一种肝素化透明质酸水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，尤其涉及一种肝素化透明质酸水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

透明质酸(HA)是一种天然粘多糖，是天然细胞外基质中的重要成分，其具有独特的粘弹性、优越的生物学相容性和可降解性，是一种理想的组织工程材料。透明质酸水凝胶在软骨、神经、血管、皮肤、喉管等组织工程中表现出良好的应用前景，近年来已在生物医用领域受到广泛关注。然而，透明质酸水凝胶本身对细胞和蛋白质不具有粘附性，这一特性极大限制了其在组织工程中的应用。细胞对材料的粘附特性极大影响进一步的细胞行为，如：增殖、迁移和分化，单纯的透明质酸水凝胶对细胞粘附性差，不足以长时间的维持细胞活性，进而影响细胞增殖。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明第一个方面提出一种肝素化透明质酸水凝胶，通过肝素改性透明质酸水凝胶，能改善细胞对透明质酸水凝胶的粘附，提高细胞活性。

本发明的第二个方面提出了一种上述肝素化透明质酸水凝胶的制备方法。

本发明的第三个方面提出了一种上述肝素化透明质酸水凝胶的应用。

根据本发明的第一个方面，提出了一种肝素化透明质酸水凝胶，制备原料包括改性透明质酸与烯基改性肝素交联形成；所述改性透明质酸包括烯基改性透明质酸、硫醇基改性透明质酸中的至少一种。

通常情况下，透明质酸水凝胶对细胞的粘附性较差，而本发明中，利用肝素对细胞外基质蛋白和细胞的特异性亲和力，将透明质酸水凝胶肝素化，从而改善细胞粘附环境，诱导细胞粘附，并为细胞粘附提供有效的结合位点，提高细胞活性，从而促进细胞增殖，而无需再进行任何修饰。

在本发明的一些实施方式中，所述改性透明质酸选自甲基丙烯酸酐改性透明质酸、丙烯酰氯改性透明质酸、甲基丙烯酸甘油酯改性透明质酸、半胱胺改性透明质酸中的至少一种。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述改性肝素选自甲基丙烯酸酐改性肝素、丙烯酸酐改性肝素、马来酸酐改性肝素中的至少一种。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述改性透明质酸与所述烯基改性肝素的质量比为(1～40)：(1～10)。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述烯基改性肝素为肝素中的羟基与烯基改性试剂中的烯酸酐基团发生酯化反应制得。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述肝素中的羟基与所述烯基改性试剂中的烯酸酐基团的摩尔比为1：(5～20)。

根据本发明的第二个方面，提出了一种上述肝素化透明质酸水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

S1：将所述改性透明质酸、所述烯基改性肝素与光引发剂和水混合，得到水凝胶前驱体溶液；

S2：将S1制得的水凝胶前驱体溶液进行光照交联反应，得到所述肝素化透明质酸水凝胶。

在本发明的一些实施方式中，S1中，所述改性透明质酸的浓度为1wt％～4wt％；优选的，所述烯基改性肝素的浓度为0.05wt％～10wt％；进一步优选的，所述光引发剂的浓度为0.005wt％～0.1wt％。

在本发明的一些优选的实施方式中，S1中，所述烯基改性肝素的制备方法为：将肝素钠溶液调节至碱性，冰浴下滴加烯基改性试剂，反应后制得所述烯基改性肝素。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述碱性为pH为8～9。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述反应的时间为12h～24h。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述烯基改性肝素的制备方法还包括对反应后的溶液进行提纯后得到所述烯基改性肝素；优选的，所述提纯包括沉淀、透析、冻干；更进一步优选的，所述沉淀为将反应后的溶液在预冷乙醇中沉淀。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述烯基改性试剂选自甲基丙烯酸酐、丙烯酸酐、马来酸酐中的至少一种。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述光引发剂选自2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(CAS号为：106797-53-9)、1-羟基环己基-苯基甲酮(CAS号为：947-19-3)、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(CAS号为：85073-19-4)、2,2-二甲氧基-苯基乙酮(CAS号为：38002-92-5)、曙红Y(CAS号为：15086-94-9)中的至少一种。

在本发明的一些更优选的实施方式中，S2中，所述光照交联采用绿光或紫外光交联；优选的，所述绿光波长为515nm-535nm，所述紫外光波长为350nm-380nm。

在本发明的一些更优选的实施方式中，S2中，所述交联反应的时间为5s～120s。

根据本发明的第三个方面，提出了一种上述肝素化透明质酸水凝胶在制备细胞载体、药物载体或组织修复材料中的应用。

本发明的有益效果为：

1.本发明针对透明质酸水凝胶对细胞粘附性差的问题，采用天然粘多糖肝素来修饰透明质酸，烯基改性肝素与改性透明质酸光交联成胶，即可制得肝素化透明质酸水凝胶，制备方法简单，不需要额外添加功能多肽或蛋白。

2.本发明的肝素化透明质酸水凝胶改善了细胞对透明质酸水凝胶的粘附，提高了细胞活性，有望成为细胞治疗和各种组织工程应用的载体材料，具有广阔应用前景。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中甲基丙烯酸酐改性肝素与改性前肝素的核磁共振谱图。

图2为本发明实施例1中制得的水凝胶和对比例1中制得水凝胶对细胞粘附性影响。

图3为本发明实施例2中制得的水凝胶和对比例1中制得水凝胶对细胞活性的影响。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例制备了一种肝素化透明质酸水凝胶，具体过程为：

S1：制备甲基丙烯酸酐改性肝素：配制1wt％肝素钠溶液，冰浴条件下，NaOH调节溶液pH至8～9之间，缓慢滴加3.2mL甲基丙烯酸酐，冰浴下反应12h。将反应后的溶液倒入预冷乙醇中沉淀，收集沉淀装入分子截留量3500Da的透析袋中，透析4天后冻干，得到甲基丙烯酸酐改性肝素；

S2：配制水凝胶前驱体溶液：将甲基丙烯酸酐改性透明质酸、甲基丙烯酸酐改性肝素溶于水分别形成质量分数为2％、1％的溶液，加入质量分数为0.05％的光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂，充分混匀，得到水凝胶前驱体溶液；

S3：将水凝胶前驱体溶液注入模具中，365nm紫外光交联10s，得到肝素化透明质酸(HepHA)水凝胶。

实施例2

本实施例制备了一种肝素化透明质酸水凝胶，具体过程为：

S1：制备甲基丙烯酸酐改性肝素：本实施例甲基丙烯酸酐改性肝素的制备方法与实施例1的相同；

S2：配制水凝胶前驱体溶液：将甲基丙烯酸酐改性透明质酸、甲基丙烯酸酐改性肝素溶于水分别形成质量分数为2％、0.1％的溶液，加入质量分数为0.05wt％的光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂，充分混匀，得到水凝胶前驱体溶液；

S3：将水凝胶前驱体溶液注入模具中，365nm紫外光交联20s，得到HepHA水凝胶。

对比例1

本对比例制备了一种透明质酸水凝胶，与实施例1的区别在于水凝胶不含改性肝素，具体过程为：

S1：将甲基丙烯酸酐改性透明质酸溶于水形成质量分数为2％的溶液，加入质量分数为0.05wt％的光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂，充分混匀，得到水凝胶前驱体溶液；

S2：将水凝胶前驱体溶液注入模具中，365nm紫外光交联10s成胶，得到透明质酸(HAMA)水凝胶。

试验例1

对实施例1中S1制得的甲基丙烯酸酐改性肝素与改性前的肝素进行核磁表征，结果如图1所示。

从图1可看出，对比肝素和甲基丙烯酸酐改性肝素核磁共振图谱可知，甲基丙烯酸酐改性肝素的核磁共振谱图在5.64ppm和6.05ppm处有双键特征峰，说明甲基丙烯酸酐成功接到肝素上。

试验例2：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对不同水凝胶的粘附测定

将实施例1与对比例1所制得的水凝胶灭菌后，置于48孔板中，接种HUVEC，每孔约2×10

试验例3：不同水凝胶对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)活性的影响

将实施例2与对比例1所制得的水凝胶灭菌后，置于48孔板中，接种HUVEC，每孔约2×10

上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。