白藜芦醇-天然产物组合物及其双磷脂复合物

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及白藜芦醇-天然产物组合物，还涉及由白藜芦醇-天然产物作为主药成分的双磷脂复合物及其制备方法与应用。

背景技术

白藜芦醇(Resveratrol，RES)，又名芪三酚，化学名称为(E)-3,5,4'-三羟基二苯乙烯，是一种非黄酮类多酚化合物，广泛存在于葡萄、花生、虎杖、桑葚等天然植物中。白藜芦醇具有顺式与反式两种异构体，自然界中绝大多数以反式结构存在，且反式生物活性更强，其结构式如下。白藜芦醇具有抗癌、抗炎、抗氧化、心血管保护、肝脏保护等多种药理活性。但白藜芦醇水溶性较低(约40μg mL

白藜芦醇结构式(反式)

国内外文献已报道了多种提高白藜芦醇生物利用度的方法，包括环糊精包合物、磷脂复合物、脂质体、乳化剂、纳米制剂、前药等，其中有些制剂辅料还有抑制II相酶作用。这些技术在一定程度上同时或分别改善了白藜芦醇的水溶性和代谢稳定性，但仍存在一定局限性，如生物利用度提高不显著、使用大量辅料、制备方法复杂、载药量低、安全性差等。

磷脂复合物，意大利学者Bombardelli于20世纪80年代首次提出，其为药物和磷脂分子通过电荷迁移作用而形成的较为稳定的化合物或络合物。随着研究的不断深入，磷脂复合物这一新型载药系统的优点也不断凸显，主要体现在可通过有效改善药物的溶解性与膜渗透性来提高药物的生物利用度，同时具有制备工艺简单、成本低廉、安全无毒等特点，其应用日益深入。

为同时改善白藜芦醇的水溶性和代谢不稳定性，我们将对白藜芦醇II相代谢具有抑制作用的中药活性成分，与白藜芦醇制成双磷脂复合物，从而尽可能地提高白藜芦醇生物利用度。

目前未见公开白藜芦醇-天然产物双磷脂复合物的相关文献。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种白藜芦醇-天然产物组合物，及其以所述组合物作为活性成分的双磷脂复合物和制备方法。所制备的双磷脂复合物，提高了白藜芦醇的溶解性和体外溶出，抑制了白藜芦醇的II相代谢，进一步提高了白藜芦醇的生物利用度。

本发明所述的白藜芦醇-天然产物组合物中，所述的天然产物为容易发生Ⅱ相代谢的天然产物的一种或多种，所述的天然产物可以为槲皮素、木犀草素、二氢槲皮素、黄芩素、异鼠李素、异甘草素、染料木素、山奈酚、甘草次酸、姜黄素、表没食子儿茶素，优选为：槲皮素、木犀草素、黄芩素、山奈酚、甘草次酸、姜黄素、表没食子儿茶素。

所述白藜芦醇与天然产物的摩尔比为1：0.1～1：10，优选为1：0.5-1：2。

测定孵化体系中白藜芦醇浓度，以抑制率为指标，结果如附图1所示，甘草次酸具有最强的抑制活性，其它天然产物的抑制活性依次为木犀草素、黄芩素、姜黄素、表没食子儿茶素、槲皮素、山奈酚、二氢槲皮素。

本发明的白藜芦醇-天然产物组合物为白藜芦醇-甘草次酸，白藜芦醇与甘草次酸的摩尔比为1：0.5-1：2。

本发明的白藜芦醇-天然产物组合物为白藜芦醇-表没食子儿茶素、白藜芦醇-姜黄素、白藜芦醇-山奈酚、白藜芦醇-槲皮素，其中，白藜芦醇和天然产物的摩尔比均为：1：1.5-1：2。

本发明的白藜芦醇-天然产物组合物为白藜芦醇-黄芩素、白藜芦醇-木犀草素，其中，白藜芦醇和天然产物的摩尔比均为1：1-1：2。

进一步地，本发明提供了所述的白藜芦醇-天然产物组合物双磷脂复合物。

本发明所述的白藜芦醇-天然产物双磷脂复合物是通过下述技术方案实现的：

本发明所述的白藜芦醇-天然产物双磷脂复合物包括白藜芦醇、易发生Ⅱ相代谢的天然产物及磷脂。

其中，

白藜芦醇与天然产物的摩尔比为1：0.1～1：10，优选为1：0.5～1：2。

白藜芦醇和易发生II相代谢的天然产物的总摩尔数与磷脂摩尔比为1：0.5～1：3，优选为1：1～1：3。

所述的天然产物为槲皮素、木犀草素、二氢槲皮素、黄芩素、异鼠李素、异甘草素、染料木素、山奈酚、甘草次酸、姜黄素或表没食子儿茶素。

所述的磷脂选自：大豆磷脂、卵磷脂、合成磷脂中的一种或几种的组合，所述合成磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺中的一种或两种以上的组合。

所述的磷脂优选为：大豆磷脂和卵磷脂。

本发明还提供了所述白藜芦醇-天然产物双磷脂复合物的制备方法：

按照比例称取白藜芦醇、天然产物和磷脂，加入反应溶剂，混合均匀，一定温度下回流搅拌。旋转蒸发去除反应溶剂，干燥，过筛，即得白藜芦醇-天然产物双磷脂复合物。

其中，

所述反应溶剂为无水甲醇，无水乙醇，丙酮，乙酸乙酯、二氯甲烷或四氢呋喃，优选为乙酸乙酯。

反应温度为20～60℃，优选为40～60℃。

反应时间为0.5～4h，优选为2～4h。

白藜芦醇的浓度为2.5～15mg/mL，优选为2.5～10mg/mL。

本发明的白藜芦醇-天然产物双磷脂复合物能够改善白藜芦醇的溶解性和体外溶出，抑制白藜芦醇的II相代谢，而且能提高白藜芦醇在体内的生物利用度。

本发明优点：本发明首次制备了白藜芦醇-天然物质双磷脂复合物，这些制剂能显著提高白藜芦醇的溶解性和体外溶出，抑制白藜芦醇的II相代谢。尤其是白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物，以白藜芦醇为参比，当口服给予白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物时，白藜芦醇在大鼠体内的相对生物利用度为279％。

附图说明

图1为大鼠肝微粒体中，不同天然活性产物对白藜芦醇葡萄糖醛酸化的抑制作用。

图2为不同反应溶剂时，白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物中白藜芦醇与甘草次酸平衡溶解度图。

图3为不同反应温度时，白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物中白藜芦醇与甘草次酸平衡溶解度图。

图4为不同反应时间时，白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物中白藜芦醇与甘草次酸平衡溶解度图。

图5为不同药脂比时，白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物中白藜芦醇与甘草次酸平衡溶解度图。

图6为不同反应浓度时，白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物中白藜芦醇与甘草次酸平衡溶解度图。

图7为X射线衍射图。

a：磷脂物理混合物，b：白藜芦醇原料药，c：甘草次酸原料药，d：白藜芦醇与磷脂的物理混合物(摩尔比1：1)，e：白藜芦醇和甘草次酸及磷脂的物理混合物(摩尔比1：1.5：2.5)，f：白藜芦醇磷脂复合物，g：白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。

图8为差示扫描量热图。

a：磷脂物理混合物，b：白藜芦醇原料药，c：甘草次酸原料药，d：白藜芦醇与磷脂的物理混合物(摩尔比1：1)，e：白藜芦醇和甘草次酸及磷脂的物理混合物(摩尔比1：1.5：2.5)，f：白藜芦醇磷脂复合物，g：白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。

图9为扫描电镜图。

a：磷脂物理混合物，b：白藜芦醇原料药，c：甘草次酸原料药，d：白藜芦醇与磷脂的物理混合物(摩尔比1：1)，e：白藜芦醇和甘草次酸及磷脂的物理混合物(摩尔比1：1.5：2.5)，f：白藜芦醇磷脂复合物，g：白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。

图10为白藜芦醇原料药、白藜芦醇磷脂复合物及白藜芦醇磷脂-甘草次酸双复合物在pH7.4溶出介质中的溶出曲线图。

图11为口服白藜芦醇原料药、白藜芦醇磷脂复合物及白藜芦醇磷脂-甘草次酸双复合物时白藜芦醇的血药浓度-时间曲线(n＝6)

具体实施方式

以下实例用于进一步说明本发明，但绝不是对其范围的限制。

天然产物的优化通过体外肝微粒体孵化实验实现：

向孵化容器中加入肝微粒体、MgCl

其中，大鼠肝微粒体蛋白终浓度为0.2mg/mL，MgCl

不同天然活性产物对白藜芦醇葡萄糖醛酸化的抑制作用(见图1)

实例1：槲皮素对白藜芦醇葡萄糖醛酸化的抑制作用

反应体系总体积为200μL，大鼠肝微粒体蛋白终浓度为0.2mg/mL，曲拉通终浓度为0.01％，UDPGA终浓度为2mmol/L，MgCl

向1mL Ep管中加入上述浓度的肝微粒体、MgCl

按以下所述抑制率测定方法测定槲皮素对白藜芦醇的抑制率为34.0％(摩尔比1：0.5)、45.3％(摩尔比1：1)、55.3％(摩尔比1：1.5)、58.5％(摩尔比1：2)。

实例2：木犀草素对白藜芦醇葡萄糖醛酸化的抑制作用

反应体系总体积为200μL，大鼠肝微粒体蛋白终浓度为0.2mg/mL，曲拉通终浓度为0.01％，UDPGA终浓度为2mmol/L，MgCl

向1mL Ep管中加入上述浓度的肝微粒体、MgCl

孵按以下所述抑制率测定方法测定木犀草素对白藜芦醇的抑制率为43.7％(摩尔比1：0.5)、61.3％(摩尔比1：1)、70.4％(摩尔比1：1.5)、73.4％(摩尔比1：2)。

实例3：二氢槲皮素对白藜芦醇葡萄糖醛酸化的抑制作用

反应体系总体积为200μL，大鼠肝微粒体蛋白终浓度为0.2mg/mL，曲拉通终浓度为0.01％，UDPGA终浓度为2mmol/L，MgCl

向1mL Ep管中加入上述浓度的肝微粒体、MgCl

按以下所述抑制率测定方法测定二氢槲皮素对白藜芦醇的抑制率为18.0％(摩尔比1：0.5)、32.0％(摩尔比1：1)、42.6％(摩尔比1：1.5)、50.6％(摩尔比1：2)。

实例4：黄芩素对白藜芦醇葡萄糖醛酸化的抑制作用

反应体系总体积为200μL，大鼠肝微粒体蛋白终浓度为0.2mg/mL，曲拉通终浓度为0.01％，UDPGA终浓度为2mmol/L，MgCl

向1mL Ep管中加入上述浓度的肝微粒体、MgCl

按以下所述抑制率测定方法测定黄芩素对白藜芦醇的抑制率为30.5％(摩尔比1：0.5)、50.9(摩尔比1：1)、62.4(摩尔比1：1.5)、68.1(摩尔比1：2)。

实例5：异鼠李素对白藜芦醇葡萄糖醛酸化的抑制作用

反应体系总体积为200μL，大鼠肝微粒体蛋白终浓度为0.2mg/mL，曲拉通终浓度为0.01％，UDPGA终浓度为2mmol/L，MgCl

向1mL Ep管中加入上述浓度的肝微粒体、MgCl

按以下所述抑制率测定方法测定异鼠李素对白藜芦醇的抑制率为2.7％(摩尔比1：0.5)、4.5％(摩尔比1：1)、6.0％(摩尔比1：1.5)、6.7％(摩尔比1：2)。

实例6：异甘草素对白藜芦醇葡萄糖醛酸化的抑制作用

反应体系总体积为200μL，大鼠肝微粒体蛋白终浓度为0.2mg/mL，曲拉通终浓度为0.01％，UDPGA终浓度为2mmol/L，MgCl

向1mL Ep管中加入上述浓度的肝微粒体、MgCl

按以下所述抑制率测定方法测定异甘草素对白藜芦醇的抑制率为28.0％(摩尔比1：0.5)、30.0％(摩尔比1：1)、31.1％(摩尔比1：1.5)、31.4％(摩尔比1：2)。

实例7：染料木素对白藜芦醇葡萄糖醛酸化的抑制作用

反应体系总体积为200μL，大鼠肝微粒体蛋白终浓度为0.2mg/mL，曲拉通终浓度为0.01％，UDPGA终浓度为2mmol/L，MgCl

向1mL Ep管中加入上述浓度的肝微粒体、MgCl

按以下所述抑制率测定方法测定染料木素对白藜芦醇的抑制率为12.3％(摩尔比1：0.5)、24.1％(摩尔比1：1)、35.3％(摩尔比1：1.5)、42.0％(摩尔比1：2)。

实例8：山奈酚对白藜芦醇葡萄糖醛酸化的抑制作用

反应体系总体积为200μL，大鼠肝微粒体蛋白终浓度为0.2mg/mL，曲拉通终浓度为0.01％，UDPGA终浓度为2mmol/L，MgCl

向1mL Ep管中加入上述浓度的肝微粒体、MgCl

按以下所述抑制率测定方法测定山奈酚对白藜芦醇的抑制率为23.8％(摩尔比1：0.5)、40.4％(摩尔比1：1)、51.0％(摩尔比1：1.5)、59.1％(摩尔比1：2)。

实例9：甘草次酸对白藜芦醇葡萄糖醛酸化的抑制作用

反应体系总体积为200μL，大鼠肝微粒体蛋白终浓度为0.2mg/mL，曲拉通终浓度为0.01％，UDPGA终浓度为2mmol/L，MgCl

向1mL Ep管中加入上述浓度的肝微粒体、MgCl

按以下所述抑制率测定方法测定甘草次酸对白藜芦醇的抑制率为56.5％(摩尔比1：0.5)、74.8％(摩尔比1：1)、80.0％(摩尔比1：1.5)、81.3％(摩尔比1：2)。

实例10：姜黄素对白藜芦醇葡萄糖醛酸化的抑制作用

反应体系总体积为200μL，大鼠肝微粒体蛋白终浓度为0.2mg/mL，曲拉通终浓度为0.01％，UDPGA终浓度为2mmol/L，MgCl

向1mL Ep管中加入上述浓度的肝微粒体、MgCl

按以下所述抑制率测定方法测定姜黄素对白藜芦醇的抑制率为29.4％(摩尔比1：0.5)、47.0％(摩尔比1：1)、62.3％(摩尔比1：1.5)、71.3％(摩尔比1：2)。

实例11：表没食子儿茶素对白藜芦醇葡萄糖醛酸化的抑制作用

反应体系总体积为200μL，大鼠肝微粒体蛋白终浓度为0.2mg/mL，曲拉通终浓度为0.01％，UDPGA终浓度为2mmol/L，MgCl

向1mL Ep管中加入上述浓度的肝微粒体、MgCl

按以下所述抑制率测定方法测定表没食子儿茶素对白藜芦醇的抑制率为27.4％(摩尔比1：0.5)、45.0％(摩尔比1：1)、59.6％(摩尔比1：1.5)、66.2％(摩尔比1：2)。

当所述白藜芦醇与天然产物的摩尔比为1：0.5-1：2时，其抑制活性随着天然产物的增加其活性也增强。

综合以上，本发明选取天然产物为甘草次酸，制备白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物，并考察不同条件下制备的白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物的性质。

固定白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，反应温度为40℃，反应时间为2h，考察不同反应溶剂对白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物水中平衡溶解度的影响(见图2)。

实例12：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，反应溶剂无水甲醇。

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1250mg，置于250mL茄型瓶中，加入无水甲醇100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于40℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为579.3μg mL

实例13：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，反应溶剂为无水乙醇。

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1250mg，置于250mL茄型瓶中，加入无水乙醇100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于40℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为578.4μg mL

实例14：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，反应溶剂为丙酮。

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1250mg，置于250mL茄型瓶中，加入丙酮100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于40℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为510.8μg mL

实例15：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，反应溶剂为乙酸乙酯。

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1250mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于40℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为578.2μg mL

实例16：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，反应溶剂为四氢呋喃。

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1250mg，置于250mL茄型瓶中，加入四氢呋喃100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于40℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为564.1μg mL

结果表明，乙酸乙酯作为溶剂时，制得的白藜芦醇-甘草次酸磷脂复合物中白藜芦醇和甘草次酸在水中的平衡溶解度最大。

不同反应温度对白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物水中平衡溶解度的影响(见图3)。

实例17：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，反应温度为20℃。

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1250mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于20℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为551.6μg mL

实例18：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，反应温度为30℃。

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1250mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于30℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为559.1μg mL

实例19：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，反应温度为40℃。

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1250mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于40℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为577.2μg mL

实例20：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，反应温度为50℃。

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1250mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于50℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为548.2μg mL

实例21：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，反应温度为60℃。

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1250mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于60℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为552.62μg mL

结果表明：当反应温度为40～60℃时，制得的白藜芦醇-甘草次酸磷脂复合物中白藜芦醇和甘草次酸在水中平衡溶解度较高。

不同反应时间对白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物水中平衡溶解度的影响(见图4)。

实例22：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，反应时间为0.5h。

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1250mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于40℃下回流搅拌0.5h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为548.2μg mL

实例23：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，反应时间为1h。

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1250mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于40℃下回流搅拌1h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为573.5μg mL

实例24：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，反应时间为1.5h。

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1250mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于40℃下回流搅拌1.5h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为567.8μg mL

实例25：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，反应时间为2h。

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1250mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于40℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为578.1μg mL

实例26：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，反应时间为3h。

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1250mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于40℃下回流搅拌3h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为573.7μg mL

实例27：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，反应时间为4h。

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1250mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于40℃下回流搅拌4h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为568.3μg mL

结果表明：随着反应时间的增加，白藜芦醇-甘草次酸磷脂复合物在水中的平衡溶解度逐渐提高，直至2h反应完全。故在2～4h时，制得的白藜芦醇-甘草次酸磷脂复合物中白藜芦醇和甘草次酸在水中平衡溶解度较高。

不同药脂比对白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物水中平衡溶解度的影响(见图5)。

例28：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：1.25，药脂比为1：0.5

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂625mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于40℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为459.0μg mL

例29：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，药脂比为1：1

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1250mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于40℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为581.4μg mL

例30：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：3.75，药脂比为1：1.5

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1875mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于40℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为609.6μg mL

例31：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：5，药脂比为1：2

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂2500mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于40℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为614.6μg mL

例32：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：7.5,，药脂比为1：3

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂3750mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于40℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为630.5μg mL

结果表明：药物与磷脂摩尔比为1：1～1：3时，制得的白藜芦醇-甘草次酸磷脂复合物中白藜芦醇和甘草次酸在水中平衡溶解度较高。

不同药物浓度对白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物水中平衡溶解度的影响(见图6)。

实例33：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，白藜芦醇浓度2.5mg/mL。

称取白藜芦醇250mg、甘草次酸375mg、磷脂625mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为2.5mg/mL，于40℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为577.0μg mL

实例34：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，白藜芦醇浓度5mg/mL。

称取白藜芦醇500mg、甘草次酸750mg、磷脂1250mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为5mg/mL，于40℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为581.4μg mL

实例35：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，白藜芦醇浓度7.5mg/mL。

称取白藜芦醇750mg、甘草次酸1125mg、磷脂1875mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为7.5mg/mL，于40℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为579.7μg mL

实例36：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，白藜芦醇浓度10mg/mL。

称取白藜芦醇1000mg、甘草次酸1500mg、磷脂2500mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为10mg/mL，于40℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为576.9μg mL

实例36：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，白藜芦醇浓度12.5mg/mL。

称取白藜芦醇1250mg、甘草次酸1875mg、磷脂3125mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为12.5mg/mL，于40℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为554.3μg mL

实例37：白藜芦醇、甘草次酸与磷脂摩尔比为1：1.5：2.5，白藜芦醇浓度15mg/mL。

称取白藜芦醇1500mg、甘草次酸2250mg、磷脂3750mg，置于250mL茄型瓶中，加入乙酸乙酯100mL，使白藜芦醇的反应浓度为15mg/mL，于40℃下回流搅拌2h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，所得产物即为白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物。按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇和甘草次酸的水中平衡溶解度分别为532.4μg mL

结果表明：药物浓度在2.5～10mg/mL时，制得的白藜制得的白藜芦醇-甘草次酸磷脂复合物中白藜芦醇和甘草次酸在水中平衡溶解度较高。

综合以上，本发明优化的试验条件包括，反应溶剂为乙酸乙酯，药脂比为1：1～1：3，反应温度为40～60℃，反应时间为2～4h,白藜芦醇的反应浓度为2.5～10mg/mL，在此条件下制备的白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物，白藜芦醇和甘草次酸的平衡溶解度分别高于548μg/mL和498ug/mL，溶出也会更多。

实例38：白藜芦醇磷脂复合物的制备

称取白藜芦醇500mg、磷脂500mg，置于100mL茄型瓶中，加入无水乙醇50mL，使白藜芦醇的反应浓度为10mg/mL，于40℃下回流搅拌1h。反应结束后于40℃下旋转蒸发除去溶剂，置于40℃烘箱内干燥过夜，过50目筛，即得白藜芦醇磷脂复合物。

相平衡溶解度、油水分配系数及溶出度的测定

实例39：相平衡溶解度的测定

按以下所述平衡溶解度测定方法测定白藜芦醇原料药、实例38制备的白藜芦醇磷脂复合物和实例34制备的白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物中白藜芦醇的平衡溶解度，结果见表1。

表1.白藜芦醇、白藜芦醇磷脂复合物和白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物中的白藜芦醇在水和正辛醇中的平衡溶解度

从表1中可以看出，将白藜芦醇制成磷脂复合物后，可显著提高其在水中及正辛醇中的水中平衡溶解度。

实例40：油水分配系数的测定

将50mL正辛醇与50mL二次蒸馏水在振荡器上振荡24h，使二者相互饱和，静止分层后，两相分离，分别保存备用。白藜芦醇原料药、实例38制备的白藜芦醇磷脂复合物和实例34制备的白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物分别完全溶解在2mL水饱和正辛醇溶液中，放入恒温水浴振荡器中，于37℃振摇至平衡，然后与2mL正辛醇饱和的水溶液混合，置于恒温水浴振荡器中，于37℃振摇至平衡。取平衡溶液以3500rpm离心10min后，取上清液过滤，测定白藜芦醇的浓度，结果见表2。

表2.白藜芦醇、白藜芦醇磷脂复合物和白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物的油水分配系数

由表2可知，两种磷脂复合物中白藜芦醇的Log P相对于白藜芦醇原料药均有小幅上升，这是由于两种磷脂复合物对白藜芦醇脂溶性的改善程度均强于水溶性。

药学上常用的磷脂有天然磷脂和合成磷脂。天然磷脂主要是从豆类植物或动物的肝、脑等中提取到，例如大豆磷脂和卵磷脂。合成磷脂有二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺。这些药用上常用的磷脂均可用于本发明的磷脂复合物。

抑制率测定方法：

向200μL孵化后的肝微粒体样品中加入400μL冰甲醇，涡旋1min以停止反应，加入内标溶液(300μg/mL芦丁)20μL，甲醇20μL，继续涡旋3min，离心10min(13 000r·min

抑制率公式如下：

抑制率(％)＝(C

其中，C

平衡溶解度测定方法：

取过量所试药物于具塞试管中，加入5mL水后置于空气恒温振荡器中，平行3份，于37℃下振摇至平衡，溶液以3500rpm离心10min，取上清液，过滤膜，测定药物浓度。

实例41：溶出度的测定

分别精密称取白藜芦醇原料药、实例38制备的白藜芦醇磷脂复合物、实例34制备的白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物适量(约含有白藜芦醇10mg)，参照2015年版中国药典溶出度测定法(附录XC第二法)，以pH 7.4的磷酸盐水溶液为溶出介质，转速为每分钟75转，依法操作，经5、10、15、20、30、45、60、90、120min，取样5mL，经0.45μm滤膜过滤，弃去前2mL初滤液，取续滤液测定，按外标法计算其累积溶出度，见附图10。由图可知，本发明制备的白藜芦醇-甘草次酸磷脂复合物在pH 7.4介质条件下白藜芦醇的溶出显著高于白藜芦醇原料药及白藜芦醇磷脂复合物，甘草次酸的的溶出也显著高于甘草次酸原料药。

理化性质及微观形态分析

分别采用差示扫描量热法(DSC)及X-射线衍射法(XRD)对实例38制备的白藜芦醇磷脂复合物及实例34制备的白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物适量进行理化性质分析。采用扫描电镜法(SEM)对其微观形态进行分析。

由附图7可知，磷脂没有明显的吸热峰，白藜芦醇原料药在265.8℃有一特征吸热峰，甘草次酸原料药在298.8℃有一特征吸热峰，白藜芦醇与甘草次酸的特征吸热峰同时也存在于两种物理混合物中，说明物理混合物只是药物与磷脂的混合，而没有新物质的形成；而在两种磷脂复合物中，白藜芦醇与甘草次酸的吸热峰分别迁移至246.2℃、236.8℃，说明药物与磷脂生成了一种新的物质。

由附图8可知，白藜芦醇与甘草次酸原料药均具有明显的晶体衍射峰，即两者均以晶体形式存在，而磷脂不存在明显的衍射峰，以无定形存在；两种物理混合物也具有明显的晶体衍射峰，但峰强度较原料药明显减弱，该现象可能是由于磷脂对药物的覆盖及稀释作用造成的；在白藜芦醇磷脂复合物、白藜芦醇-甘草次酸磷脂复合物中药物本身的衍射峰消失，表明磷脂复合物中药物均以无定型形式存在。

由附图9可知，白藜芦醇与甘草次酸原料药均呈棒状结晶态，磷脂呈无定型态；在两种药物与磷脂的物理混合物中，均可清晰看到结晶态的药物和无定形的磷脂，说明白藜芦醇与甘草次酸的晶型并未发生改变；而在两种磷脂复合物中均无结晶态的药物存在，表明白藜芦醇与甘草次酸均以无定型状态存在于磷脂复合物中。X射线衍射试验分析结果与SEM分析结果一致。

生物利用度考察

SD大鼠(雄性)18只，随机分为3组，每组6只，体重为210–240g(由沈阳药科大学动物实验室提供)，健康状况良好，实验前12h内禁食，自由饮水。

18只健康雌性SD大鼠，随机分成3组，给药前禁食12h，自由饮水。以20mg/kg(以白藜芦醇计)的剂量分别灌胃给予白藜芦醇原料药、白藜芦醇磷脂复合物、白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物(实例34)，分别于给药前和给药后0.05、0.083、0.167、0.25、0.5、1、2、6、和10h眼眶取血约0.3mL，置于事先涂好肝素的EP管中，离心10min(13000r·min

表3.口服白藜芦醇和磷脂复合物后大鼠体内白藜芦醇药动学参数(以白藜芦醇计20mg/kg)

由附图11和表3可知，18只雌性SD大鼠单剂量口服20mg/kg(以白藜芦醇计)的白藜芦醇原料药、白藜芦醇磷脂复合物、白藜芦醇-甘草次酸双磷脂复合物后，血浆中白藜芦醇的C