一种基于DMD数字选址的叠层相位显微装置及方法

技术领域

本发明属于显微成像技术领域，具体涉及一种基于DMD数字选址的叠层相位显微装置及方法。

背景技术

在生物医学领域，大多数生物样品在可见光下是透明或半透明的，在传统显微镜下成像对比度极低，无法被有效观测。量化相位显微技术，利用穿过透明样品后的物光波相位信息，不仅可以提高成像对比度，而且可以定量获得微观物体的三维形貌与折射率分布。因此，研究新型量化相位成像技术对于生物医学、工业检测、气体流体可视化、自适应成像等领域都具有重要价值。

基于光学干涉的相位成像技术，通过记录物光与参考光干涉形成的全息图，可以再现出样品的振幅和相位分布。该技术具有极高的相位测量精度。然而，该技术大多采用物参分离的光路结构，外界环境的扰动对物光和参考光分别造成不同的影响，使得测量结果对环境振动十分敏感。因此，人们希望研究单光束量化相位显微技术，以克服环境扰动对相位成像的影响。目前常用的单光束相位成像技术大致有以下几类：

基于微透镜阵列或棱锥的波前传感技术：波前传感器主要由二维微透镜阵列和面阵CCD组成。传感器上的微透镜阵列将入射光波面分割成许多子波面。通过探测每个子波面引起的微透镜焦点的横向移动量实现对子波前的探测。这些波前探测器都具有结构简单、灵活性好、动态范围大、光学效率高、无运动部件、对环境条件要求低以及适应能力强等优点，被广泛应用于自适应光学和定量相位显微领域。然而，这些波前探测方法却具有空间分辨率受到微透镜孔径(一般为100μm左右)的限制，其分辨率无法满足对生物样品的相位成像要求的缺陷。

微分干涉显微：显微放大后的物光被分成平行的两份，两份光在某方向上错开一定的距离从而发生干涉。干涉图样反映的是被测相位在剪切方向上的导数。此外，通过对两个正交方向上的相位导数进行积分，可以获得样品的相位分布。该技术仅能能测量连续性相位物体的相位分布，但是不能对阶越型相位物体进行测量。

相衬成像：采用环状光源照明样品，同时采用一个环状相位板对物光波的零频分量进行相位延迟，从而将样品的相位信息转换为强度信息，实现了相衬显微。由于被测物体的相位和干涉图样的强度之间是非线性的，由于传统的泽尼克相衬成像只有单幅干涉图，因此只能用于定性地观测被测物体。

基于衍射光斑记录和迭代再现的单光束相位成像技术：Pedrini通过不同离焦平面的强度图像结合迭代算法再现出了样品的相位分布。鲍鹏通过记录样品在不同波长照明下的衍射图样，定量获得了样品的相位分布。此外，通过在样品平面上移动子孔径、翻转样品、对物光波进行不同的相位调制、采用不同照明方向以及结构光照明来记录所得的衍射图样，再结合类似的迭代算法都可以从衍射图像中得到相位信息。

叠层衍射成像(Ptychographic Iterative Engine，PIE)技术，通过横向移动透光小孔(探针)或移动样品本身，令入射光照射样品的不同区位，同时保证每两次移动之间照射的部位有一定面积的交叠，从而记录样品在不同照明区位下的衍射图样；之后再通过相应的重构算法，可再现出样品的振幅和相位分布。该技术具有结构简单、对光源相干性要求低、成像视场大、分辨率高、收敛速度快等优点。同时，相较于传统迭代方法，可以克服克服了传统迭代方法的停滞、局部收敛、低频分量丢失等问题。

近年来，叠层衍射成像技术逐渐为人们所青睐，并被广泛应用到X射线成像、光学显微、生命科学等多个领域。然而，现有的叠层衍射成像技术需要机械横向移动透光小孔(探针)或者移动样品本身，来记录样品的不同部位被照明时形成的衍射图样，往往需要记录上百幅衍射图样才能再现出样品的相位图像。因此，该技术尚无法对动态样品进行相位成像。

发明内容

为了解决传统叠层相位成像技术中存在的上述问题，本发明提供了一种基于DMD数字选址的叠层相位显微装置及方法，能够有效提高成像速度。本发明要解决的技术问题通过以下技术方案实现：

本发明的一个方面提供了一种基于DMD数字选址的叠层相位显微装置，包括沿光路方向依次设置的照明光源、衰减片、第一薄透镜、第二薄透镜、第一反射镜、数字微镜器件、第三薄透镜、第四薄透镜、第二反射镜、第五薄透镜、第一显微物镜、第二显微物镜、第六薄透镜和相机，其中，

样品放置在所述第一显微物镜与所述第二显微物镜之间且位于所述第一显微物镜的后焦面，所述相机设置为距离样品像面预定距离；

所述数字微镜器件包括由多个微镜组成的二维阵列靶面，所述二维阵列靶面被预先划分成多个阵列排列的靶面子区域且相邻靶面子区域具有预设的交叠面积，所述数字微镜器件被配置成依次选通不同的靶面子区域以对所述样品进行局部照明；

所述相机用于记录所述样品在多次局部照明下的多个衍射图样。

在本发明的一个实施例中，所述叠层相位显微装置还包括数据处理模块，利用CCD记录的多个衍射图样计算获得所述样品的相位信息。

在本发明的一个实施例中，所述多个阵列排列的靶面子区域为尺寸相同的圆形区域，且相邻圆形区域之间具有≥60％的交叠面积。

在本发明的一个实施例中，所述数字微镜器件还被配置成在所述二维阵列靶面的中心选通一个布置有二进制强度光栅的圆形区域，通过相机记录不同衍射级的衍射光斑；利用所述不同衍射级的衍射光斑之间的横向距离，以及±1级衍射光的传播方向，能够用来计算样品像面与所述相机之间的离焦距离。

在本发明的一个实施例中，所述照明光源为激光器或部分相干光源。

本发明的另一方面提供了一种基于DMD数字选址的叠层相位显微方法，包括：

S1：根据上述实施例中任一项所述的基于DMD数字选址的叠层相位显微装置获得样品的多个衍射图样；

S2：根据所述多个衍射图样计算获得所述样品的相位信息。

在本发明的一个实施例中，所述S1包括：

S11：打开照明光源，调节衰减片以使光强适合于成像光路；

S12：准直成像光路，将样品放置于第一显微物镜的后焦面，通过轴向调节相机找到像面位置并将相机沿远离样品的方向移动一定预设距离；

S13：依次选通数字微镜器件的不同靶面子区域以对样品进行多次局部照明；

S14：利用相机记录样品在所述多次局部照明下的多个衍射图样。

在本发明的一个实施例中，所述S2包括：

S21：初始化像面上样品的复透过率函数：

O

其中，z表示样品像面与相机之间的光轴方向，z＝0表示像面所在位置，x，y分别表示垂直于光轴方向的平面内相互垂直的两个方向；

S22：获得在第一次局部照明P

其中，E

S23：利用叠层相位显微装置获得的第一个衍射图样I

其中，I

S24：将步骤S23得到的光场复振幅E

S25：利用叠层衍射成像算法更新样品的复透过率函数：

其中，上标*表示P

S26：令O

S27：利用所述多个衍射图样继续重复步骤S22至S26，进行多次迭代并计算均方误差f

其中，E

S28：根据样品的最终复透过率函数获得样品的相位信息。

在本发明的一个实施例中，在所述S2之前还包括：

在数字微镜器件的二维阵列靶面中心选通一个布置有二进制强度光栅的圆形区域，利用相机获得不同衍射级的光斑，并利用所述不同衍射级的光斑计算样品像面与所述相机之间的离焦距离d。

在本发明的一个实施例中，利用所述不同衍射级的光斑计算样品像面与所述相机之间的离焦距离d，包括：

利用相机上不同衍射级的光斑获得±1级衍射光中心与0级衍射光中心之间的距离l；

计算样品像面上光栅的周期：Λ′＝MΛ，其中，Λ为数字微镜器件上加载光栅的周期，M为数字微镜器件到样品像面之间成像系统的放大率；

利用样品像面上光栅的周期计算+1级衍射光中心与光轴之间的角度：θ＝arcsin(λ/Λ′)；

利用几何关系计算得到离焦距离：d＝l/tan(θ)＝l/tan[arcsin(λ/Λ′)]。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明的叠层相位显微装置和方法通过数字选址照明样品并记录所产生的衍射图样，可以实现对透明活体生物样品的快速、高分辨量化相位显微成像，可以被广泛应用于生物医学成像、工业检测等多个领域。

2、本发明的基于DMD数字选址的叠层相位显微方法借助数字微镜器件代替传统方法机械移动照明光阑选址，实现对样品不同“子区域”的数字选址和照明，可有效提高成像速度。

3、通过在DMD加载一个布置有二进制强度光栅的圆形区域并记录其形成的衍射图样，可以数字获得样品的离焦距离，避免了传统方法需要事先测量离焦距离的程序，增加了相位成像的便捷性。

以下将结合附图及实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明实施例提供的一种基于DMD数字选址的叠层相位显微装置的结构示意图；

图2是本发明实施例提供的一种选通DMD的不同靶面子区域的示意图；

图3是本发明实施例提供的基于DMD数字选址的叠层显微成像的流程示意图；

图4是本发明实施例提供的一种计算样品像面与相机之间离焦距离的示意图；

图5是利用基于DMD数字选址的叠层相位显微装置获得的成像结果图。

附图标记说明：

1-照明光源；2-衰减片；3-第一薄透镜；4-第二薄透镜；5-第一反射镜；6-数字微镜器件；7-第三薄透镜；8-第四薄透镜；9-第二反射镜；10-第五薄透镜；11-第一显微物镜；12-样品；13-第二显微物镜；14-第六薄透镜；15-相机。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及具体实施方式，对依据本发明提出的一种基于DMD数字选址的叠层相位显微装置及方法进行详细说明。

有关本发明的前述及其他技术内容、特点及功效，在以下配合附图的具体实施方式详细说明中即可清楚地呈现。通过具体实施方式的说明，可对本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效进行更加深入且具体地了解，然而所附附图仅是提供参考与说明之用，并非用来对本发明的技术方案加以限制。

应当说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的物品或者设备中还存在另外的相同要素。

实施例一

请参见图1和图2，图1是本发明实施例提供的一种基于DMD数字选址的叠层相位显微装置的结构示意图；图2是本发明实施例提供的一种选通DMD的不同靶面子区域的示意图。本实施例基于DMD数字选址的叠层相位显微装置包括沿光路方向依次设置的照明光源1、衰减片2、第一薄透镜3、第二薄透镜4、第一反射镜5、DMD(数字微镜器件，DigitalMicromirror Device)6、第三薄透镜7、第四薄透镜8、第二反射镜9、第五薄透镜10、第一显微物镜11、第二显微物镜13、第六薄透镜14和相机15，其中，样品12放置在第一显微物镜11与第二显微物镜13之间且位于第一显微物镜11的后焦面，相机15设置为距离样品像面预定距离。在本实施例中，所述预定距离为40.7mm。照明光源1可以是激光器或者部分相干光源(例如LED)。

在本实施例中，照明光源1为激光器，波长在可见光范围内，输出激光功率稳定且具有适当的相干长度。衰减片2为连续可调衰减片。第一薄透镜3与第二薄透镜4组成一个望远镜系统，第三薄透镜7与第四薄透镜8组成一个望远镜系统，以对光束进行扩束。第一显微物镜11与第五薄透镜10构成缩束系统，将DMD按照一定的缩束比成像到样品12上。第二显微物镜13与第六薄透镜14构成望远镜系统，对来自样品12处的光波进行扩束放大，实现显微成像。

DMD6包括由多个微镜组成的二维阵列靶面，该二维阵列靶面被预先划分成多个阵列排列的靶面子区域且相邻靶面子区域具有预设的交叠面积，DMD6被配置成依次选通不同的靶面子区域以对样品12进行多次局部照明。相机15为CCD相机，具有合适的灰度阶、像素尺寸和像素数量，用于记录样品12在多次局部照明下的多个衍射图样。

具体地，如图1所示，激光器发出的激光经过一个连续可调衰减器后，被用作照明光，该照明光被由第一薄透镜3和第二薄透镜4组成的望远镜系统扩束准直成平行光。该平行光经反射镜5反射后，照射在DMD6的二维阵列靶面上，随后，DMD6反射的光被第三薄透镜7与第四薄透镜8组成的望远镜系统以及第五薄透镜10与第一显微物镜11的缩束系统成像到样品12的表面上。需要说明的是，DMD是一种布置在半导体芯片上，由数百万个微镜组成的二维阵列，每个微镜构成一个像素，能在驱动电路的控制下发生偏转，从而实现光开关的功能。在本实施例中，DMD 6的像素大小为1920×1080，像元的尺寸为7.56μm，帧频为9253fps。也就是说，本实施例的DMD是由1920×1080个微镜组成的二维阵列，每个微镜的边长为7.56μm。

当DMD 6上某一像素(或微镜)被加载电压时，该微镜将会发生一定角度(优选地为24°)的偏转(此时为“开”状态)，经该微镜反射后的入射光垂直出射并进入到成像光路中。没有加电压的微镜不发生偏转(此时为“关”状态)，将入射光反射到成像光路以外的其它方向。DMD6上所加载图像的灰度值决定了微镜在“开”状态停留的时间。通过在DMD6上依次选通不同位置的子区域(令该区域的灰度值为255，其他区域为0)，便可以“点亮”样品上对应的区域，实现选址照明。样品12在不同位置的子区域照明下，被由第二物镜13和透镜14组成的望远镜系统放大成像，其像面出现在透镜14的后焦面上。在本实施例中，CCD放置在距离样品像面40.7mm处，用来记录样品在上述局部照明下的衍射图样。

本实施例的DMD 6的靶面被预先划分成19×9个阵列排列的圆形区域，并在x和y方向上令每相邻的两个圆形区域形成一定的交叉，以保证相邻两个圆形区域之间有≥60％的重叠。该比例是兼顾叠层相位显微成像速度和算法收敛性的一个折中数值。在具体成像过程中，按照显微装置的扫描次序，每次加载一个圆形区域，对样品进行逐次选址照明，如图2所示，也就是说，该圆形区域内包含的所有微镜同时偏转24°，该圆形区域内微镜反射后的入射光出射并进入到成像光路中。CCD记录样品在19×9个圆形区域照明下产生的衍射图样。需要说明的是，该过程利用DMD数字选址(9253帧/秒)代替传统叠层衍射成像中机械移动照明小孔，使得其成像速度仅仅受限于CCD的曝光时间。本实施例的CCD采用ImagingSource公司出产的工业相机DMK 33UX226(像素4000×3000，30帧/秒)来记录这19×9个衍射图样，成像耗时5.7s。

进一步地，该叠层相位显微装置还包括数据处理模块，利用CCD记录的多个衍射图样计算获得样品12的相位信息。

方便起见，将第m个圆形区域对应的局部照明函数记为P

具体地，P

以下将介绍如何利用这19×9个照明函数P

请参见图3，图3是本发明实施例提供的基于DMD数字选址的叠层显微成像的流程示意图。本实施例的相位计算方法具体包括如下步骤：

步骤1：初始化像面上样品的复透过率函数：

O

其中，z表示样品像面与相机之间的光轴方向，z＝0表示像面所在位置，x，y分别表示垂直于光轴方向的平面内相互垂直的两个方向；

步骤2：获得在第一次局部照明P

其中，E

步骤3：利用叠层相位显微装置获得的第一个衍射图样I

其中，I

步骤4：将步骤3得到的光场复振幅E

步骤5：利用叠层衍射成像算法更新样品的复透过率函数：

其中，上标*表示P

步骤6：令O

也就是说，重复进行m＝19×9即可完成一次迭代，获得样品的当前复透过率函数O

步骤7：利用所述多个衍射图样继续重复步骤S22至S26，进行多次迭代并计算均方误差f

这里，E

需要说明的是：以上基于迭代的叠层相位再现算法收敛很快，这是由其记录机制决定的：相邻两个圆形区域之间具有≥60％的重叠。与传统的单光束相位恢复算法相比，该算法不易进入迭代停滞或收敛到局部极小值。另外，该算法也不同于传统PIE的再现方法。传统PIE的再现方法利用傅里叶变换来计算光波在物面与CCD面之间传播。这便要求离焦距离d足够大，以满足夫琅和费衍射条件，不利于成像设备的小型化，也会降低成像分辨率。而本实施例的方法利用角谱理论来计算物光波在样品像面与CCD面之间的往返传播，可以大大降低对离焦距离的要求，有助于实现设备小型化和高分辨量化相位成像。

步骤8：根据样品的最终复透过率函数获得样品的相位信息。

需要说明的是，传统方法在通过上述步骤再现样品的相位信息之前，需要提前测量样品像面与CCD面之间的离焦距离d。本专利所述方法可以通过以下操作获得离焦距离d。

具体地，本实施例的数字微镜器件6还被配置成在二维阵列靶面的中心选通一个布置有二进制强度光栅的圆形区域，以利用相机15获得不同衍射级的衍射光斑，不同衍射级的衍射光斑能够用来计算样品像面与相机15之间的离焦距离d。

请参见图4，图4是本发明实施例提供的一种计算样品像面与相机之间离焦距离的示意图。为了获得精确的离焦距离d，在DMD的中心加载一个布置有二进制强度光栅的圆形区域，该二进制光栅的灰度值分别为0和255，周期为Λ(可设为相机分辨率的2～5倍)。该圆形区域先被成像到样品表面，再被第二显微物镜13和第六薄透镜14组成的望远镜系统成像到样品的像面。由于光栅的衍射作用，该圆形区域内的光波被衍射成多个光束，并沿着不同衍射级的方向传播。最后经过离焦距离d后，不同衍射级的光斑发生横向位移并被CCD所记录。通过从CCD的图像中可以获得±1级衍射光中心与0级衍射光中心之间的距离，记为l。

离焦距离d可以通过以下计算方法获得：首先，计算样品像面上光栅的周期Λ′＝MΛ，其中，Λ为DMD上加载圆形区域光栅的周期，M为DMD到样品像面之间的成像系统的放大率，该放大率可以通过与测量P

本实施例的叠层相位显微装置通过DMD数字选址对样品进行多次局部照明并记录所产生的衍射图样，可以实现对透明活体生物样品的快速、高分辨量化相位显微成像，具有稳定性高、可实时振幅/相位成像等优点，可以被广泛应用于生物医学成像、工业检测等多个领域。

实施例二

在上述实施例的基础上，本实施例提供了一种基于DMD数字选址的叠层相位显微方法。该方法包括：

S1：利用实施例一所述的基于DMD数字选址的叠层相位显微装置获得样品的多个衍射图样；

具体地，打开照明光源，调节衰减片以使光强适合于成像光路，使得CCD中的图像清楚，但不饱和；准直成像光路，将样品放置于第一显微物镜的后焦面，通过轴向调节相机找到像面位置并将相机沿远离样品的方向移动预设距离；依次选通数字微镜器件的不同靶面子区域以对样品进行多次局部照明；利用相机记录样品在所述多次局部照明下的多个衍射图样。

S2：根据所述多个衍射图样计算获得所述样品的相位信息。

具体地，所述S2包括：

S21：初始化像面上样品的复透过率函数：

O

其中，z表示样品像面与相机之间的光轴方向，z＝0表示像面所在位置，x，y分别表示垂直于光轴方向的平面内相互垂直的两个方向；

S22：获得在第一次局部照明P

其中，E

S23：利用叠层相位显微装置获得的第一个衍射图样I

其中，I

S24：将步骤S23得到的光场复振幅E

S25：利用叠层衍射成像算法更新样品的复透过率函数：

其中，上标*表示P

S26：令O

也就是说，重复进行m＝19×9即可完成一次迭代，获得样品的当前复透过率函数O

S27：利用所述多个衍射图样继续重复步骤S22至S26，进行多次迭代并计算均方误差f

其中，E

S28：根据样品的最终复透过率函数获得样品的相位信息。

进一步地，在所述S2之前还包括：

在数字微镜器件的二维阵列靶面中心选通一个布置有二进制强度光栅的圆形区域，利用相机获得不同衍射级的光斑，并利用所述不同衍射级的光斑计算样品像面与所述相机之间的离焦距离d。

具体地，利用所述不同衍射级的光斑计算样品像面与所述相机之间的离焦距离d，包括：

利用相机上不同衍射级的光斑获得±1级衍射光中心与0级衍射光中心之间的距离l；

计算样品像面上光栅的周期：Λ′＝MΛ，其中，Λ为数字微镜器件上加载光栅的周期，M为数字微镜器件到样品像面之间成像系统的放大率；

利用样品像面上光栅的周期计算+1级衍射光中心与光轴之间的角度：θ＝arcsin(λ/Λ′)；

利用几何关系计算得到离焦距离：d＝l/tan(θ)＝l/tan[arcsin(λ/Λ′)]。

接着，通过实验对本发明实施例的叠层相位显微装置和方法的效果进行验证。在实验中，照明光源1为半导体激光器，光的波长范围为473nm±5nm。DMD6的像素为1920×1080，像元尺寸为7.56μm，帧频9253fps。第一显微物镜11的放大倍率为20X，数值孔径NA＝0.4。第二显微物镜的放大倍率为10X，数值孔径NA＝0.32。第一薄透镜3的焦距为f

在实验中，我们以相位台阶(尺寸为20μm×70μm)作为被测样品，采用DMD数字选址照明。请参见图5，图5是利用基于DMD数字选址的叠层相位显微装置获得的成像结果图，其中，171(19×8)个圆形区域(如图5(a)所示)被依次加载到DMD上，并被成像到样品表面。CCD与DMD相同步，以每秒30帧的频率依次记录DMD产生不同区域照明下样品的衍射图样(如图5(b)所示)。通过采用叠层相位显微的数值再现算法，可以获得样品的光强度分布(如图5(c)所示)和相位分布(如图5(d)所示)。通过比较强度图像和相位图像，我们发现对于该透明样品，相位图像可以清楚地展现样品的结构。此外，还可以通过相位

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。