一种牡丹花蕾提取物及其抑菌用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域；涉及一种牡丹花蕾提取物及其抑菌用途。

背景技术

随着我国大众生活水平的提高，绿色、自然、安全的健康理念逐渐为人们所接受。来自动植物等天然产物的研究开发逐渐受到国内外学术界和产业界的关注。我国拥有极其丰富的药用植物资源，而药用植物的提取物通常具有奇特的功能或疗效例如抗病毒、抗氧化、调节血脂、抑菌杀菌和增强免疫等。这其中，从药用植物中获取天然的抗菌物质逐渐成为热门的研究方向。所提取的抑菌物质可以广泛应用于各个领域，如化妆品、食品保鲜、作物防治等。因此，研究药用植物的天然植物抑菌成分，具有普遍的社会需求与令人期待的发展前景。

牡丹是毛茛目芍药科芍药属木本植物。牡丹全身都是宝。牡丹根皮，又称丹皮，具有较好的药用作用。牡丹籽油富含不饱和脂肪酸，具有极高的保健和营养价值。牡丹种荚含有植物多糖，对降血糖和提高人体免疫力具有一定的作用。牡丹花蕾富含多酚、黄酮类和花色苷物质，具有抑菌、杀菌和抗炎功效。

研究表明，牡丹花蕾中主要含有七种黄酮类物质，分别为山奈酚单糖苷、山奈酚二糖苷、芹黄素单糖苷、芹黄素二糖苷、木犀草素单糖苷、木樨草素二糖苷和木犀草素苹果酰葡萄苷。近年来的研究多涉及到具有抗菌能力的此类黄酮类物质的分离提取方法。

唐浩国等人使用乙醇溶液提取牡丹叶干粉中的总黄酮，经大孔吸附树脂HPD600和D101吸附并且使用70％的乙醇水溶液洗脱，旋转蒸发浓缩洗脱液，再经截留分子量1万道尔顿的超滤膜分离，从而将总黄酮类物质的纯度提高至40％。牡丹叶总黄酮对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌等3种细菌均有一定的抑制作用,其中对沙门氏菌的抑制作用最为显著。然而，上述方法所得到的总黄酮纯度不能令人满意，尤其是大孔吸附树脂纯化后得到的总黄酮针对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果甚至不如牡丹叶总黄酮提取液。

范敬宜等人首先以不同制膜液配比制备不同孔径的超滤膜，用于牡丹黄酮粗提液的预过滤；然后利用两级不同孔径的纳滤膜进行分级过滤－浓缩牡丹黄酮提取液，以实现牡丹黄酮的精制。最终经过超滤-纳滤组合工艺提纯后所得黄酮纯度从15.6％提升至79％。牡丹黄酮对酪氨酸酶具有明显的抑制作用，其单酚酶为4.8mg/mL，二酚酶为13.8mg/mL，与高效美白剂苯乙基间苯二酚抑制效果比较接近。然而，该超滤-纳滤组合工艺不仅需要两种较为昂贵的卷式纳滤膜组件NWCO-1000和NWCO-300，同时超滤膜也是通过自制不同铸膜液配比调控得到的PES超滤膜；工艺和装置较为复杂。此外，无论是超滤膜还是纳滤膜，使用几次都会出现大分子杂质堆积在膜表面上，从而降低膜通量和膜性能。

然而，上述现有技术所得到的牡丹黄酮类提取物针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果仍然不能令人满意。

因此，迫切需要针对上述技术缺陷，提供一种针对上述两种细菌的抑菌更好的牡丹花蕾提取物及其抑菌用途。

发明内容

本发明目的是提供一种针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌更好的牡丹花蕾提取物及其抑菌用途。

为了实现上述目的，一方面，本发明所采取的技术方案如下：

一种牡丹花蕾提取物，由包括如下步骤的制备方法得到：

(1)对牡丹花蕾干粉先进行溶剂提取，然后在保温条件下进行超声波提取，过滤得到滤液；滤液离心取上清液，冷冻干燥得到粗提物干粉；其中，所述溶剂提取为：以50-70％乙醇溶液作为提取剂进行溶剂提取，料液比为1：10-20(g/mL)，提取温度为60-80℃，所述提取时间为1-3h；超声波提取为：超声波功率为200-300W，超声时间为10-30min；

(2)将粗提物干粉溶解于50-70％乙醇溶液，二者的重量体积比为1-2mg：1mL，调节pH＝4-5，得到上样液；将DM130大孔吸附树脂浸泡在90-98％的乙醇溶液中进行预处理；采用湿法装柱，平衡层析柱8-16h上样；将上样液在预处理的DM130大孔吸附树脂上进行上样；上样液的流速为2-6BV/h；然后以50-70％乙醇溶液作为洗脱剂进行洗脱；洗脱剂的流速为2-6BV/h；

(3)收集洗脱液，调节浓缩液中总黄酮含量为1-7mg/mL，优选2-6mg/mL，更优选2-4mg/mL，得到聚酰胺树脂的上样液；将聚酰胺树脂浸泡在90-98％乙醇溶液中进行预处理；采用湿法装柱，平衡层析柱8-16h上样；将上样液在预处理的聚酰胺树脂上进行上样；上样液的流速为1-3BV/h；然后以50-70％乙醇溶液作为洗脱剂进行洗脱；洗脱剂的流速为1-3BV/h；收集洗脱液，浓缩蒸发；最后冷冻干燥得到产物干粉。

根据本发明所述的提取物，其中，所述步骤(1)中，溶剂提取为：以60％乙醇溶液作为提取剂进行溶剂提取，料液比为1：15(g/mL)，提取温度为70℃，提取时间为2h；和/或，超声波提取为：超声波功率为240W，超声时间为20min。

根据本发明所述的提取物，其中，所述步骤(2)中，粗提物干粉与50-70％乙醇溶液的重量体积比为1.5mg：1mL，调节pH＝4.5。

根据本发明所述的提取物，其中，所述步骤(2)中，将DM130大孔吸附树脂浸泡在95％的乙醇溶液中进行预处理；采用湿法装柱，平衡层析柱12h上样；和/或，上样液的流速为4BV/h；洗脱剂的流速为4BV/h。

根据本发明所述的提取物，其中，所述步骤(3)中，调节浓缩液中总黄酮含量为3mg/mL。

根据本发明所述的提取物，其中，所述步骤(3)中，上样液的流速为2BV/h；洗脱剂的流速为2BV/h；和/或，将聚酰胺树脂浸泡在95％乙醇溶液中进行预处理；采用湿法装柱，平衡层析柱12h上样。

另一方面，本发明还提供了一种上述牡丹花蕾提取物用于抑菌的用途，所述菌选自金黄色葡萄球菌。

根据本发明所述的用途，其中，所述金黄色葡萄球菌选自ATCC 25923。

又一方面，本发明还提供了一种上述牡丹花蕾提取物用于抑菌的用途，所述菌选自大肠杆菌。

根据本发明所述的用途，其中，所述大肠杆菌选自ATCC 25922。

本发明的有益技术效果是：本发明的抑菌的牡丹花蕾提取物针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌更好。

不希望局限于任何理论，本发明所采取的DM130大孔吸附树脂和聚酰胺树脂的两步树脂纯化步骤导致总黄酮纯度(含量)更高，从而带来了预料不到的技术效果。

具体实施方式

必须指出的是，除非上下文另外明确规定，否则如本说明书及所附权利要求中所用，单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”既可包括一个指代物，又可包括多个指代物(即两个以上，包括两个)。

除非另外指明，否则本发明中的数值范围为大约的，并且因此可以包括在所述范围外的值。所述数值范围可在本发明表述为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表述这样的范围时，另一个方面包括从所述一个特定值和/或至另一个特定值。相似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应当理解，所述特定值形成另一个方面。还应当理解，数值范围中每一个的端点在与另一个端点的关系中均是重要的并独立于另一个端点。

在说明书和最后的权利要求书中提及组合物或制品中特定元素或组分的重量份是指组合物或制品中该元素或组分与任何其它元素或组分之间以重量份表述的重量关系。

在本发明中，除非具体指出有相反含义，或基于上下文的语境或所属技术领域内惯用方式的暗示，否则本发明中提及的溶液均为水溶液；当水溶液的溶质为液体时，所有分数以及百分比均按体积计，且组分的体积百分比基于包含该组分的组合物或产品的总体积；当水溶液的溶质为固体时，所有分数以及百分比均按重量计，且组分的重量百分比基于包含该组分的组合物或产品的总重量。

本发明中提及的“包含”、“包括”、“具有”以及类似术语并不意欲排除任何可选组分、步骤或程序的存在，而无论是否具体公开任何可选组分、步骤或程序。为了避免任何疑问，除非存在相反陈述，否则通过使用术语“包含”要求的所有方法可以包括一个或多个额外步骤、设备零件或组成部分以及/或物质。相比之下，术语“由……组成”排除未具体叙述或列举的任何组分、步骤或程序。除非另外说明，否则术语“或”是指单独以及以任何组合形式列举的成员。

此外，本发明中任何所参考的专利文献或非专利文献的内容都以其全文引用的方式并入本发明，尤其关于所属领域中公开的定义(在并未与本发明具体提供的任何定义不一致的情况下)和常识。

在本发明中，除非另外指明，否则份数均为重量份，温度均以℃表示或处于环境温度下，并且压力为大气压或接近大气压。室温表示20-30℃。存在反应条件(例如组分浓度、所需的溶剂、溶剂混合物、温度、压力和其它反应范围)以及可用于优化通过所述方法得到的产物纯度和收率的条件的多种变型形式和组合。将只需要合理的常规实验来优化此类方法条件。

在本发明中，总黄酮含量测定方法如下：精确称量干燥后的芦丁20mg，用60％乙醇溶液溶解，定容于100mL容量瓶中，得到芦丁标准溶液，其质量浓度为0.2mg/mL。分别从芦丁标准溶液中取1、2、3、4、5、6、7mL于20mL容量瓶中，加入5％NaNO

实施例1

将牡丹花蕾60℃烘干至恒重，研磨成细粉；先以60％乙醇溶液作为提取剂进行溶剂提取，料液比为1：15(g/mL)，提取温度为70℃，提取时间为2h；然后在保温条件下进行超声波提取，超声波功率为240W，超声时间为20min，使用双层纱布过滤，得到滤液。滤液在6000rpm下离心5min，取上清液，45℃真空旋转浓缩蒸发，得到浓缩物。将浓缩物在4℃条件下静置24h，上清液冷冻干燥得到粗提物干粉。测定粗提物干粉中的总黄酮含量为13.5％。

实施例2

将DM130大孔吸附树脂(天津浩聚树脂科技有限公司)浸泡在95％的乙醇溶液中进行预处理。24h后将树脂用蒸馏水冲洗，直至流出液清亮无乙醇气味。采用湿法装柱，平衡层析柱12h上样。上样液按照下列方法制备：将实施例1的粗提物干粉溶解于60％乙醇溶液，二者的重量体积比为1.5mg：1mL，调节pH＝4.5。

将上样液以4BV(树脂床体积)/h的流速在预处理的DM130大孔吸附树脂上进行上样；然后以60％乙醇溶液作为洗脱剂并以4BV/h的流速进行洗脱；收集洗脱液，45℃真空旋转浓缩蒸发，测定并调节浓缩液中总黄酮含量为3mg/mL，得到聚酰胺树脂的上样液。

将聚酰胺树脂(中国医药(集团)上海化学试剂公司，14-30目)浸泡在95％乙醇溶液中进行预处理。24h后将树脂用蒸馏水冲洗，直至流出液清亮无乙醇气味；然后依次使用3BV的95％乙醇溶液、2BV的5％氢氧化钠溶液、1BV的蒸馏水、2BV的10％醋酸溶液洗涤；最后将树脂用蒸馏水冲洗，直至流出液为中性。采用湿法装柱，平衡层析柱12h上样。

将上样液以2BV/h的流速在预处理的聚酰胺树脂上进行上样；然后以60％乙醇溶液作为洗脱剂并以2BV/h的流速进行洗脱；收集洗脱液，45℃真空旋转浓缩蒸发；最后冷冻干燥得到产物干粉。测定产物干粉中的总黄酮含量为76.2％。

比较例1

将DM130大孔吸附树脂浸泡在95％的乙醇溶液中进行预处理。24h后将树脂用蒸馏水冲洗，直至流出液清亮无乙醇气味。采用湿法装柱，平衡层析柱12h上样。上样液按照下列方法制备：将实施例1的粗提物干粉溶解于60％乙醇溶液，二者的重量体积比为1.5mg：1mL，调节pH＝4.5。

将上样液以4BV/h的流速在预处理的DM130大孔吸附树脂上进行上样；然后以60％乙醇溶液作为洗脱剂并以4BV/h的流速进行洗脱；收集洗脱液，45℃真空旋转浓缩蒸发；最后冷冻干燥得到产物干粉。测定产物干粉中的总黄酮含量为52.7％。

比较例2

将DM130大孔吸附树脂浸泡在95％的乙醇溶液中进行预处理。24h后将树脂用蒸馏水冲洗，直至流出液清亮无乙醇气味。采用湿法装柱，平衡层析柱12h上样。上样液按照下列方法制备：将实施例1的粗提物干粉溶解于60％乙醇溶液，二者的重量体积比为1.5mg：1mL，调节pH＝4.5。

将上样液以4BV/h的流速在预处理的DM130大孔吸附树脂上进行上样；然后以60％乙醇溶液作为洗脱剂并以4BV/h的流速进行洗脱；收集洗脱液，45℃真空旋转浓缩蒸发，测定并调节浓缩液中总黄酮含量为0.5mg/mL，得到聚酰胺树脂的上样液。

将聚酰胺树脂浸泡在95％乙醇溶液中进行预处理。24h后将树脂用蒸馏水冲洗，直至流出液清亮无乙醇气味；然后依次使用3BV的95％乙醇溶液、2BV的5％氢氧化钠溶液、1BV的蒸馏水、2BV的10％醋酸溶液洗涤；最后将树脂用蒸馏水冲洗，直至流出液为中性。采用湿法装柱，平衡层析柱12h上样。

将上样液以2BV/h的流速在预处理的聚酰胺树脂上进行上样；然后以60％乙醇溶液作为洗脱剂并以2BV/h的流速进行洗脱；收集洗脱液，45℃真空旋转浓缩蒸发；最后冷冻干燥得到产物干粉。测定产物干粉中的总黄酮含量为64.1％。

比较例3

将DM130大孔吸附树脂浸泡在95％的乙醇溶液中进行预处理。24h后将树脂用蒸馏水冲洗，直至流出液清亮无乙醇气味。采用湿法装柱，平衡层析柱12h上样。上样液按照下列方法制备：将实施例1的粗提物干粉溶解于60％乙醇溶液，二者的重量体积比为1.5mg：1mL，调节pH＝4.5。

将上样液以4BV/h的流速在预处理的DM130大孔吸附树脂上进行上样；然后以60％乙醇溶液作为洗脱剂并以4BV/h的流速进行洗脱；收集洗脱液，45℃真空旋转浓缩蒸发，测定并调节浓缩液中总黄酮含量为8mg/mL，得到聚酰胺树脂的上样液。

将聚酰胺树脂浸泡在95％乙醇溶液中进行预处理。24h后将树脂用蒸馏水冲洗，直至流出液清亮无乙醇气味；然后依次使用3BV的95％乙醇溶液、2BV的5％氢氧化钠溶液、1BV的蒸馏水、2BV的10％醋酸溶液洗涤；最后将树脂用蒸馏水冲洗，直至流出液为中性。采用湿法装柱，平衡层析柱12h上样。

将上样液以2BV/h的流速在预处理的聚酰胺树脂上进行上样；然后以60％乙醇溶液作为洗脱剂并以2BV/h的流速进行洗脱；收集洗脱液，45℃真空旋转浓缩蒸发；最后冷冻干燥得到产物干粉。测定产物干粉中的总黄酮含量为59.8％。

抑菌试验

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus；SA)ATCC 25923和大肠杆菌(Escherichia coli；EC)ATCC 25922购自美国模式培养物集存库(ATCC)。将两种细菌在LB液体培养基37℃下培养12h，使用生理盐水洗涤2次，制备成1×10

结果参见表1。

表1

可以看出，相对于比较例1-3，本发明实施例1的抑菌的牡丹花蕾提取物针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌更好。不希望局限于任何理论，本发明所采取的DM130大孔吸附树脂和聚酰胺树脂的两步树脂纯化步骤导致总黄酮纯度(含量)更高，从而带来了预料不到的技术效果。

此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明的技术方案作出各种改动、替换、删减、修正或调整，这些等价技术方案同样落于本发明权利要求书所限定的范围。