一种提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法及其应用

技术领域

本发明属于蛋白质分析技术领域，具体涉及一种提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法及其应用。

背景技术

在真核细胞中，由各种蛋白质激酶的蛋白质磷酸化作用在多种细胞过程中具有重要作用。同时，蛋白质磷酸化几乎只发生在酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基上，而酪氨酸激酶被认为是药物靶标最重要的组分之一。

通过基于质谱（MS）进行鉴定磷酸化氨基酸中最重要的步骤是在MS分析前富集磷酸化蛋白或磷酸化肽段。Src同源性2(SH2)结构域，具有结合含磷酸化酪氨酸的肽段。通过对SH2结构域进行改造，其对于具有含磷酸化酪氨酸的肽亲和力显著地增强，该被改造的变体SH2结构域被称为超结合体（Superbinder）。

通过使用琼脂糖与SH2进行偶联，构成SH2-磁珠，其允许从细胞或组织的蛋白酶切多肽中富集含磷酸化酪氨酸的多肽。

现有流程中，蛋白酶切产物中含有胰蛋白酶，会对偶联到琼脂糖微球上的SH2蛋白存在一定程度的酶切，导致微球上有效的SH2比例下降，进一步导致酪氨酸磷酸化富集效率低，质谱中存在高强度SH2蛋白的鉴定。

尽管目前已有一种新方法，即在样本富集前加入一种蛋白酶抑制苯甲基磺酰氟（PMSF），进行提升磷酸化酪氨酸鉴定数目，但是仍不能解决SH2蛋白的高强度鉴定。因此，开发一种提高酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法实验方法在鉴定磷酸化氨基酸中具有重要应用价值。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法及其应用。本发明主要改进了基于SH2-超结合体的酪氨酸磷酸化富集方法，结合高温处理对残留胰蛋白酶的活性进行抑制，减少其对偶联到琼脂糖微球上SH2的酶切，减少样品中SH2的检出，提升酪氨酸磷酸化肽段（pY）的鉴定效率。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法，所述方法包括：

（1）采用胰蛋白酶酶切酪氨酸，获得酪氨酸磷酸化肽段；

（2）依次对获得的酪氨酸磷酸化肽段进行高温处理和蒸干后复溶；或依次对获得的酪氨酸磷酸化肽段进行蒸干后复溶和高温处理；

（3）采用SH2-磁珠富集酪氨酸磷酸化肽段。

本发明通过采取高温处理和蒸干后复溶或蒸干后复溶和高温处理上述两种处理方式对胰蛋白酶酶切后的肽段进行灭活，再进行酪氨酸磷酸化肽段的富集，与常规的处理方式相比上述灭活方式处理后，酪氨酸磷酸化肽段鉴定数目显著增多，同时能够显著降低SH2蛋白的鉴定强度。

优选地，步骤（1）中，所述酶切的反应体系包括胰蛋白酶、酶切溶液和酪氨酸。

优选地，所述胰蛋白酶在反应体系的终浓度为0.02-0.1 μg/μL，例如可以是0.02μg/μL、0.04 μg/μL、0.05 μg/μL、0.06 μg/μL、0.08 μg/μL或0.1 μg/μL等。

优选地，所述酪氨酸在反应体系的终浓度为1.5-2.5 μg/μL，例如可以是1.5 μg/μL、1.7 μg/μL、1.9 μg/μL、2.0 μg/μL、2.1 μg/μL、2.3 μg/μ或2.5μg/μL等。

优选地，所述酶切溶液按浓度计包括：45-55mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）（例如可以是45 mM、47 mM、49 mM、50 mM、51 mM、53 mM或55 mM等），pH=7.5-8.0，例如可以是7.5、7.7、7.9或8.0等。

优选地，步骤（1）中，所述酶切的温度为30-37℃，例如可以是30℃、31℃、33℃、35℃或37℃等。

优选地，步骤（1）中，所述酶切的时间为12-18 h，例如可以是12 h、14 h、16 h或18h等。

优选地，步骤（2）中，所述高温处理的温度为80-100℃，例如可以是80℃、85℃、90℃、95℃或100℃等，优选为90-100℃，进一步优选为90-95℃。

优选地，步骤（2）中，所述高温处理的时间为15-30分钟，例如可以是15、20、25或30等，优选为15-25分钟，进一步优选为15-20分钟。

本发明中，上述高温处理的条件，可在短时间内快速对胰蛋白酶活性进行抑制，同时不引入新的试剂。

优选地，步骤（2）中，所述蒸干的条件为40-50℃真空浓缩，例如可以是40℃、45℃或50℃等。

优选地，所述真空浓缩的真空度为20±5 hPa例如可以是15 hPa、20 hPa或25 hPa等。

本发明中，上述蒸干处理的条件，能够保护酪氨酸磷酸化肽段不会降解。

优选地，步骤（2）中，所述复溶的溶剂为酶切溶液。

作为本发明的优选实施方式，所述提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法包括：

（1）采用胰蛋白酶酶切酪氨酸，所述酶切的反应体系包括胰蛋白酶、酶切溶液和酪氨酸；所述酶切的温度为30-37℃，时间为12-18 h；获得酪氨酸磷酸化肽段；

（2）在80-100℃对获得的酪氨酸磷酸化肽段进行高温处理15-30分钟，将高温处理后的酪氨酸磷酸化肽段在40-50℃真空浓缩，真空度为20±5 hPa；蒸干后采用酶切溶液复溶；

（3）采用SH2-磁珠富集酪氨酸磷酸化肽段。

作为本发明的优选实施方式，所述提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法包括：

（1）采用胰蛋白酶酶切酪氨酸，所述酶切的反应体系包括胰蛋白酶、酶切溶液和酪氨酸；所述酶切的温度为30-37℃，时间为12-18 h；获得酪氨酸磷酸化肽段；

（2）将获得的酪氨酸磷酸化肽段在40-50℃真空浓缩，真空度为20 hPa；蒸干后采用酶切溶液复溶；在80-100℃对复溶的酪氨酸磷酸化肽段进行高温处理15-40分钟；

（3）采用SH2-磁珠富集酪氨酸磷酸化肽段。

第二方面，本发明提供一种酪氨酸磷酸化肽段检测和定量的方法，所述方法包括：采用第一方面所述的提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法进行磷酸化肽段富集，然后采用液质联用检测系统对所述磷酸化肽段进行检测。

本发明中，还提供了一种基于液质联用检测系统对所述磷酸化肽段进行检测的方法，基于上述富集方法，得到待检测样品中SH2蛋白含量低，对后续的液质联用检测干扰较小。

第三方面，本发明提供第一方面所述的提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法在酪氨酸磷酸化蛋白质组学检测中的应用。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明中同一多肽起始量下，采用高温处理和蒸干后复溶或蒸干后复溶和高温处理上述两种处理方式，与非本发明处理方式相比，酪氨酸磷酸化肽段鉴定数目显著增多；同时，与加入苯甲基磺酰氟等蛋白酶抑制剂的方式相比，质谱鉴定的SH2蛋白强度显著降低。

附图说明

图1是不同胰蛋白酶灭活方式流程图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供一种提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法，所述方法包括：

（1）采用胰蛋白酶酶切酪氨酸，所述酶切的反应体系包括胰蛋白酶、酶切溶液和酪氨酸；所述酶切的温度为37℃，时间为12 h；酶切后于赛默飞世尔公司的高速冷冻离心机以15000 g条件离心1 min，后放置于磁力架上，静置2 min，转移上清于新的离心管中进行收集。

（2）将收集好的多肽，放置于恒温振荡器上，在95℃下静置，高温处理15 min，随后取下，等自然冷却。

（3）取出BCA定量为200 μg的多肽溶液采用SH2-磁珠进行磷酸化酪氨酸富集实验。

实施例2

本实施例提供一种提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法，所述方法包括：

（1）采用胰蛋白酶酶切酪氨酸，所述酶切的反应体系包括胰蛋白酶、酶切溶液和酪氨酸；所述酶切的温度为37℃，时间为12 h；酶切后于赛默飞世尔公司的高速冷冻离心机以15000 g条件离心1 min，后放置于磁力架上，静置2 min，转移上清于新的离心管中进行收集。

（2）将收集好的多肽，放置于艾本德公司的真空浓缩仪中进行蒸干，温度为45℃，真空度为20 hPa，待使用时，加入酶切溶液，于涡旋振荡器上振荡10 min，后在高速冷冻离心机以15000 g条件离心1 min，转移上清至新的离心管。随后，将复溶好的多肽放置于恒温振荡器上，在95℃下静置，高温处理15 min，随后取下，等自然冷却。

（3）取出BCA定量为200 μg的多肽溶液采用SH2-磁珠进行磷酸化酪氨酸富集实验。

实施例3

本实施例提供一种提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法，所述方法包括：

（1）采用胰蛋白酶酶切酪氨酸，所述酶切的反应体系包括胰蛋白酶、酶切溶液和酪氨酸；所述酶切的温度为37℃，时间为12 h；酶切后于赛默飞世尔公司的高速冷冻离心机以15000 g条件离心1 min，后放置于磁力架上，静置2 min，转移上清于新的离心管中进行收集。

（2）将收集好的多肽，放置于恒温振荡器上，在95℃下静置，高温处理15 min，随后取下，等自然冷却后，放置于艾本德公司的真空浓缩仪中进行蒸干，温度为45℃，真空度为20 hPa，待使用时，加入酶切溶液，于涡旋振荡器上振荡10 min，后在高速冷冻离心机以15000 g条件离心1 min，转移上清至新的离心管。

（3）取出BCA定量为200 μg的多肽溶液采用SH2-磁珠进行磷酸化酪氨酸富集实验。

对比例1

本对比例提供一种酪氨酸磷酸化肽段富集的方法，所述方法包括：

（1）采用胰蛋白酶酶切酪氨酸，所述酶切的反应体系包括胰蛋白酶、酶切溶液和酪氨酸；所述酶切的温度为37℃，时间为12 h；酶切后于赛默飞世尔公司的高速冷冻离心机以15000 g条件离心1 min，后放置于磁力架上，静置2 min，转移上清于新的离心管中进行收集。

（2）取出BCA定量为200 μg的多肽溶液采用SH2-磁珠进行磷酸化酪氨酸富集实验。

对比例2

本对比例提供一种酪氨酸磷酸化肽段富集的方法，所述方法包括：

（1）采用胰蛋白酶酶切酪氨酸，所述酶切的反应体系包括胰蛋白酶、酶切溶液和酪氨酸；所述酶切的温度为37℃，时间为12 h；酶切后于赛默飞世尔公司的高速冷冻离心机以15000 g条件离心1 min，后放置于磁力架上，静置2 min，转移上清于新的离心管中进行收集。

（2）向上清中加入苯甲基磺酰氟孵育，孵育的时间为一小时，所述苯甲基磺酰氟在反应体系中的终浓度为0.30 µg/µL。

（3）取出BCA定量为200 μg的多肽溶液采用SH2-磁珠进行磷酸化酪氨酸富集实验。

实施例1-3和对比例1-2中的方法中，不同胰蛋白酶灭活方式流程图如图1所示。

将实施例1-3和对比例1-2中收集的酪氨酸磷酸化肽段采用赛默飞世尔公司的BCA蛋白质定量检测试剂盒进行定量，定量步骤如下所示：

（1）依次加入标准品、样本10 μL（样本取样前15000 rcf离心2 min避免沉淀干扰）；标准品配制方法见下表1，表1为梯度稀释牛血清白蛋白（BSA）标准品。

表1

（2）根据标准品、样本数量配制相应BCA工作液，每孔需加入200 µL BCA工作液（A液：B液=50：1）。

（3）放置37℃恒温培养箱中静置孵育30 min。

（4）测定562nm下的吸光值，根据标品吸光值及浓度绘制标准曲线，计算样本浓度、样本质量。

对实施例1-3和对比例1-2中收集的富集后的酪氨酸磷酸化肽进行检测，检测步骤如下所示：

（1）多肽采用0.1%FA进行复溶后，采用装配有液相纳升系统的Orbitrap Exploris480质谱仪进行采集。

（2）对鉴定到的质谱数据采用MSConvert软件转化为mzML格式后，采用Fragpipe17.1软件进行搜库，对鉴定到的酪氨酸磷酸化肽段及富集效率进行统计。

检测结果如表2所示。

表2

从表2的结果可知，采用高温处理和蒸干后复溶或蒸干后复溶和高温处理的方式所鉴定的酪氨酸磷酸化肽段数目增多，同时富集效率有所提升。同时，采用加入苯甲基磺酰氟处理的方式与常规的富集方式相比，所鉴定的酪氨酸磷酸化肽段数目也增多，同时富集效率也有所提升。

对实施例1-3和对比例1-2中收集的富集后的SH2蛋白进行检测，检测步骤如下所示：

（1）多肽采用0.1%FA进行复溶后，采用装配有液相纳升系统的Orbitrap Exploris480质谱仪进行采集。

（2）对鉴定到的质谱数据采用MSConvert软件转化为mzML格式后，采用Fragpipe17.1软件进行搜库，对鉴定到的SH2蛋白进行统计。检测结果如表3所示。

表3

从表3的结果可知，采用高温处理和蒸干后复溶或蒸干后复溶和高温处理的方式，质谱鉴定到的SH2蛋白强度远低于常规的酪氨酸磷酸化肽段的富集方式，上述处理方式能够显著降低胰蛋白酶对偶联到琼脂糖微球上的SH2的酶切。采用加入苯甲基磺酰氟处理的方式与常规的富集方式相比，鉴定到的SH2蛋白无显著差别，并不能降低胰蛋白酶的影响。

综上，本发明通过采取高温处理和蒸干后复溶或蒸干后复溶和高温处理上述两种处理方式对胰蛋白酶酶切后的肽段进行灭活，再进行酪氨酸磷酸化的富集，与常规富集方式相比，酪氨酸磷酸化肽段鉴定数目显著增多，同时能够显著降低SH2蛋白鉴定强度。与采用苯甲基磺酰氟处理的方式相比，能够进一步提高酪氨酸磷酸化肽段鉴定数目和降低质谱鉴定的SH2蛋白强度，减少其对偶联到琼脂糖微球上SH2的酶切，减少样品中SH2的检出，提升pY的鉴定效率。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。