一种核酸适体及其与识别并结合促甲状腺素受体蛋白相关的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种核酸适体及其与识别并结合促甲状腺素受体蛋白相关的应用。

背景技术

促甲状腺素受体作为促甲状腺激素(TSH)的受体，在控制甲状腺细胞代谢中起核心作用，并且多种疾病相关。比如全身性自身免疫性疾病——格雷夫斯病(GD)，大约20％的GD患者会出现甲状腺相关眼病(TAO)，在这一过程中，促甲状腺素免疫球蛋白(TSI)通过甲状腺周围组织中局部表达的TSHR发挥作用，与发生在眼眶内的炎症和扩张有关，目前已经在眼眶脂肪、眼外肌和眼眶成纤维细胞中检测到功能性TSHR。另外，已有广泛报道TSHR出现缺陷也是甲状腺肿瘤(乳头状癌和滤泡癌)的一个原因(Terry Smith(2017):TSHR as atherapeutic target in Graves’disease,Expert Opinion on Therapeutic Targets,DOI:10.1080/14728222.2017.1288215)。

现有技术中存在着靶向促甲状腺素受体的药物，例如靶向促甲状腺素受体抗体5C9抗体K1–70，但其具有生产成本高、周期长、批次稳定性差、价格昂贵的劣势(Turcu AF,Kumar S,Neumann S,et al.A small molecule antagonist inhibits thyrotropinreceptor antibody-induced orbital fibroblast functions involved in thepathogenesis of Graves ophthalmopathy.J Clin Endocrinol Metab.2013；98(5):2153-2159.)；还有小分子化合物NCGC00229600(ANTAG2)/NCGC00242364(ANTAG3)/SMAS37a/b，但其具有亲和力低(微摩尔)，半衰期短(＜3h)，生物利用率低(50％)的缺点(Marcinkowski P,Hoyer I,Specker E,et al.A New Highly Thyrotropin Receptor-Selective Small-Molecule Antagonist with Potential for the TreatmentofGraves'Orbitopathy.Thyroid.2019；29(1):111-123.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种核酸适体及其与识别并结合促甲状腺素受体蛋白相关的应用，以解决现有技术中靶向促甲状腺素受体药物效果较差的问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种核酸适体，为如下A1)-A7)所述的任一种：

A1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子；

A2)将A1)所述的核酸适体删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

A3)将A1)或A2)所示的核酸适体进行核苷酸取代或修饰，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

A4)将A1)或A2)所示的核酸适体的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

A5)由A1)或A2)所示的核酸适体编码的RNA分子，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物；

A6)由A1)或A2)所示的核酸适体编码的肽核酸，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

A7)将A1)-A6)任一项所述的核酸适体的一端或中间连接信号分子和/或活性分子和/或功能基团和/放射性核素，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。

优选的，A3)中的所述修饰为磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。

优选的，A7)中的所述功能基团为荧光基团、生物素基团、放射性物质、治疗性物质、地高辛、纳米发光材料或酶标记。

本发明还提供了上述核酸适体在如下B1-B17至少一种中的应用：

(B1)识别并结合或辅助识别并结合促甲状腺素受体蛋白；

(B2)识别并结合或辅助识别并结合表达促甲状腺素受体蛋白的细胞；

(B3)制备识别并结合或辅助识别并结合促甲状腺素受体蛋白产品；

(B4)制备识别并结合或辅助识别并结合表达促甲状腺素受体蛋白的细胞产品；

(B5)识别或辅助识别促甲状腺素受体蛋白；

(B6)结合或辅助结合促甲状腺素受体蛋白；

(B7)捕获或提取待测样品中的促甲状腺素受体蛋白；

(B8)制备捕获或提取待测样品中的促甲状腺素受体蛋白产品；

(B9)制备识别或辅助识别促甲状腺素受体蛋白产品；

(B10)制备结合或辅助结合促甲状腺素受体蛋白产品；

(B11)检测或辅助检测待测样品中是否含有促甲状腺素受体蛋白；

(B12)制备检测或辅助检测待测样品中是否含有促甲状腺素受体蛋白的产品；

(B13)检测或辅助检测待测品中促甲状腺素受体蛋白含量；

(B14)制备检测或辅助检测待测样品中促甲状腺素受体蛋白含量的产品；

(B15)检测或辅助检测表达促甲状腺素受体蛋白的待测样品；

(B16)制备检测或辅助检测表达促甲状腺素受体蛋白的待测样品的产品；

(B17)用于制备靶向促甲状腺素受体蛋白的药物；

(B18)用于细胞之间促甲状腺素受体蛋白表达量的差异化研究。

优选的，所述促甲状腺素受体蛋白为人源性促甲状腺素受体蛋白。

优选的，所述待测样品为细胞或其他组织。

优选的，所述靶向促甲状腺素受体蛋白的药物与甲状腺疾病相关。

优选的，所述产品为试剂盒或探针或靶向物质。

本发明还提供了一种产品，其包括上述核酸适体。

优选的，所述产品为识别并结合或辅助识别并结合表达促甲状腺素受体蛋白的细胞或者靶向促甲状腺素受体蛋白的药物。

本发明的技术效果和优点：

本发明所述靶向促甲状腺素受体蛋白(TSHR)的核酸适体具有独特的茎环结构，通过流式检测发现其具有较高的结合亲和力和特异性，能特异性识别TSHR-293T细胞，不识别293T细胞。本发明的核酸适体可以进一步截短优化，分子量小，节约了合成成本，提高了亲和力，易修饰改造，无细胞毒性，结合特异型强，无免疫原性，稳定性高。上述优点使得所述核酸适体作为TSHR蛋白特异性识别分子探针，在诊断和靶向调节TSHR蛋白相关疾病的方面具有巨大潜力。

附图说明

图1为核酸适体结构式；

图2为流式细胞术荧光检测结果；

图3为核酸适体与TSHR-293T以及MOCK的结合情况；

图4为核酸适体对TSHR-293T的解离常数检测结果。

具体实施方式

本发明下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1核酸适体筛选

所用核酸文库和引物的设计：

合成长度为80nt的核苷酸文库序列(上海生工生物工程(上海)股份有限公司)，具体序列如下：

5’-ACCGACCGTGCTGGACTCA(N)42ACTATGAGCGAGCCTGGCG-3’

序列中两端为固定序列，其中42N代表42个随机碱基(N代表A、T、G、C四种任意碱基)，保证其库容量大约为10

采用如下引物进行扩增：

上游引物：5’-异硫氰酸荧光素-ACCGACCGTGCTGGACTCA-3’(如SEQ NO.2所示)；

下游引物：5’-生物素-CGCCAGGCTCGCTCATAGT-3’(如SEQ NO.3所示)；

以高表达TSHR的TSHR-293T为正筛靶标，以不表达TSHR的MOCK细胞为反筛靶标；

正筛选：

a.孵育：用结合缓冲液溶解上述随机DNA文库，95℃变性5min，冰上复性10min，然后与预处理好的培养48h以上细胞融合度达90％左右的TSHR-293T在4℃共孵育1h。

b.分离：将孵育后上清移除，用洗涤缓冲液冲洗孵育后细胞数次，随后取无菌水刮取洗涤后细胞与离心管，95℃变性10min，冰上复性10min，5500rpm离心3min，吸取上清即分离得到TSHR-293T细胞的第一轮筛选核酸文库。

c.PCR扩增文库：以步骤b中得到的文库为模板，上述引物为引物，扩增条件为：95℃，30s；55.9℃，30s；72℃，30s扩增8个循环，72℃，5min。得到初步扩增产物，而后以扩增产物为模板扩增合适循环数进行大量扩增。

d.DNA单链制备：用链霉亲和素修饰的琼脂糖珠分离生物素标记的步骤c中的PCR扩增产物反义链，而后以0.2M的NaOH将DNA双链变性，通过脱盐收集异硫氰酸荧光素标记的正义DNA单链文库。

反筛：将步骤d中所得到的DNA单链文库与反筛细胞MOCK细胞进行孵育，收集孵育后上清，以排除非特异性结合的核酸分子，收集上清可继续与正筛细胞孵育以进行下一筛选步骤。

筛选过程的循环：重复2.1和2.2的筛选过程，直至筛选到与靶细胞TSHR-293T细胞结合较强的核酸适体文库。

将筛选最后一轮结合最大的核酸文库进行高通量测序，利用流式检测所得序列与TSHR-293T细胞的结合能力，从而获得本发明的核酸适体，序列为ACCGACCGTGCTGGACTCATCTCGCTTTTTTCACGGTCCACACTACTATGAGCGAGCCTGGCG，如SEQ NO.1所示，所述核酸适体在25℃，1.0mM Na

通过流式细胞仪术进行荧光检测，DNA初始随机文库作为对照。第9轮筛选产物达到最大富集，且不与MOCK细胞结合，结果如图2所示，图中横坐标FAM代表荧光信号，纵坐标是细胞的数量。适体修饰FAM荧光，当与细胞孵育后，适体与细胞结合，则可检测出细胞上荧光信号。

由图2A可以看出，随着筛选的进行，相较与初始文库Lib，正细胞上的荧光信号在逐渐增强，在第九轮达到最大；而图2B中，随着筛选的进行，负细胞的荧光信号没有明显的变化。

实施例2核酸适体特异性检测

流式检测核酸适体与TSHR-293T以及MOCK的结合情况，除了本发明提供的核酸适体之外还设置有七组实施例1中获得的其他核酸适体，序列分别如下：

对照适体1，ACCGACCGTGCTGGACTCACAGAGGACACGAGAAGGGCACGGTACTATGAGCGAGCCTGGCG，如SEQ NO.4所示；

对照适体2，ACCGACCGTGCTGGACTCAACCATCTCTCCGAGAGCGCGAACTATGAGCGAGCCTGGCG，如SEQ NO.5所示；

对照适体3，ACCGACCGTGCTGGACTCACTCGCAAGGGCACTTTTTTTGGGTCGACTATGAGCGAGCCTGGCG，如SEQ NO.6所示；

对照适体4，ACCGACCGTGCTGGACTCAGGCCACCTCTGGTCGCTTGTGACTATGAGCGAGCCTGGCG，如SEQ NO.7所示；

对照适体5，ACCGACCGTGCTGGACTCACTCGCAAGGGCACTTTTTTTAGGTCGACTATGAGCGAGCCTGGCG，如SEQ NO.8所示；

对照适体6，ACCGACCGTGCTGGACTCACCAGAAATCGTTAGGCGGCCGGAACTATGAGCGAGCCTGGCG，如SEQ NO.9所示；

对照适体7，ACCGACCGTGCTGGACTCAACCACTCTTGGAGTCGATCAGGACTATGAGCGAGCCTGGCG，如SEQ NO.10所示。

分别培养TSHR-293T和MOCK 48h使细胞密度达90％，再分别用0.2％EDTA将贴壁状态的细胞从培养皿上消化下来。分别用200μl结合缓冲液配置250nM的合成好的FAM标记的核酸适体，95℃变性5min，冰上复性10min。与30万个TSHR-293T或MOCK细胞在4℃共孵育45min。使用洗涤缓冲液洗涤孵育后的细胞2-3次，而后将细胞重悬于300μl洗涤缓冲液中。通过流式细胞仪术进行荧光检测，DNA初始随机文库作为对照，结果如图3所示，横坐标FAM代表荧光信号，纵坐标是细胞的数量。

由图3可知，核酸适体只结合靶细胞TSHR-293T，不结合MOCK。适体可以使正细胞荧光信号增强，但没有对于负细胞没有明显增强，并且本发明提供的核酸适体相对于对照适体能够使正细胞有最大的位移，效果最好。

实施例3亲和力检测

使用0nM，25nM，50nM，75nM，100nM，150nM，200nM，250nM，300nM，400nM，800nM浓度梯度的核酸适体与靶细胞TSHR-293T来测定解离常数(Kd)，Kd值代表适体与细胞的亲和力，Kd值越小表明亲和力越高。首先，培养TSHR-293T细胞24h使细胞密度达90％，再分别用0.2％EDTA将贴壁状态的细胞从培养皿上消化下来。分别用200μl结合缓冲液配置上述各浓度的合成好的FAM标记的核酸适体，95℃变性5min，冰上复性10min。与30万个TSHR-293T细胞在4℃共孵育1h。使用洗涤缓冲液洗涤孵育后的细胞2-3次，而后将细胞重悬于300μl洗涤缓冲液中。通过流式细胞仪术进行荧光检测，同样浓度梯度的DNA初始随机文库作为对照。而后用Grahpad Prism 5软件作图，计算出所得本发明核酸适体的解离常数为242.6±40.5nM，结果如图4所示，横坐标代表适体浓度，纵坐标是细胞平均荧光强度。由图4可知，本发明中的核酸适体对靶细胞TSHR-293T具有较高的亲和力。

由以上实施例可知，本发明提供了一种靶向促甲状腺素受体蛋白(TSHR)的核酸适体，具有独特的茎环结构，通过流式检测发现其具有较高的结合亲和力和特异性，能特异性识别TSHR-293T细胞，不识别293T细胞。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。