一种大鼠被动型海曼肾炎模型的构建方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种大鼠被动型海曼肾炎模型的构建方法。

背景技术

临床上原发性膜性肾病是成人肾病综合征的主要病理类型，然而关于其组织损伤及进展机制目前仍未了解清楚。海曼(Heymann)肾炎模型作为研究人类模型肾病的经典动物模型，可用于原发性膜性肾病的研究，应用较为广泛。

海曼肾炎模型属于异种免疫性抗肾小球基膜肾炎，其造模机制是用于甲种动物的肾皮质匀浆免疫乙种动物，使乙种动物产生抗甲种动物的抗肾血清(抗肾抗体)，然后再将抗肾血清注入健康的甲种动物体内，诱发其产生肾炎。由于这种肾炎模型的建立是通过被动地注射抗体形成的，所以又被成为被动型海曼肾炎(Passive Heymann Nephritis,PHN)。

PHN是研究产生蛋白尿肾脏损害较理想的动物模型，这是因为肾脏是模型动物损害的唯一靶器官，所用的抗体很少，且病变出现较快，病理改变特征与人类膜性肾病相似。据以往的研究报道称，目前通常采用一次性静脉注入抗beta 2Microglobulin抗血清的方法建立PHN模型，虽然模型发病迅速，但由于其病程短、病情易缓解，不能满足长期观察的需要。因此需要构建一种病程更长的PHN模型，以满足长期观察的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大鼠被动型海曼肾炎模型的构建方法，以解决背景技术中存在的问题。

为了实现上述目的，本发明设计了一种大鼠被动型海曼肾炎模型的构建方法，包括如下步骤：间隔24h对大鼠进行多次尾静脉注射Sheep Anti-Rat Fx1A Serum。

进一步的，所述大鼠为雄性，种属品系为Lewis，等级为SPF，体重为200-220g。

进一步的，间隔24h对大鼠进行2次尾静脉注射，其中在0-1min注射第一针，在24h后的0-1min注射第二针。

进一步的，所述尾静脉注射的注射量为3-8mL/kg，优选为5mL/kg。

进一步的，在进行尾静脉注射时，大鼠为趴卧位，以酒精擦拭鼠尾，使血管清晰，在远心端1/3处进针，观察回血确认针头进入血管，在1min内注射完毕。

与现有技术相比，本发明的大鼠被动型海曼肾炎模型的构建方法具有如下优点：

本发明中，通过对大鼠进行两次尾静脉注射Sheep Anti-Rat Fx1A Serum，成功构建了大鼠PHN模型，模型大鼠表现出大量蛋白尿为特征的肾病综合征，病程长、病情不易缓解，能够满足长期观察的需求。本发明的建模方法简单，易于实现，可为动态观察模型动物的肾损害、探讨PHN的发病机制及研发人类模型肾病的药物治疗方面等提供研究帮助。

附图说明

图1：G1、G2和G3组大鼠的体重变化曲线图。

其中，Two-way ANOVA：*P<0.05，***P<0.001vs.Control serum(G1)；###P<0.001vs.Fx1A Serum(5mL/kg)(G2)。

图2：G1、G2和G3组大鼠的24h尿白蛋白含量变化曲线图。

其中，Two-way ANOVA：*P<0.01，***P<0.001vs.Control serum(G1)；###P<0.001vs.Fx1A Serum(5mL/kg)(G2)。

图3：G1、G2和G3组大鼠的24h尿总蛋白含量变化曲线图。

其中，Two-way ANOVA：*P<0.01，***P<0.001vs.Control serum(G1)；###P<0.001vs.Fx1A Serum(5mL/kg)(G2)。

图4：G1、G2和G3组大鼠的24h尿白蛋白肌酐比含量变化曲线图。

其中，Two-way ANOVA：***P<0.001vs.Control serum(G1)；###P<0.001vs.Fx1ASerum(5mL/kg)(G2)。

图5：G1、G2和G3组大鼠的肾脏PAS染色示意图。

图6：G1、G2和G3组大鼠的肾小球PAS染色阳性面积占比柱状图。

其中，One-way ANOVA：*p<0.05vs.Control serum(G1)。

图7：G1、G2和G3组大鼠的肾小球C3d免疫组化染色图。

图8：G1、G2和G3组大鼠的肾小球C3d免疫组化染色强度评分柱状图。

其中，One-way ANOVA：***P<0.001vs.Control serum(G1)；##P<0.01vs.Fx1ASerum(5mL/kg)(G2)。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

一、大鼠购买及饲养

购买的大鼠信息如表1所示。

表1大鼠信息

二、大鼠的饲养

大鼠购买后，兽医对大鼠进行体检，然后对大鼠进行实验前期的检疫和适应。实验前期是从大鼠到达日开始至模型诱导开始的当日，实验前期至少为3天。

饲养时，将大鼠饲养于屏障系统中，动物房的环境条件控制为20-26℃，湿度40-70％，饲养人员每天上午和下午各记录一次，动物房内每小时空气更换10-20次，动物房内的照明按照12/12小时明暗循环交替进行，实验活动中必须进行的中断除外，但需对中断进行记录。入组实验后，大鼠进行合笼饲养，每笼3-4只，动物笼具采用聚砜材质的塑料笼具，带有玉米芯垫料，动物笼具中设有供大鼠啃咬或遮蔽的玩具，为动物提供丰富的生活环境。笼具内设有笼卡，笼卡上记载有试验号、组别、性别、动物名称和数量，大鼠按照组别依次排列。

由北京科奥协力饲料有限公司的饲料对大鼠进行正常饲料喂养，动物自由采食。添加任何额外的实物都需经过专题负责人的许可并记录。由自动饮水装置提供二级反渗透水为大鼠供水。

三、主要仪器和试剂

试验过程中用到的仪器和试剂如表2和表3所示。

表2主要仪器

表3主要试剂

实施例1大鼠分组及模型建立

大鼠经过检疫期后，将大鼠分为三组。分组前，首先对大鼠进行尿液生化指标测试，计算白蛋白/肌酐的值，并对大鼠进行称重；确保各组间，任意两组大鼠的白蛋白/肌酐的值以及体重，统计学t-test，p>0.05，即确保分组后，各组间大鼠的体重差异最小，白蛋白/肌酐的值差异也最小。

分别为：

G1组：记为control serum，n＝3；

G2组：记为Fx1A Serum(5mL/kg)，n＝7，对G2组大鼠通过尾静脉注射Sheep Anti-Rat Fx1A Serum建立PHN模型，以注射当天为Day0计，G2组大鼠在Day0静脉注射抗血清；注射时，大鼠为趴卧位，以酒精擦拭鼠尾，使血管清晰，在远心端1/3处进针，观察回血确认针头进入血管，在1min内注射完毕。

G3组：记为Fx1A Serum(5mL/kg*2)，n＝7，对G3组大鼠通过尾静脉注射SheepAnti-Rat Fx1A Serum建立PHN模型，以注射当天为Day0计，G3组大鼠分别在Day0和Day1静脉注射抗血清。注射时，大鼠为趴卧位，以酒精擦拭鼠尾，使血管清晰，在远心端1/3处进针，观察回血确认针头进入血管，在1min内注射完毕；其中在0-1min注射第一针，在24h后的0-1min注射第二针。间隔24h注射是因为在尾静脉注射首针Sheep Anti-Rat Fx1ASerum后，动物会出现精神萎靡、行动迟缓的症状，在注射1h左右后恢复，为了减少注射SheepAnti-RatFx1A Serum对大鼠造成的不良反应对检测结果造成影响，所以间隔24h后再进行第二针注射。

实施例2模型指标检测

2.1体重

对G1组大鼠，自试验开始当日起，每周测定2次体重。

对G2组和G3组大鼠，自注射首针Sheep Anti-Rat Fx1A Serum的当天开始，每周测定2次体重。

2.2尿液生化指标检测

以注射当天为Day0计，对G1组、G2组和G3组大鼠，分别在Day2、Day7、Day14和Day28，进行尿液生化指标检测。

检测指标有：白蛋白、总蛋白和白蛋白肌酐比。

2.3大鼠肾脏病理组织检测

试验动物经异氟烷深度麻醉后，安乐死动物，动物进行在体生理盐水灌流；肾脏固定于10％福尔马林中，石蜡包埋，切成片厚3μm切片，PAS(Periodic Acid-Schiff，高碘酸—希夫)染色、或使用C3d抗体进行免疫组织化学染色，染色的切片经Hamamatsu NanozoomerS210切片扫描仪进行全片扫描。

实施例3试验检测结果

如图1所示，给出了各组大鼠的体重变化曲线图，可看出，G2组经Fx1A Serum单次注射的大鼠和G1组Control serum的大鼠体重增长相近，G3组经Fx1A Serum两次注射的大鼠体重增长速度更慢，且在Day13之后体重显著低于G1组和G2组。

如图2、3和4所示，分别给出了各组大鼠的尿液白蛋白、尿液总蛋白、以及尿液白蛋白肌酐的变化曲线图。可看出，上述三项检测指标均具有相同的变化趋势，即：G2组大鼠的三项检测数值在Day7日略微升高，在Day14日达到顶峰，在Day28日略有回落；而G3组大鼠的上述三项检测数值的水平始终高于G2组大鼠，且在检测期间，三项检测数值水平始终处于增长状态，无明显回落，且高数值水平维持的时间更长，说明G3组大鼠的模型可维持时间更长；同时，G1组大鼠的三项检测数值始终处于较低水平。

如图5所示，给出了各组大鼠的肾脏PAS染色示例图，着色阴影区越多，说明肾小球系膜增厚越显著。可见，进行两次尾静脉注射的G3组大鼠的肾小球系膜增厚严重，肾炎症状更明显。

如图6所示，给出了各组大鼠的肾小球PAS染色阳性面积占比变化，可看出，G2组大鼠的肾小球染色阳性面积高于G1组，但无统计学差异，而G3组大鼠的肾小球染色阳性面积显著高于G2组。

如图7所示，给出了各组大鼠的肾小球C3d免疫组化染色图，着色表示染色阳性，着色越多、颜色越深，说明C3d表达越多，可看出，G3组大鼠的肾小球C3d免疫组化染色阳性最显著。

如图8所示，给出了各组大鼠的肾小球C3d免疫组化染色强度评分，可看出，G2组大鼠的肾小球C3d免疫组化染色强度评分高于G1组大鼠，但无统计学差异；而G3组大鼠的肾小球C3d免疫组化染色强度评分分别显著高于G1组大鼠和G2组大鼠。

本发明在一次性尾静脉注射抗血清的基础上，在24h后再进行一次尾静脉注射抗血清，成功建立了大鼠PHN模型，模型动物表现出大量蛋白尿为特征的肾病综合征，病理表现为肾小球肾小球基底膜弥漫性增厚，肾小球基底膜外侧免疫复合物沉积和足突融合。本模型可用于动态观察模型动物的肾损害、PHN的发病机制及人类膜性肾病的药物治疗方面的研究。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制发明，凡在本发明的设计构思之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。