一种适用于粉蚧人工接种植物病毒的装置

技术领域

本发明涉及植物病毒技术领域，特别涉及一种适用于粉蚧人工接种植物病毒的装置。

背景技术

植物病毒病是一类重要的植物病害，主要有刺吸式口器昆虫传播，切断传播介体是防治植物病毒病的一种重要途径，切断传播介体的前提是必须通过人工接种实验完成介体传播等传染性试验，完成介体接种验证，确定其传播介体。粉蚧是一类重要植物病毒传播介体，可以传播多种植物病毒病。现在需要一种适用于粉蚧人工接种植物病毒的装置，完成粉蚧接种，为揭示其介体传播模式，为植物病毒病的的防治奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中的需要一种适用于粉蚧人工接种植物病毒的装置，完成粉蚧接种，为揭示其介体传播模式的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明提供一种适用于粉蚧人工接种植物病毒的装置，其包括：金属箔，金属箔具有对折线，分别粘贴在金属箔对折线两侧且相互对应的第一柔性胶带，金属箔对折后，金属箔覆盖植物叶片接种区域的前后两面，叶片位于金属箔对折线两侧的第一柔性胶带之间，第一柔性胶带使金属箔与叶片之间形成缝隙，金属箔、第一柔性胶带以及叶片共同形成供粉蚧活动的接种空间，还包括对对折后的金属箔的侧边进行夹持的夹持件，夹持件使金属箔保持对折的状态的同时封闭接种空间，以防粉蚧逃逸。

进一步，金属箔为矩形，对折线与金属箔长度方向垂直且位于金属箔的中间位置，金属箔对折后，其对折线两侧的部分重合。

进一步，第一柔性胶带的长度小于或等于金属箔长度的二分之一。

进一步，第一柔性胶带为粘贴在金属箔上的泡沫胶带。

进一步，第一柔性胶带为粘贴在金属箔上的硅胶胶带。

进一步，夹持件为金属长夹，金属长夹具有长条形的第一夹持部和第二夹持部，连接第一夹持部和第二夹持部的连接部。

进一步，金属箔为锡纸。

进一步，还包括分别粘贴在金属箔对折线两侧且相互对应的第二柔性胶带，第二柔性胶带远离对折线设置且其一端靠近相近的第一柔性胶带的端部。

由上述技术方案可知，本发明的有益效果为：通过金属箔、第一柔性胶带和夹持件的设置，提供了一种便于确定病毒的媒介昆虫完成虫媒接种验证，测定粉蚧传播能力的金属虫笼，为植物病毒病的的防治奠定基础。

附图说明

图1是本申请提供的金属虫笼展开状态的示意图；

图2是本申请提供的金属虫笼的使用状态的示意图；

图3是本申请提供的第二柔性胶带的示意图；

图4是本申请提供的L型第一柔性胶带的示意图；

图5是本申请提供的双条拂粉蚧不同龄期对APV1接种率的影响图；

图6是本申请提供的饥饿处理时间对双条拂粉蚧APV1病毒获得率的影响图；

图7是本申请提供的 PCR检测饥饿处理后粉蚧的APV1病毒的影响图；

图8是本申请提供的获毒时间对于植株接种APV1效率影响图；

图9是本申请提供的获毒时间与APV1传播效率酶促曲线图；

图10是本申请提供的接种时间对于植株接种APV1效率影响图；

图11是本申请提供的接种时间与APV1传播效率酶促曲线图；

图12是本申请提供的获毒时间、接种时间对传播效率的影响图。

附图标记说明如下：1、金属箔；2、第一柔性胶带；21、第二柔性胶带；3、金属长夹。

具体实施方式

体现本发明特征与优点的典型实施方式将在以下的说明中详细叙述。应理解的是本发明能够在不同的实施方式上具有各种的变化，其皆不脱离本发明的范围，且其中的说明及图示在本质上是当作说明之用，而非用以限制本发明。

在本申请的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个所述特征。在本申请的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

为了进一步说明本发明的原理和结构，现结合附图对本发明的优选实施例进行详细说明。

请参阅图1-12，为本实施例提供的一种适用于粉蚧人工接种植物病毒的装置，包括金属箔1、第一柔性胶带2和夹持件，金属箔1的中央位置形成有对折线，使用时，将需要对粉蚧进行接种的叶片置于金属箔1内，粉蚧的接种区域可以是叶片整体，也可以是叶片的部分区域，随后对折金属箔1，使金属箔1覆盖叶片接种区域的前后两面；第一柔性胶带2数量为两个以上，优选为两个，分别粘贴在金属箔1对折线的两侧且相互对应，金属箔1对折时，两个第一柔性胶带2相互靠近，最终与叶片的正反面接触，第一柔性胶带2使金属箔1与叶片之间形成缝隙，金属箔1、第一柔性胶带2以及叶片共同形成供粉蚧活动的接种空间，接种区域位于或部分位于接种空间内；在上述工作完成后，可在接种空间内置入粉蚧，置入粉蚧后，使用夹持件对对折后的金属箔1侧边进行夹持，夹持件使金属箔1保持对折的状态的同时封闭接种空间，以防粉蚧逃逸。

由于亚克力或聚乙烯材料携带静电且无法去除，将会对小体积的 1 龄粉蚧接种产生严重影响，因此采用金属材料制作接种笼，并且根据叶片扁平、多叶脉特点设计，使用可塑性较强的金属箔1为材料自制接种笼。

上述金属箔1可以是圆形，也可以是矩形，也可以是其他可对称的形状，本申请实施例的金属箔1优选为矩形，对折线与矩形金属箔1的长度方向垂直且位于金属箔1的中间位置，金属箔1对折后，其对折线两侧的部分重合。

上述第一柔性胶带2为长条形，如图1所示，长条形的第一柔性胶带2粘贴在金属箔1靠近底部的侧边上，夹持件对金属箔1粘贴有第一柔性胶带2的部分进行夹持，使两侧的第一柔性胶带2紧紧贴附在叶片的表面，对接种空间的下端进行封闭，防止粉蚧逃逸，并且在夹持时，由于第一柔性胶带2为柔性胶带，两侧的第一柔性胶带2在夹持件的作用下将会产生形变，对叶片进行挤压，可增大夹持件作用于叶片上的夹持力，并且形变后的第一柔性胶带2可消除叶脉的影响，与叶面贴合的更加紧密，进一步防止粉蚧逃逸。

上述第一柔性胶带2具有一定的厚度，其厚度为3mm以上，第一柔性胶带2的长度小于或等于金属箔1长度的二分之一。

上述第一柔性胶带2可以为一面粘贴在金属箔1上的泡沫胶带，也可以是一面粘贴在金属箔1上的硅胶胶带，也可以是其他可以实现上文第一柔性胶带2功能的胶带。

上述第一柔性胶带2并不局限于长条形，作为本申请优选的实施例，第一柔性胶带2也可以是图3所示的L型，当第一柔性胶带2为L型时，夹持件对L型胶带的横向部位和竖向部位进行夹持，可以提高接种空间的封闭效果，进一步防止粉蚧逃逸。

作为本申请优选的实施例，当第一柔性胶带2为图1所示的一字长条型时，还包括粘贴在金属箔1上的第二柔性胶带21，金属箔1展开时，第二柔性胶带21和第一柔性胶带2在金属箔1的同一面上，第二柔性胶带21同样位于对折线的两侧，但是第二柔性胶带21远离对折线设置，第二柔性胶带21的一端靠近相近的第一柔性胶带2的端部，第二柔性胶带21的一端靠近相近的第一柔性胶带2的端部是为了保证接种空间的封闭效果，使用时，操作者可根据接种空间需要的大小来选择第二柔性胶带21的粘贴位置，从而可灵活的选择接种空间的大小，提高接种的效果。

上文所述的夹持件为附图所示的金属长夹3，金属长夹3具有长条形的第一夹持部和第二夹持部，连接第一夹持部和第二夹持部的连接部，通常情况下，金属长夹3的数量为两个，当金属长夹3具有两个时，两个金属长夹3相互垂直，一个金属长夹3封闭接种空间的下方出口，另一个金属长夹3封闭接种空间的侧边，防止金属箔1上方展开，当需要观察粉蚧取食情况时，也可以取下侧边的金属长夹3；但是当第一柔性胶带2为L型时，金属长夹3也可以为L型，L型的金属长夹3可同时对对折后的金属箔1的两个侧边进行夹持，不需要分两次夹持来封闭接种空间，可以减少操作步骤。

上述金属箔1可以是铜箔、铝箔、锡纸（锡箔），优选为锡纸，使用锡纸可以降低成本，具有更好的经济性。

以下为使用本装置进行的试验

试验附图中，阳性对照“+”为带毒双条拂粉蚧，阴性对照“-”为南瓜上饲养的未获毒双条拂粉蚧，H2O为水对照。

试验1：

利用该装置测定双条拂粉蚧(Ferrisia virgata）龄期对于传播APV1的影响。

供试品种：“双条拂粉蚧”，收集分子鉴定使用的单只雌虫产下的卵，25 ± 1℃ 实验室过夜孵化后在南瓜上生长33d（蜕皮三次）至成虫后，收集10只成虫产下的卵，在新的南瓜上隔离培养，孵化后3d的1龄幼虫作为接种用虫。

供试植株：槟榔植株中国热带农业科学院椰子研究所种苗热研1号（一年生幼苗），基质为蛭石与营养土混合(3∶1)；恒温培养箱（28℃±1℃，RH70%－80%，光照周期(L：D)14h∶10h）内进行培养成苗

试验处理：

测定24h AAP（获毒时间）条件下，1龄幼虫与3龄成虫的获毒率与传毒效率，获毒效率比较了两种龄期各18只虫。成虫使用10株槟榔进行传毒实验，24hAAP（获毒时间）、48hIAP（接种时间），每株槟榔5只3龄粉蚧。

试验结果：

实验测试了24h AAP的20只1龄粉蚧与20只3龄成虫的带毒效率，从图5结果可知，两种龄期的获毒概率均为100%，但传毒效率上存在显著差异（χ2检验，p＜0.001[1龄幼虫]，p=0.0004[3龄成虫]），1龄粉蚧在传播过程中更具有优势，通过本实验选定了接种粉蚧龄期为1龄粉蚧。

表1成年粉蚧与1龄粉蚧接种效率的差异显著性分

试验2：

利用该装置测定饥饿处理对于双条拂粉蚧(Ferrisia virgata）传播APV1的影响。

供试品种：“双条拂粉蚧”，收集分子鉴定使用的单只雌虫产下的卵，25 ± 1℃ 实验室过夜孵化后在南瓜上生长33d（蜕皮三次）至成虫后，收集10只成虫产下的卵，在新的南瓜上隔离培养，孵化后3d的1龄幼虫作为接种用虫。

供试植株：槟榔植株中国热带农业科学院椰子研究所种苗热研1号（一年生幼苗），基质为蛭石与营养土混合(3∶1)；恒温培养箱（28℃±1℃，RH70%－80%，光照周期(L：D)14h∶10h）内进行培养成苗

试验处理：

比较了饥饿处理对于双条拂粉蚧获毒能力的影响，设置6h、12h 2个饥饿时间，每个时间使用RT-PCR测试20只粉蚧，毒株上的获取时间均为1h。

实验结果：

双条拂粉蚧的1龄幼虫最短可以通过1h取食带毒槟榔获得APV1，从南瓜上收集的20只1龄幼虫在6h饥饿处理后于槟榔叶片上取食1h带毒率达到85%.并且在不同的饥饿处理下获毒效率存在较大差异，在相同的1h获毒时间条件下，12h饥饿处理的双条拂粉蚧获毒率要显著低于6h饥饿处理如图6、图7（a）和图7（b）。获毒率的差异可能是由于1龄幼虫活力丧失导致的，因此获毒实验采用6h饥饿处理以达到最大接种效率。

试验3：

利用该装置测定柑橘棘粉蚧(Pseudococcus cryptus)在 APV1 寄主植物上传毒能力测定。

供试品种：“双条拂粉蚧”，收集分子鉴定使用的单只雌虫产下的卵，25 ± 1℃ 实验室过夜孵化后在南瓜上生长33d（蜕皮三次）至成虫后，收集10只成虫产下的卵，在新的南瓜上隔离培养，孵化后3d的1龄幼虫作为接种用虫。

供试植株：槟榔植株中国热带农业科学院椰子研究所种苗热研1号（一年生幼苗），基质为蛭石与营养土混合(3∶1)；恒温培养箱（28℃±1℃，RH70%－80%，光照周期(L：D)14h∶10h）内进行培养成苗

实验处理：

（1）获毒时间（acquisition access periods，AAP）的测定

在南瓜上取大量3龄若虫饥饿12h，放在携带APV1槟榔植株上进行获毒，获毒时间为1h、3h、6h、12h、24h、48h，每个梯度分别挑取20头用RT-PCR检测病毒摄取情况，确定粉蚧携带APV1再进行接种（避免虫体不带毒导致接种不成功）；获毒时间（AAP）梯度为1h、3h、6h、12h、24h、48h。接种时间为72h。每个梯度14株苗、每株20头虫接种；1株接种饲养在南瓜上的无毒粉蚧，作为对照组；在接种90d后使用RT-PCR的实验方法进行检测，并观察槟榔黄化病表型。

（2）接种时间(inoculation access period,IAP)的测定

挑取在南瓜上饲养的三龄若虫，饥饿12h，获毒时间（AAP）为72h。接种时间梯度为30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h。每个梯度14株苗、每株20头虫接种；1株接种饲养在南瓜上的无毒粉蚧，作为对照组；在接种后3个月使用3.2.2-3.2.4的实验方法进行检测，并观察槟榔黄化病表型。

实验结果：

表2获毒时间对于APV1传播效率影响

（1）获毒时间（acquisition access periods，AAP）测定结果

借鉴Burrows公式p = 1–[(2kR + k – 1)/(2kN + k – 1)]1/k，对单只粉蚧的传播率进行计算，p为单只粉蚧的传播病毒概率，k为每组接种实验所用的柑橘棘粉蚧总数，R为每组接种实验的未携带APV1病毒的植株数目，N为每组接种实验所用的植株总数(Swallow, 1985)。根据传播速率y与获取访问期x的关系拟合曲线（如图8、表2）y =2.182x/[81.62 + x]，df=6,R2=0.9817,AICc =-36.14; 线性相关系数R2=0.9817表明Michaelis-Menten模型拟合良好，二者呈现典型的正相关。揭示了在不同的获取时间下的传播速率，随着时间增长，接种效率显著增加，病毒传播发生在1h获毒时间，并在72h获取时间时接种率达到最大100%；柑橘棘粉蚧获取APV1病毒的效率促进病毒的传播,揭示了APV1病毒在柑橘棘粉蚧体内存在积累的过程,这是半持久性传播模式病毒的特征之一。分析图8、表2可知，获毒1h和3h接种率低、接种不成功是由单只粉蚧传播APV1的概率较低所导致，在一次证明传播速率与获取访问期密切相关。

（2）接种时间(inoculation access period,IAP)测定结果

为了确定携带APV1柑橘棘粉蚧局部接种，是如何迅速传播到未接种的植株上，将在南瓜果实上饲养的3龄粉蚧转移到携带APV1的槟榔植株上，在获取时间72 h后，在受测试植株上进行72 h的接种。由图11、12与表3的数据可知，传播速率y与接种x的关系拟合曲线（如图12）y = 1.104x/[18.29 + x],df = 6, R2 = 0.9351, AICc = -28.16; 线性相关系数R² = 0.9351表示Michaelis-Menten模型拟合良好，二者呈典型的正相关，传播速率与粉蚧接种时间密切相关，接种时间为3h，随着接种时间的延长传播效率提高，且当接种时间达到72h时接种率达到最大100%。此结果揭示了，当柑橘棘粉蚧获取病毒达到成功接种所用滴度时，传播速率受到接种时间的限制，这与刺吸式昆虫的取食行为有关，成功接种的必要条件之一是粉蚧频繁使用口针刺入植株叶片或韧皮部取食汁液。通过接种实验的观察发现柑橘棘粉蚧的取食行为更倾向于槟榔叶片背面的叶脉位置，在早期的报道中说明长线型病毒科病毒在植株的韧皮部含量较高，粉蚧的这种取食倾向性提高APV1的传播效率。

（3） AAP与IAP

根据Michaelis-Menten模型和logistic回归结果 (图9、图11) 分析，AAP和IAP模型(AICAAP+IAP=170.0)和AAP、IAP单模型(AICAAP=168.5, AICIAP=170.0)比对，AIC值相差不大，说明IAP和AAP对传播概率的影响相似。根据IAP与AAP的检测结果（图12）可以发现，24h为一个临界点，在24h前获毒时间对于接种效率的影响要低于接种时间的影响，由此推断柑橘棘粉蚧的短时间取食行为是APV1的传播的限制因素，可能与柑橘棘粉蚧的APV1保留位置有关。在24h以后获毒时间的影响超过接种时间的影响，且在72h时接种效率达到最大（100%），猜想24h以内柑橘棘粉蚧更倾向于把 APV1保留在体内。

虽然已参照几个典型实施方式描述了本发明，但应当理解，所用的术语是说明和示例性、而非限制性的术语。由于本发明能够以多种形式具体实施而不脱离发明的精神或实质，所以应当理解，上述实施方式不限于任何前述的细节，而应在随附权利要求所限定的精神和范围内广泛地解释，因此落入权利要求或其等效范围内的全部变化和改型都应为随附权利要求所涵盖。