒋志农等.云南广适性高产耐寒抗病粳稻新品种合系41号的选育[J].西南农业学报,2002,15(004):5-9.)，可通过商业渠道购买(市售)。

以下水稻材料在如下非专利文献公开，申请人有保存可提供，联系地址：云南省昆明市盘龙区沣源路452号，云南农业大学(可注明：云南农业大学稻作研究所)，邮政编码：650201。

Hwaseonchalbyeo：优质粳稻品种(Moon,H.P.,Cho,S.Y.,Kim,H.Y.,et al.AnAnther-derived Disease Resistance and High Quality Glutinous Rice Variety"Hwaseonchalbyeo"[J].RDA journal of agricultural science,1993.)。

Ansanbyeo：优质粳稻品种(Choi,H.C.,Kim,Y.K.,Ahn,S.N.,et al.A newLodging-resistant and High-yielding Rice Cultivar Adaptable to DirectSeeding"Ansanbyeo"[J].rda journal of crop science,1997.)。

G39：雌性核不育自然突变体(Lee,D.S.,Chen,L.J.,Li,C.Y.,et al.The BsisterMADS Gene FST Determines Ovule Patterning and Development of the ZygoticEmbryo and Endosperm[J].PLoS ONE,2013,8(3),26-33)。

AWG，粳稻育种中间品系，又名AWG-cyncyn。(Chen,L.J.,Lee,D.S.,Tan,X.L.,etal,Characterization of Female-sterile Rice and its Great Potential forInnovation of Seed Production Technology of Hybrid Rice,InternationalSymposium on“100years of Rice Science and Looking Beyond”,India,2012)。

CH8，又名Sanghaehyangheolua：粳稻品种(Nadir,S.,Li,W.,Zhu,Q.,et al.Anovel discovery of a long terminal repeat retrotransposon-induced hybridweakness in rice[J].Journal of Experimental Botany,2019,70(4),1197–1207.)。

Gayabyeo：籼粳中间型品种(Jeon,Y.,Ahn,S.,Choi,H.et al.Identification ofa RAPD marker linked to a brown plant hopper resistance gene in rice[J].Euphytica,1999,107,23–28.)。

以下实施例所述的水稻雌性不育基因FST分子鉴定的方法辅助选择(相关附图中表示为MAS，即Marker-assisted selectiong，MAS)：即为本申请人申请的专利号为CN101654703B的专利文献公开的发明名称为“水稻雌性不育基因FST分子鉴定的方法”，可以准确、快速、高效的通过FST基因的特异性引物筛选获得雌性不育基因FST的野生型(+/+)、突变型(-/-)以及杂合型(+/-)的水稻植株。所述水稻雌性不育基因FST分子鉴定的方法辅助选择(MAS)具体方法为：取待鉴定水稻材料叶片，提取水稻总DNA，利用雌性核不育基因FST的四条特异性引物：Gf1引物、Gr1引物、Jf1引物和Jr1引物对所述水稻总DNA进行PCR扩增，PCR反应后加入3μl的loading buffer混匀上样6μl，用含EtBr 0.1μg/ml的2％琼脂糖凝胶，1×TAE buffer、125V电泳40min；紫外透射仪上检测。扩增体系总体积为15μl，其中，ddH

Gf1引物的序列如SEQ ID NO：1所示，Gr1引物的序列如SEQ ID NO：2所示，Jf1引物的序列如SEQ ID NO：3所示，Jr1引物的序列如SEQ ID NO：4所示。

以下通过具体实施方式对本发明作进一步说明，这些说明只是示例性的，并非是对本发明的限制，基于本发明中的实施例，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属本发明的保护范围。

实施例1：多年生型水稻雌性核不育品系云岭301FS的选育方法

(1)2006年昆明温室，用江西东乡普通野生稻(Dongxiang wild rice，DXWR)作母本，用雌性核不育自然突变体G39单株作父本进行杂交，获得单交子代F

(2)2007年在昆明温室种植单交子代F

(3)2008年在昆明种植杂交种F

(4)2009年在昆明种植双交子代F1，再用前期获得的育种中间品系(Hwaseonchalbyeo/Ansanbyeo)F

(5)2010年在昆明种植三交子代F

(6)自2012年起，通过在元江县、元阳县早/晚双季种植聚合杂交后代，结合多年生习性和雌性不育败育表型鉴定，筛选具有多年生习性的雌性核不育育性分离株系，各世代从每个育性分离群体中选择5个以上可育单株，继续按株系种植50-100株自交加代，到2017年杂合株系已自交至F

云岭301FS不育系株高适中、平均株高104.7cm，平均穗长26.6cm，无包穗，单穗粒数平均266，有短顶芒，单株平均分蘖数约30，分蘖力强、连续越年再生性好，单株有效穗数平均约29，剑叶挺直、叶色鲜绿、茎秆壮、田间表现抗稻瘟病和白叶枯病。开花期所有植株雄性器官发育正常、花药肥大、呈嫩黄色、开裂散粉正常、花粉量充足，花粉可育率平均为93.8％；成熟期稻穗完全不育、天然自交/异交结实率为0，不育株率及不育度均达100％。其近等基因系米粒短圆、透明，平均直连淀粉含量15.6％、蛋白质含量9.5％、米质较优。

云岭301FS系谱图见图3。

实施例2：多年生型水稻雌性核不育品系云岭314FS的选育方法

(1)2006年昆明温室，用江西东乡普通野生稻(Dongxiang wild rice，DXWR)作母本，用雌性核不育自然突变体G39单株作父本进行杂交，获得单交子代F

(2)2007年在昆明温室种植单交子代F

(3)2008年在昆明种植杂交种F

(4)2009年在昆明种植双交子代F

(5)自2011年起通过在昆明市正季及元江县、元阳县早/晚季连续种植聚合杂交后代，结合多年生习性的表型鉴定和雌性不育败育表型鉴定，筛选具有多年生习性的雌性核不育育性植株分离株系，各世代从每个育性分离群体中选择7-10个可育单株，继续按株系种植60-100株自交加代，到2017年杂合株系已自交至F

云岭314FS不育系不育性稳定，2017年起在昆明市、禄丰县大田稻桩移栽雌不育株，自然繁殖检查结果表明：开花期所有植株雄性器官发育正常、花药肥大、呈嫩黄色、开裂散粉正常、花粉量充足，花粉可育率平均为96.8％；成熟期稻穗完全不育、天然自交/异交结实率为0，不育株率及不育度均达100％。

云岭314FS不育系株高适中、平均株高92.7cm，平均穗长24.7cm，无包穗、单穗粒数平均174，单株有效穗数平均约13，有短顶芒，单株平均分蘖数约26，分蘖力强、连续越年再生性好，剑叶挺直、叶色鲜绿、茎秆壮、田间表现抗稻瘟病和白叶枯病；其近等基因系米粒短圆、透明，平均直连淀粉含量15.6％、蛋白质含量9.5％、米质较优。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明；凡在本发明的精神和原则之内，本领域的技术人员对前述各实施例记载的技术方案所进行的修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 云南农业大学

<120> 一种多年生型水稻雌性核不育系的选育方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggcaggtga cattcgcggg 20

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggccgagaga aacttagccg aaaact 26

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtagccctc cccgcctc 18

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agctagttct tcatcctttc gcagcaa 27