西瓜单倍体植株加倍方法

技术领域

本发明申请涉及植物单倍体加倍领域，具体涉及一种西瓜单倍体植株加倍方法。

背景技术

西瓜属于葫芦科西瓜属一年生草本植物，果肉多汁，清凉可口，是夏季畅销水果之一，具有丰富的营养价值和可观的经济价值。目前我国西瓜遗传基础狭隘，优异种质资源缺乏，且主要以传统的育种手段为主，导致优质的新品种更新滞后，所以育种家需要加速推进西瓜育种的进程。而通过单倍体育种可有效的解决常规育种周期长、工作量大、遗传性状不稳定等因素，从而推进育种的进度。

花药离体培养、未授粉子房或胚珠离体培养、花粉辐射等途径都是获得单倍体植株的有效途径。西瓜单倍体植株可通过西瓜花药离体培养获得，而单倍体植株则需要通过加倍成为单双倍体植株才能应用于育种和遗传研究。自然条件下加倍的概率较低，需要借助人工诱导来提高加倍率。其中，秋水仙素、氟乐灵、氨磺灵等化学药剂是较为常用的诱导加倍剂，这些诱导剂通过浸种、浸根、浸芽、滴生长点等方法进行加倍，加倍效果难以尽如人意，加倍结果也参差不齐，对植株的伤害性和致死率较高，且这些药剂对操作人员有一定的毒害作用，对环境也有一定程度的污染性。

发明人知晓的专利文献CN111837948A中公开了一种利用西瓜未授粉子房培养获得双单倍体植株的方法，但其单倍体加倍为双倍体的过程及效率不能满足目前消费者对于具有抗病，耐贮，食用方便等优点的多倍体西瓜的大量需求。

公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本公开的背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。

发明内容

发明人研究发现，现有西瓜单倍体加倍的方法主要为使用诱导加倍剂、未授粉子房培养获得单倍体加倍；现有诱导加倍剂的使用会污染环境、现有未授粉子房培养获得西瓜多倍体的方法加倍效果不明显；而本申请研究发现采用特定的培养条件（红蓝光质比4～1.5:1、MS培养基+一定的外源添加物）能够诱变西瓜单倍体加倍，高效无污染。

根据本公开的一个方面，提供一种西瓜单倍体植株加倍的方法，包括如下步骤：

（1）由西瓜花药离体培养获得单倍体植株；

（2）将所得单倍体植株接入培养基进行培养，并继代培养，培养的光质条件：红、蓝光的光照强度之比为4～1.5:1，所述培养基含MS、0.15～0.25 mg/L 激动素KT、80～120ml/L鲜椰汁、25～35g/L蔗糖、6.0～7.0g/L琼脂，pH值5.80～5.90。

在本公开的一些实施例中，在所述步骤（2）中，培养过程中的光照周期为12h～16h•d

在本公开的一些实施例中，在所述步骤（2）中，培养过程中的总光照强度为4000LX～5000LX。

在本公开的一些实施例中，在所述步骤（2）中，培养过程中白天光照温度为26～28℃，夜间黑暗温度为22～23℃。

在本公开的一些实施例中，在所述步骤（2）中，培养基含MS培养基、0.2 mg/L激动素KT、100ml/L鲜椰汁、30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂，pH值5.8～5.85。

在本公开的一些实施例中，在所述步骤（2）中，培养条件为：红、蓝光的光照强度之比为4～1.5:1的红光、蓝光，光照周期为16h•d

本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下任一技术效果或优点：

（1）采用红蓝配比的光质条件配合改良的培养基（MS培养基+外源物质）能够大大提高西瓜单倍体加倍率；

（2）以光催化使单倍体植株离体在特定培养基上发育为二倍体植株，不但培养效率更高、更绿色，而且操作简单、成本低廉。

附图说明

图1 继代培养后对照组和实验组的植株倍性鉴定示意图。

具体实施方式

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的光源，光质成分均为常规设备提供。

实施例：西瓜单倍体植株加倍方法的验证试验

1. 试验材料：以小西瓜斯维特花药离体培养获得的单倍体植株为试验材料，由河南省农业科学院园艺所西甜瓜课题室提供。

2.试验方法

（1）鉴定单倍体植株：将西瓜花药离体培养获得的植株，通过流式细胞仪进行倍性鉴定，把鉴定得到的单倍体植株接入改良培养基NMS（MS + 0.2mg/L 激动素KT + 100ml/L椰汁 + 30g/L 蔗糖 + 6.5g/L 琼脂，pH值5.8～5.85）中进行培养；对照组：把单倍体接种到只有MS的空白培养基中进行培养。

（2）继代培养：将上述接种好的单倍体植株，放入光质培养箱中培养三周后进行一次继代，继代培养基为改良培养基NMS（MS + 0.2mg/L 激动素KT + 100ml/L椰汁 + 30g/L蔗糖 + 6.5g/L 琼脂，pH值5.8～5.85），对照组：把单倍体接种到只有MS培养基中进行培养，继代二次后，对培养的植株进行倍性鉴定（通过流式细胞仪对加倍植株进行倍性鉴定）。

（3）培养条件

光质条件：光照强度之比分别设置为白光（W）、白光（W）：红光（R）=2:1或1:2（记作2W1R或1W2R）、白光（W）：蓝光（B）= 3:1或1:3（记作3W1B或1W3B）、红光（R）：蓝光（B）= 4:1或1:4或3:2或2:3（记作4R1B或1R4B或3R2B或2R3B）；光照周期分别设置为12h·d

3.结果与分析：

对西瓜单倍体植株加倍培养条件进行了36个处理（表1），斯维特单倍体加倍结果由表2和图1可知，培养基成分、光质、光照周期对单倍体植株的加倍效果有着密切的关联，不同的处理得到的结果差异显著。

从培养基的添加物成分分析，处理1～18是在常规MS培养基中添加了KT和鲜椰汁，处理19～36的仅为常规MS培养基，不含任何添加物，结果如表2所示，处理1～18得到的DH植株的概率最高为80%，处理19～36中单双倍体最高加倍率只有10%，处理1～18得到的DH植株的概率显著高于处理19～36，表明外源添加物KT和椰汁对植株的加倍起到一定的作用。

从光质分析，不同光质对双单倍体植株的加倍率具有促进作用，在处理1～18中，不同红光和蓝光比例的光质均得到双单倍体植株，其中4R1B的光质得到双单倍体的最高加倍率80%，显著高于其他处理。研究还发现，红光占比高于蓝光占比的光质组合获得的双单倍体的概率显著高于低红光高蓝光的比例组合，如，4R1B、3W2B获得的DH植株的概率显著高于1R4B、2W3B，说明不同比例的红蓝光光质对单双倍体的加倍率具有显著影响，其中红光的影响大于蓝光的影响。

从光周期分析结果可知，光周期对植株的加倍率存在影响，在相同的条件下，16h•d

综合可得，西瓜单倍体植株在改良NMS培养基培养，红、蓝光的光照强度之比为4～1.5:1，光照周期为16h•d

表1 西瓜单倍体植株加倍培养条件

。

表2 西瓜单倍体加倍率

。