苯乙醇在诱导植物抗性方面的应用

本发明要求2022年11月14日提交的中国专利申请CN202211422305.2的优先权，该优先权文件的说明书、说明书附图和权利要求书所记载的内容全文引入本发明的说明书并被作为本发明说明书原始记载的一部分。申请人进一步声明，申请人拥有基于该优先权文件修改本发明的说明书和权利要求书的权利。

技术领域

本发明涉及农业领域，具体涉及苯乙醇在诱导植物抗性方面的应用。

背景技术

诱导抗性是指植物受到外界因子的影响而产生的一种抗逆性反应。当外界的物理因子(如高温、低温、干旱等)或化学因子(如各种化学物质)或生物因子(如多种微生物)持续刺激植株，植物就会产生针对该因子的抗逆能力，这种受外界因子诱导而产生的抗逆性能只在该个体中存在，但不会遗传。利用植物的诱导抗性可以提高植物抗病能力，提高产量。CN111493076A报道了3,5-二氯邻氨基苯甲酸诱导拟南芥对灰霉病抗性的应用及其方法，该方法利用5-15μM浓度的3,5-二氯邻氨基苯甲酸水溶液对4周龄拟南芥植株进行灌根或者叶面喷施处理两天后接种灰霉病菌，结果拟南芥幼苗对灰霉病抵抗力明显增加。CN113303328A报道了α-蒎烯在促三七生长及诱导抗性中的应用，该方法利用1-20uL/L的α-蒎烯进行熏蒸处理，不仅能够促进三七种子提前萌发，还能诱导三七对黑斑病产生抗性。

苯乙醇(Phenylethyl alcohol)是无色粘稠液体，沸点219℃，相对密度1.0230，折光率1.5310～1.5340，是一种广泛存在于自然界的芳香族伯醇，具有淡雅细腻而持久的玫瑰芳香气味，天然存在于新鲜水果(如番茄、苹果、香蕉、葡萄等)、花卉(如玫瑰)及酵母(如酿酒酵母)中，并是奶酪、面包、啤酒、葡萄酒、可可、咖啡等多种食品的香气主要构成物质。大量研究表明苯乙醇对部分细菌和真菌都具有直接抑菌活性，如对细菌中的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色酿脓葡萄球菌，真菌中的酿酒酵母、草莓灰霉病菌、柑橘青绿霉病菌等都有抑制作用。

本发明人发现了苯乙醇在诱导植物抗性方面的应用潜力，进而提出了本发明。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种苯乙醇在诱导植物抗性中的应用。

本发明的第一个方面在于提供苯乙醇在诱导植物抗性中的应用。

本发明以模式植物拟南芥为研究对象，采用不同浓度苯乙醇熏蒸处理拟南芥活体植株后接种炭疽菌，分析拟南芥对炭疽病的抗性变化，并通过激素和转录组测定分析其诱导抗性的机理，发现低浓度苯乙醇对葡萄炭疽菌和拟南芥炭疽菌没有显著抑制效果，但能诱导拟南芥幼苗对拟南芥炭疽病菌产生显著的抗性，经对拟南芥体内激素和转录组分析后发现，低浓度苯乙醇一方面通过调节植物体内生长素和细胞分裂素等激素相关基因表达来促进植物生长，从而抵抗病害；另一方面通过诱导抗逆相关基因表达，激活多防御信号途径，主要是激活茉莉酸合成通路上的α-亚麻酸代谢、水杨酸合成通路上的苯丙素合成以及植物病原互作通路等来诱导植物产生抗病性，减轻病害的发生。

在一个优选的实施方案中，所述应用包括对植物使用苯乙醇进行处理。优选的，所述处理为使用苯乙醇进行熏蒸。更优选的，所述应用包括在密闭空间中对植物使用苯乙醇进行熏蒸。

在一个优选的实施方案中，熏蒸时苯乙醇的用量为0.1～30μL/L(苯乙醇/密闭空间体积)。

优选的，所述用量为0.1μL/L、0.5μL/L、1μL/L、2μL/L、3μL/L、4μL/L、5μL/L、6μL/L、7μL/L、8μL/L、9μL/L、10μL/L、11μL/L、12μL/L、13μL/L、14μL/L、15μL/L、16μL/L、17μL/L、18μL/L、19μL/L、20μL/L、30μL/L。所述用量优选为0.5～20μL/L，进一步优选0.5～10μL/L。

在一个优选的实施方案中，熏蒸的总时间为1～10d。优选的，熏蒸的总时间为1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d。优选的，熏蒸的总时间为2～5d，进一步优选3～4d。

在一个优选的实施方案中，优选每1～3d补充添加一次苯乙醇，每次补充添加时苯乙醇的用量为0.1～30μL/L(苯乙醇/密闭空间体积)。优选的，所述用量为0.1μL/L、0.5μL/L、1μL/L、2μL/L、3μL/L、4μL/L、5μL/L、6μL/L、7μL/L、8μL/L、9μL/L、10μL/L、11μL/L、12μL/L、13μL/L、14μL/L、15μL/L、16μL/L、17μL/L、18μL/L、19μL/L、20μL/L、30μL/L。所述用量优选为0.5～20μL/L，进一步优选0.5～10μL/L。优选的，每1d、2d、或3d补充添加一次苯乙醇。

在一个实施方案中，每次补充添加苯乙醇的用量可以与初始添加相同，也可以与初始添加的不同。

本发明的第二个方面在于提供一种诱导植物抗性的方法，所述方法包括对植物使用苯乙醇进行处理。

优选的，所述处理为使用苯乙醇进行熏蒸。更优选的，所述方法包括在密闭空间中对植物使用苯乙醇进行熏蒸。

在一个优选的实施方案中，熏蒸时苯乙醇的用量为0.1～30μL/L(苯乙醇/密闭空间体积)。

优选的，所述用量为0.1μL/L、0.5μL/L、1μL/L、2μL/L、3μL/L、4μL/L、5μL/L、6μL/L、7μL/L、8μL/L、9μL/L、10μL/L、11μL/L、12μL/L、13μL/L、14μL/L、15μL/L、16μL/L、17μL/L、18μL/L、19μL/L、20μL/L、30μL/L。所述用量优选为0.5～20μL/L，进一步优选0.5～10μL/L。

在一个优选的实施方案中，熏蒸的总时间为1～10d。优选的，熏蒸的总时间为1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d。优选的，熏蒸的总时间为2～5d，进一步优选3～4d。

在一个优选的实施方案中，优选每1～3d补充添加一次苯乙醇，每次补充添加时苯乙醇的用量为0.1～20μL/L(苯乙醇/密闭空间体积)。优选的，所述用量为0.1μL/L、0.5μL/L、1μL/L、2μL/L、3μL/L、4μL/L、5μL/L、6μL/L、7μL/L、8μL/L、9μL/L、10μL/L、11μL/L、12μL/L、13μL/L、14μL/L、15μL/L、16μL/L、17μL/L、18μL/L、19μL/L、20μL/L、30μL/L。所述用量优选为0.5～20μL/L，进一步优选0.5～10μL/L。优选的，每1d、2d、或3d补充添加一次苯乙醇。

在一个实施方案中，每次补充添加苯乙醇的用量可以与初始添加相同，也可以与初始添加的不同。

本发明中，苯乙醇在应用时可以单独使用，或者与辅料制成气雾剂、喷雾剂、熏蒸剂、水剂、水溶剂、滴剂等剂型。优选的，苯乙醇与易挥发溶剂一起制成熏蒸剂。所述易挥发溶剂选自石油醚、正己烷、环己烷、丙酮、乙醇中的至少一种。

本发明中，所述诱导植物抗性包括诱导植物产生抗病性，所述抗病性包括对细菌和真菌的抗性，包括对炭疽菌、白粉菌、灰霉菌的抗性，尤其是对炭疽菌特别是胶孢炭疽菌的抗性。优选的，所述炭疽菌包括葡萄炭疽菌、拟南芥炭疽菌等，但不限于此。

本发明中，所述植物包括拟南芥、葡萄、苹果、芒果、橡胶、辣椒、柿、香蕉、柑桔、山药、杨树、八角金盘等炭疽菌尤其是特别是胶孢炭疽菌的寄主。

本发明的第三个方面在于提供一种诱抗剂，其包括苯乙醇。

在一个优选的实施方案中，所述诱抗剂还可以包括其他辅料，并且可以为气雾剂、喷雾剂、熏蒸剂、水剂、水溶剂、滴剂等剂型。优选的，苯乙醇与易挥发溶剂一起制成用于熏蒸的诱抗剂。所述易挥发溶剂选自石油醚、正己烷、环己烷、丙酮、乙醇中的至少一种。

有益效果：

本发明提供了苯乙醇在诱导植物抗性方面的应用。本发明发现低浓度(0.5-20μL/L)苯乙醇对葡萄炭疽菌和拟南芥炭疽菌没有显著抑制效果，只有在较高浓度(≥100μL/L)下对葡萄炭疽菌和拟南芥炭疽菌才呈现出显著的抑制效果。然而，低浓度苯乙醇对植物有诱导抗性，本发明以模式植物拟南芥为试验材料，发现经0.5-10μL/L苯乙醇诱导三天后的拟南芥对拟南芥炭疽病菌有显著的抗性，炭疽病发病情况显著减轻。经对拟南芥体内激素和转录组分析后发现，低浓度苯乙醇一方面通过调节植物体内生长素和细胞分裂素等激素相关基因表达来促进植物生长，从而抵抗病害；另一方面通过诱导抗逆相关基因表达，激活多防御信号途径，主要是激活茉莉酸合成通路上的α-亚麻酸代谢、水杨酸合成通路上的苯丙素合成以及植物病原互作通路等来诱导植物产生抗病性，减轻病害的发生。可见，苯乙醇在诱导模式植物拟南芥抗病性方面具有积极作用，故其可以应用于诱导其他植物的抗病性，是一种有效的植物源诱抗剂。

附图说明

图1：实施例1中苯乙醇对3株致病力有差异的葡萄炭疽菌抑制效果(不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著)；

图2：苯乙醇对拟南芥炭疽菌抑制效果(不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著)；

图3：苯乙醇诱导拟南芥抵抗拟南芥炭疽菌的效果(不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著)；

图4：苯乙醇处理后拟南芥激素含量变化情况(不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著)；

图5：苯乙醇处理后拟南芥基因差异表达情况；

图6：苯乙醇处理拟南芥后差异表达基因的KEGG富集散点图。

具体实施方式

在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。

应当理解的是，在说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应当理解为具有在字典中限定的含义，而应理解为在以下原则的基础上具有与其在本发明上下文中的含义一致的含义：术语的概念可以适当地由发明人为了对本发明的最佳说明而限定。

实施例1：苯乙醇对葡萄炭疽菌的抑制作用试验

在密闭空间中采用菌落生长抑制法测定苯乙醇对3株从炭疽病病果分离的致病力有差异的葡萄炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)的抑制效果，m1(强致病力菌株)、m2(中致病力菌株)、m3(弱致病力菌株)(m1、m2、m3分别为下列文章中的m-d-18、m-d-11、m-d-13；邓维萍等.云南葡萄产区葡萄炭疽病病原鉴定及致病力分析.植物保护学报,2013,40(01):61-67)。将苯乙醇用正己烷(分析纯)配制成0.0057μL/μL的母液，将3株葡萄炭疽菌菌饼(直径5mm)分别接种到PDA培养基中央，在培养皿盖上放1/4灭菌滤纸片，分别吸取苯乙醇母液10、20、100、200、400、1000、2000μL滴到滤纸片上，为调节挥发速率趋于一致，对应加入正己烷1990、1980、1900、1800、1600、1000、0μL，最终形成0.5、1、5、10、20、50、100μL/L(苯乙醇体积/密闭空间体积)挥发物气体浓度。以2000μL正己烷和灭菌水处理为对照。每个处理重复3次。所有培养皿用封口膜密封，置于培养箱(28℃，12h光照/12h黑暗)中倒置培养，7d后采用十字交叉法测量菌落直径。

试验结果如图1所示，图1中不同的小写字母代表处理间的差异显著性，P<0.05(图2-4也类似)。对强致病力菌株m1，在苯乙醇浓度为0.5-10μL/L，菌落直径为3.75-3.72cm，略大于对照的3.64cm，但差异不显著(P>0.05)；后随着苯乙醇浓度从10增大到100μL/L，菌落直径从3.60cm逐渐减小到3.12cm，均小于对照，仅100μL/L时，菌落直径显著低于对照(P<0.05)，其他浓度下差异不显著(P>0.05)；随浓度从0.5增大到100μL/L，苯乙醇对m1的抑制率从-3.02％增加到14.38％。

对中致病力菌株m2，在苯乙醇浓度为0.5和1μL/L时，菌落直径为4.48和4.12cm，略大于对照的4.09cm(P>0.05)；后随着苯乙醇浓度从1增大到100μL/L，菌落直径从3.97cm逐渐减小为3.62cm，均小于对照，尤其是20-100μL/L时，菌落直径显著低于对照(P<0.05)；随浓度从0.5增大到100μL/L，苯乙醇对m2的抑制率从-9.62％增加到11.57％。

对弱致病力菌株m3，在苯乙醇浓度为0.5和1μL/L时，菌落直径为2.10和2.08cm，略大于对照的1.93cm(P>0.05)；后随着苯乙醇浓度从1增大到100μL/L，菌落直径从1.85cm逐渐减小为1.42cm，均略小于对照(P>0.05)；随浓度从0.5增大到100μL/L，苯乙醇对m3的抑制率从-8.81％增加到26.60％。

综上所述，苯乙醇对葡萄炭疽菌的抑制效果与菌株的致病力强弱有关，对弱致病力菌株的抑制效果强于中致病力菌株和强致病力菌株；苯乙醇对葡萄炭疽菌的抑制效果与浓度有关，随着浓度的增大抑制效果增强，在低浓度下几乎没有抑制效果，在本试验的最高浓度100μL/L下对3株菌的抑制率都未超过27％，可见整体来说苯乙醇对葡萄炭疽菌的直接抑制效果并不显著。

实施例2：苯乙醇对拟南芥炭疽菌的抑制作用试验

选择一株对模式植物拟南芥有强致病力的炭疽菌菌株(Colletotrichumhigginsianum，其为下列文章中的IMI349061：Liping Liu,et al,A Novel MFSTransporter Gene ChMfs1 Is Important for Hyphal Morphology,Conidiation,andPathogenicity in Colletotrichum higginsianum.Frontiers in Microbiology,October 2017,Volume 8,Article 1953)，按实施例1试验方法再次验证苯乙醇对该拟南芥炭疽菌的直接抑制效果。试验结果显示(图2)，在0.5-20μL/L的浓度范围内，拟南芥炭疽菌菌落直径为5.66cm-5.63cm，略低于对照的6.16cm，但差异不显著(P>0.05)，苯乙醇在该浓度范围内对拟南芥炭疽菌无显著抑制作用。当苯乙醇浓度为50μL/L和100μL/L时，菌落直径分别为4.33cm和2.43cm，显著低于对照(P<0.05)，对拟南芥炭疽菌抑制率分别为30.22％和72.41％，具有显著抑制作用。

综合实施例1和2的试验结果可看出，通过熏蒸，苯乙醇在低浓度下(0.5-20μL/L)对葡萄炭疽菌和拟南芥炭疽菌没有显著抑制效果，只有在较高浓度下(≥100μL/L)对葡萄炭疽菌和拟南芥炭疽菌才呈现出显著的抑制效果。

实施例3：苯乙醇诱导拟南芥植株产生抗病性

苯乙醇诱导拟南芥抵抗炭疽病的抗性试验采用密闭空间熏蒸法，直接分别移取一定量的苯乙醇至密封培养箱中以形成0.5、1、3、5、10μL/L(苯乙醇体积/密闭空间体积)共5个低浓度。将6叶期的拟南芥盆栽放置于上述密封培养箱熏蒸诱导3d，3d后在第3、第4片叶上接种拟南芥炭疽菌(同实施例2)菌饼(直径为3mm)，以苯乙醇不处理后接种炭疽菌为对照，每个处理5次重复。接种4d发病后采集病斑叶片，使用Epson Perfection V850 Pro扫描仪扫描病叶，并使用Adobe Photoshop软件截取并计算诱导处理与对照处理的病斑面积，评价苯乙醇诱导拟南芥抗性的效果，将不包含病斑的样品进行激素和转录组测定。

试验结果如图3所示，0.5～10μL/L的苯乙醇熏蒸处理3d后，可明显诱导拟南芥对拟南芥炭疽病菌产生抗性。相比于对照90.48％的发病率，随苯乙醇浓度增加发病率从66.67％逐渐降低为28.57％，病斑面积从0.19cm

实施例4：拟南芥经苯乙醇诱导后激素以及转录组变化情况

选取实施例3中0.5、3、10μL/L处理下的拟南芥样品检测其激素和转录组变化情况。

苯乙醇处理后，5类激素(生长素、细胞分裂素、乙烯、茉莉酸、水杨酸)与对照相比发生了变化，结果如图4所示，具体如下：

(1)生长素：与对照相比，经0.5μL/L和3μL/L苯乙醇处理的拟南芥体内生长素(吲哚-3-乙酸，Indole-3-aceticacid，IAA)降低，平均含量分别为6.64ng/mL和6.80ng/mL，低于对照的7.364ng/mL，10μL/L处理的激素含量为11.33ng/mL，显著高于对照(P<0.05)。

(2)细胞分裂素：经0.5μL/L苯乙醇处理的拟南芥体内细胞分裂素——二氢玉米素-7-糖苷(Dihydrozeatin-7-glucoside，DHZ7G)平均含量为0.88ng/mL，低于对照的0.96ng/mL，3μL/L和10μL/L处理的激素含量分别为1.82ng/mL和2.07ng/mL，显著高于对照(P<0.05)。

(3)乙烯：拟南芥体内的乙烯合成前体1-氨基环丙烷羧酸(1-Aminocyclopropanecarboxylic acid，ACC)，在0.5、3和10μL/L苯乙醇处理后平均含量分别为103.18、118.60和93.26ng/mL，除3μL/L处理后含量略高于对照的114.22ng/mL外，其他2个浓度处理后均低于对照，但差异都不显著(P>0.05)。

(4)茉莉酸：拟南芥体内的茉莉酸(Jasmonic Acid，JA)在0.5、3和10μL/L苯乙醇处理后平均含量分别为410.72、184.90和341.60ng/mL，均高于对照的126.36ng/mL。

(5)水杨酸：拟南芥体内的水杨酸(Salicylic Acid，SA)平均含量随苯乙醇浓度从0.5-10μL/L逐渐升高，分别为31.74、37.98和39.08ng/mL，均高于对照的25.12ng/mL，但差异不显著(P>0.05)。

可见，苯乙醇熏蒸拟南芥后调节了拟南芥体内激素含量，尤其是与抗性相关的茉莉酸和水杨酸含量显著增加。

经苯乙醇处理后，拟南芥体内基因差异表达情况如图5所示，0.5μL/L苯乙醇处理的拟南芥差异表达基因60个，其中下调基因17个，上调基因43个(图5A)；3μL/L苯乙醇处理中差异表达基因503个，下调基因117个，上调基因386(图5B)；10μL/L苯乙醇处理中差异表达基因1320个，下调基因116个，上调基因220个(图5C)。从差异基因火山图中可以看出，3μL/L苯乙醇处理的拟南芥基因差异表达最显著，而10μL/L苯乙醇处理的拟南芥上调和下调基因的差异倍数最大。进一步对差异表达基因中激素相关基因分析后发现，(1)在0.5、3、10μL/L苯乙醇三个处理中，与生长素相关基因在色氨酸合成通路富集，其中生长素响应GH3家族基因BRU6(编码一个iaa-酰胺合酶，通过将多余的IAA偶联到氨基酸上，帮助维持生长素稳态，位于KEGG中的色氨酸合成通路)与对照相比呈上升趋势，差异倍数分别为1.114、1.54、1.955；(2)苯乙醇处理后与细胞分裂素相关基因在玉米素合成通路富集，其中反式玉米素降解通路上的差异表达基因deCKX5差异倍数为1.027、反式玉米素合成通路上的差异表达基因CYP735A差异倍数为-1.889；(3)苯乙醇处理后与茉莉酸相关基因在亚麻酸合成通路富集。0.5μL/L处理中差异表达基因AOC2(allene oxide cyclase 2，环氧丙烯环化酶，参与茉莉酸合成)差异倍数为-1.341，10μL/L中AOC3差异倍数为1.243，OPCL1(编码OPC-8:CoA连接酶，OPC-8:CoA连接酶通过启动β氧化链缩短其前体的羧酸侧链，催化JA生物合成中的一个重要步骤，位于KEGG中的亚麻酸合成通路)差异倍数为2.075。(4)苯乙醇处理后与水杨酸相关基因在苯丙素合成通路富集。其中3、10μL/L处理的差异表达基因在促分裂原活化蛋白激酶信号途径通路富集，差异表达基因PR1(PR1基因的表达可以诱导多种病原体的反应。它是一种SAR反应分子标记，水杨酸响应基因。PR1基因在促分裂原活化蛋白激酶信号通路及植物病原互作通路上)差异倍数分别为2.746、4.592。

差异基因KEGG注释及富集分析结果显示(图6)，(1)0.5μL/L苯乙醇处理后，拟南芥上调基因无显著富集通路(P>0.05)，下调基因显著富集在谷胱甘肽代谢(Glutathionemetabolism)(P＝0.04)和α-亚麻酸合成(alpha-Linolenic acid metabolism)(P＝0.022)通路。

(2)3μL/L苯乙醇处理后，拟南芥上调基因显著富集的通路为植物病原互作(Plant-pathogen interaction)(P＝3.86×10-7)、苯丙素生物合成((Phenylpropanoidbiosynthesis)(P＝1.26×10-7)、次生代谢产物生物合成(Biosynthesis of secondarymetabolites)(P＝1.09×10-4)；下调基因显著富集的通路为氮代谢(Nitrogenmetabolism)(P＝0.009)和代谢途径(Metabolic pathways)(P＝0.03)。

(3)10μL/L苯乙醇处理后，拟南芥上调基因显著富集的通路为植物病原互作(Plant-pathogen interaction)(P＝3.00×10-12)、苯丙素合成(Phenylpropanoidbiosynthesis)(P＝2.33×10-9)、促分裂原活化蛋白激酶信号途径(MAPK signalingpathway-plant)(P＝6.29×10-7)、次生代谢产物生物合成(Biosynthesis of secondarymetabolites)(P<0.01)、玉米素合成(Zeatin biosynthesis)(P<0.01)、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成(Phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis)(P<0.01)、谷胱甘肽代谢(Glutathione metabolism)(P<0.01)；下调基因显著富集的通路为核糖体(Ribosome)(P＝0.0003)、光合作用(Photosynthesis)(P＝0.0033)、类黄酮生物合成(Flavonoid biosynthesis)(P＝0.0092)。

结合苯乙醇处理拟南芥后挑战接种拟南芥炭疽菌的病斑面积、激素变化及基因差异表达分析结果可知，低浓度(0.5-10μL/L)苯乙醇处理拟南芥，一方面通过调节生长素和细胞分裂素等激素相关基因促进植物生长来抵抗病害；另一方面通过诱导抗逆相关基因表达，激活多防御信号途径来诱导植物产生抗病性。其中主要是激活茉莉酸合成通路上的α-亚麻酸代谢、水杨酸合成通路上的苯丙素合成以及植物病原互作通路等来提高植物对病害的抵抗能力，减轻病害的发生。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。