检测血清THBS2表达的肝病纤维化检测试剂、检测试剂盒和检测方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种用于肝病纤维化诊断的双抗体夹心ELISA检测方法及试剂

背景技术

肝病包括酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、急/慢性病毒性肝病、自身免疫性肝病、药物/毒物性肝病、胆汁淤积性肝炎及遗传性肝病等。肝病的重症化倾向常以肝病的反复炎症性过程，随后纤维化的不断进展为表征。肝病纤维化晚期可发展至终末期肝病如肝硬化甚至肝癌。当前对终末期肝病的治疗并不乐观，早期诊断、干预对肝病的治疗及预后尤为关键。

当前对肝纤维化的判断通常基于三角度。1)病理检查。肝组织病理活检仍是评价肝病程度的金标准，但属于有创性方法。2)血清学检查。肝纤维化四项如血清III型前胶原氨基端肽(PIIINP)、IV胶原(CIV)、层连蛋白(LN)、透明质酸(HA)已在临床常规开展，但存在特异性、敏感性不足的缺陷。3)影像学检查。影像学技术可用于诊断肝硬化、肝肿瘤，但对慢性肝病存在早期预警程度差、成本较高的缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有肝病纤维化诊断技术的缺陷和不足，提供了一种新的肝病纤维化诊断标志物，即血小板反应蛋白2(Thrombospondin 2,THBS2)基因。THBS2是凝血酶敏感素家族成员之一，广泛分布于上皮来源组织中的细胞外基质。

本发明人通过检测正常人和肝病患者血清中THBS2的含量，统计学分析肝病患者THBS2的表达显著增高。对于肝病纤维化显著期患者的检测发现，血清THBS2的表达水平随纤维化分期程度而递增；且肝病纤维化显著期患者较不显著患者THBS2的表达显著上升。因此，THBS2是肝脏纤维化一个较好的检测指标，特别是对于肝病纤维化进展的早期预警和诊断，为该疾病的临床早期诊治找到一种新的生物标记物。

本发明的第一个目的是提供血清THBS2在作为肝病纤维化诊断标志物方面的应用。

本发明第二个目的是提供了一种检测THBS2表达的肝病纤维化检测试剂盒，包括THBS2捕获抗体和用于标记的THBS2酶标抗体。

具体的，所述THBS2捕获抗体和用于标记的THBS2酶标抗体为人THBS2重组单克隆抗体

更进一步的，THBS2捕获抗体用于包被酶标板，辣根过氧化物酶标记于THBS2酶标抗体。

具体的，所述试剂盒包括THBS2捕获抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的THBS2酶标抗体、THBS2标准品、和辅助试剂组成。

更具体的，所述试剂盒包括如下组分：(1)酶标板：在固相96孔酶标板上包被有人THBS2重组单克隆抗体；(2)酶结合物工作液：辣根过氧化物酶标记的人THBS2重组单克隆抗体反应液；(3)显色液；(4)洗涤液；(5)结合物稀释液；(6)终止液。

所述试剂盒还包括标准品。

优选地，所述试剂盒可作为肝病诊断试剂盒和早期预警诊断试剂盒。

本发明的第三个目的是提供了诊断肝病纤维化的检测试剂，包括与THBS2特异性结合的抗体。

进一步的，所述THBS2特异性抗体为人THBS2重组单克隆抗体。

具体的，所述抗体包括THBS2捕获抗体和用于标记的THBS2酶标抗体。

所述包被酶标板的THBS2捕获抗体和HRP标记的THBS2酶标抗体为配对抗体

本发明还提供了一种血清THBS2的双抗体夹心法ELISA检测方法，利用上述试剂盒进行双抗体夹心法ELISA检测。

优选地，所述的血清THBS2的双抗体夹心法ELISA检测方法步骤如下：

本发明还提供了一种血清THBS2的双抗体夹心法ELISA检测方法，利用上述试剂进行双抗体夹心法ELISA检测。

具体的，所述血清THBS2的双抗体夹心法ELISA检测方法步骤如下：

S1.包被：THBS2单克隆抗体用PBS包被稀释液(137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mMNa

S2.封闭：洗涤液(0.05％Tween20-PBS)冲洗96孔板3次，加结合物稀释液(0.1％BSA-PBS)200μl/孔，37℃放置1小时；

S3.加待检血清样品：洗涤液冲洗96孔板3次，加待检血清样品(1:40)及结合物稀释液稀释的人THBS2标准蛋白100μl/孔，37℃放置2小时；

S4.加酶标抗体：洗涤液冲洗96孔板数次，用结合物稀释液稀释酶标抗体至0.2ug/ml，加入96孔板，100μl/孔，37℃放置2小时；

S5.加酶结合物工作液：洗涤液冲洗96孔板3次，加入96孔板，100μl/孔，37℃放置20分钟；

S6.显色：洗涤液冲洗96孔板5次，显色液底物加入96孔板，100μl/孔，37℃显色20分钟，再加终止液，轻轻摇晃均匀；

S7.标准曲线：根据标准品OD值绘制标准曲线，在标准曲线上查出待检标本的含量，数据统计出血清THBS2含量。

本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种新的诊断肝病纤维化严重程度的生物标记物，尤其是对于肝病进展的程度，具有特别重要的预警作用和临床应用价值。

同时，本发明还建立了一种基于双抗体夹心原理的酶联免疫诊断方案，并开发成诊断试剂盒，可以快速、准确地进行THBS2的检测；从而可以对各种肝病的纤维化进展程度作出快速的辅助诊断。

附图说明

图1THBS2检测的标准曲线。

图2正常组与肝病组的THBS2表达量比较。

图3肝病患者按照纤维化分期的THBS2表达量。

图4肝病非显著纤维化组与显著纤维化组的THBS2表达量比较。

图5THBS2的表达量预测肝病纤维化的性能。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定，该领域的技术人员可以根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。任何与记载内容相似或均等的方法及材料均可应用于本发明中。

检测血清THBS2表达的肝病纤维化诊断试剂，包括检测THBS2的试剂，具体包括特异性结合THBS2的抗体。更具体的实施方案中，包括THBS2捕获抗体和用于标记的THBS2酶标抗体。所述捕获抗体和酶标抗体为配对抗体。

用于肝病纤维化诊断的基膜聚糖(THBS2)酶联免疫法(ELISA)检测试剂盒，采用双抗体夹心法，所述试剂盒包括THBS2捕获抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的THBS2酶标抗体、THBS2标准品和辅助试剂组成。

在一个优选的方案中，所述包被酶标板的THBS2捕获抗体和HRP标记的THBS2酶标抗体为配对抗体。

所述辅助试剂包括显色液、洗涤液、结合物稀释液和终止液。

在一个具体的实施方案中，基膜聚糖(THBS2)酶联免疫法(ELISA)检测试剂盒包括如下组分：

(1)酶标板：在固相96孔酶标板上包被有人THBS2重组单克隆抗体。

(2)酶结合物工作液：辣根过氧化物酶(HRP)标记的人THBS2重组单克隆抗体反应液。

(3)显色液：H

(4)洗涤液：0.05％Tween20-PBS。

(5)结合物稀释液：0.1％BSA-PBS。

(6)终止液：2N H

(7)标准品：人THBS2标准蛋白。

THBS2的双抗体夹心法ELISA检测方法，可利用上述检测试剂盒进行双抗体夹心法ELISA检测。

在一个具体的实施方案中，血清THBS2的双抗体夹心ELISA检测方法包括如下步骤：

S1.包被：THBS2捕获抗体用PBS包被稀释液(137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mMNa

S2.封闭：洗涤液(0.05％Tween20-PBS)冲洗96孔板数次，加结合物稀释液(0.1％BSA-PBS)100μl/孔，37℃放置1～2.5小时；

S3.加待检血清样品：洗涤液冲洗96孔板数次，加待检血清样品及结合物稀释液稀释的标准品(人THBS2标准蛋白，2重复)100μl/孔，37℃放置1.5～2.5小时；

S4.加酶标抗体：洗涤液冲洗96孔板数次，用结合物稀释液稀释酶标抗体至0.1～0.2μg/ml，加入96孔板，100μl/孔，37℃放置1.5～2.5小时；

S5.加酶结合物工作液：洗涤液冲洗96孔板数次，加入96孔板，100μl/孔，37℃放置20分钟；

S6.显色：洗涤液冲洗96孔板数次，显色液底物加入96孔板，100μl/孔，室温下或37℃显色15～30分钟，再加终止液，轻轻摇晃均匀；

S7.标准曲线：根据标准品OD值绘制标准曲线，在标准曲线上查出待检标本的含量，数据统计出血清THBS2含量。

本发明的检测样品可采用血清样品。

实施例1人THBS2基因的克隆构建及蛋白表达

根据人THBS2基因编码区序列(GENBANK基因登录号为NM_003247.3)，含THBS2全长cDNA载体构建于pGEM-T载体。质粒标准品命名为pGEM-THBS2。

设计THBS2引物：

上游引物：5'-CGGGGTACCATGGTCTGGAGGCTGGTC-3'

下游引物：5'-CCGGAATTCATGGTGATGGTGATGATGAATATCTCTGCATTCGTACTTGAG-3'

上下游引物包含酶切位点。下游引物含有组氨酸标签(6×his)序列。

1.人THBS2基因编码区扩增：

Template cDNA 2uL，上游引物1uL,下游引物1uL,Taq PCR MasterMix 12.5uL，加ddH

2.pcDNA3.1-THBS2载体的构建：

2.1酶切连接：用Kpn I酶、EcoR I酶双酶切PCR产物及pcDNA3.1载体，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析后割胶纯化回收。取2uL线性化载体pcDNA3.1、6uL回收的人THBS2基因片段、1uLT4DNA连接酶及1uL连接缓冲液混匀，16℃连接过夜。

2.2转化及鉴定：将连接反应液10uL加入100uL感受态细菌DH5α，冰浴30min，42℃热休克45s，冰浴5min，加入900uL无Amp(氨苄青霉素)抗性的LB培养基，37℃温和振摇2h，3500r/min离心，弃900uL上清，留100uL均匀涂布含Amp的LB培养基；37℃恒温培养16h。经鉴定正确克隆后，挑取单克隆于含Amp的5mL LB中37℃过夜培养，离心收集菌体，利用质粒抽提试剂盒提取质粒(pcDNA3.1-THBS2)。

2.3重组pcDNA3.1-THBS2稳定转染人胚胎肾细胞(HEK293)：HEK293细胞培养。将pcDNA3.1-THBS2 2ug和97uL细胞培养基混合均匀，加入3uL Lipo2000转染试剂(Invitrogen)，混合均匀。室温下混合反应20分钟，将混合液逐滴加入细胞培养液中。24h后，用含有400ug/mL G418的培养基(含10％胎牛血清的DMEM)换液。重复用G418筛选培养7-10天。挑选G418抗性细胞克隆，建立293-THBS2细胞株。

3.重组人THBS2的表达与纯化：

将对数生长期的293-THBS2细胞传代培养，用含10％胎牛血清DMEM培养2天；待细胞密度达到90％，换无血清DMEM继续培养4天，收集培养上清。上清液收集：2500g离心10分钟除去细胞碎片。用50mmol/L磷酸钠、300mmol/L氯化钠缓冲液(pH7.0)透析2次。透析后的培养上清上Ni-NTA亲和层析柱。

吸除培养基，PBS清洗细胞3次后加入含0.25％胰酶的PBS消化细胞，离心收集，1：20的比例加入预冷PBS，重悬细胞。超声破碎细胞后，4℃12000g离心30min，吸取上清。将上清加入用PBS预平衡的Ni-NTA柱，流速(1ml/min)。以大于4倍柱床体积的平衡缓冲液(20mMImidazole-PBS)洗柱后，用洗脱缓冲液(100mM Imidazole-PBS)洗脱。洗脱后的蛋白以Millipore Centricon Plus-20离心超滤浓缩。将纯化的THBS2蛋白用Lowry法定量，用无菌滤器(0.22uM)过滤除菌，分装于EP管中，置-20℃保存。

实施例2小鼠抗人THBS2单克隆抗体的制备

以包被抗体为例，小鼠抗人THBS2单克隆抗体聚体制备步骤

1.动物免疫

选用6周龄雌性BALB/c小鼠，皮下注射，免疫剂量为THBS2蛋白100ug/只，初免用等量福氏完全佐剂(Sigma)，免疫加强用等量不完全福氏佐剂，加强免疫4次，免疫间隔2周，融合前3天静脉注射100ug蛋白。

2.饲养细胞的制备

融合前1天，无菌冲洗小鼠腹腔巨噬细胞，洗涤后用40ml含20％胎牛血清的RPMI1640重悬，100uL/孔铺入96孔细胞培养板，置细胞培养箱中备用。

3.免疫脾细胞与骨髓瘤细胞的制备

取免疫小鼠脾脏，放入5ml盛有RPMI 1640的平皿中，200目不锈钢网挤压过滤。将脾细胞悬液转入到50ml离心管中。离心弃上清；重复洗涤一次。

离心收集处于对数生长期的骨髓瘤SP2/0细胞，RPMI 1640洗涤1次。

4.细胞融合及杂交瘤筛选

将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:5的比例混合，洗涤2次。30s内边搅拌边加入37℃预热的lml 45％PEG 1500，90s后加37℃预热的不完全培养液；连续每2min内分别加入lml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml。800rpm离心6min，弃上清，用40ml含20％胎牛血清的RPMI 1640轻轻混悬，融合后细胞悬液加入含饲养细胞的96孔板，100uL/孔，置培养箱中培养。融合24h后，每孔加入5×HAT选择培养液50uL；3天后换液1次，改1×HAT/HT选择培养液；3天后再次换液，改用1×HT培养液；约

无菌取BALB/c小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，用80ml含20％胎牛血清和2×HT的RPMI1640重悬，100uL/孔铺96孔板，置细胞培养箱中备用。将杂交瘤细胞调整密度至10个/ml,100uL/孔铺入已加入脾细胞悬液的96孔板，置细胞培养箱中培养

5.单克隆抗体的制备及纯化

以1×10

用Q Sepharose Fast Flow交换柱层析进一步纯化。平衡缓冲液为20mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液、洗脱缓冲液为含1.0M NaCl的20mM PH7.5的Tris-HCl缓冲液，层析柱XK16/20PharmaciaAKTAFPLC层析系统。装柱，平衡缓冲液平衡层析柱、流速5mL/min上样完毕后用3倍柱体积的平衡缓冲液洗去未结合蛋白，以NaCl递增的线性梯度洗脱结合的抗体蛋白，线性梯度为0-1.0M NaCl/10倍柱体。检测A280，收集洗脱的抗体蛋白。SDS-PAGE检测纯度，紫外分光光度法测定抗体含量，间接ELISA法酶标抗体效价。

实施例3辣根过氧化物标记抗体

取5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于1mL蒸馏水，加0.2mL新鲜配制的0.1M过碘酸钠溶液，室温下避光搅拌20min。将上述溶液装入透析袋中对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液于4℃透析过夜。加入20uL 0.2M pH9.5的碳酸盐缓冲液，立即加入抗体，室温避光轻轻搅拌2h。加0.1mL新鲜配制的4mg/mL硼氢化钠溶液，混匀放置4℃2小时，pH7.4PBS于4℃透析过夜。搅拌条件下逐滴加入等体积饱和(NH4)

实施例4THBS2的ELISA检测试剂

THBS2的双抗体夹心法ELISA检测试剂设有：

(1)包被在固相96孔酶标板上的人THBS2重组单克隆抗体。

(2)酶结合物工作液为辣根过氧化物酶(HRP)标记的人THBS2重组单克隆抗体反应液。

(3)标准品为人THBS2标准蛋白。

(4)显色液：H

(5)洗涤液：0.05％

(6)结合物稀释液：0.1％BSA-PBS(用于稀释标本、标准品和结合物)。

(7)终止液：2N H

THBS2的检测方法，包括如下步骤：

(1)包被：THBS2单克隆抗体用PBS包被稀释液(137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mMNa

(2)封闭：洗涤液(0.05％

(3)加待检血清样品：洗涤液冲洗96孔板数次，加待检血清样品(稀释至1：40)及结合物稀释液稀释的标准品(人THBS2标准蛋白，做2重复)100μl/孔，37℃放置2小时；

(4)加酶标抗体：洗涤液冲洗96孔板数次，用结合物稀释液稀释酶标抗体至0.2ug/ml，加入96孔板，100μL/孔，37℃放置2小时；

(5)加酶结合物工作液：洗涤液冲洗96孔板数次，加入96孔板，100μl/孔，37℃放置20分钟；

(6)显色：洗涤液冲洗96孔板数次，显色液(H

(7)标准曲线：根据标准品OD值绘制标准曲线，在标准曲线上查出待检标本的含量，数据统计出血清THBS2含量。

标准曲线如图1所示。根据不同浓度标准品获得吸光度数据进行回归，得回归方程为Y＝0.0001×X+0.01259；回归系数R

实施例5THBS2的临床样本检测

1、血清样品

30份正常体检人群血清样品：经临床实验室检测无代谢性疾病(糖尿病、高血压、肾病)、无感染性疾病(HBV、HCV和HIV)，无肿瘤疾患；肝功能正常。

123份肝病患者血清样品：肝病包括非酒精性脂肪肝(NAFLD)、慢性乙型病毒性肝炎(HBV)、NAFLD合并HBV感染、及自身免疫性肝病。患者经肝脏穿刺病理分期分为F0期肝病13例、F1期肝病63例、F2期肝病22例、F3期肝病18例和F4期肝病7例。

所有样品收集于杭州师范大学附属医院，并经伦理委员会批准用于科学研究。

2、THBS2的双抗体夹心法ELISA检测

检测方法如上所述。数据统计：数据采用均值±标准差表示；组间检验采用t检验；p＜0.05被认为具有统计学意义。

3、结果

(1)肝病中THBS2表达增加

正常组THBS2表达量为590.93±159.04pg/ml，肝病组THBS2表达量为1523.05±999.57pg/ml；两组比较肝病组表达显著增高(图2)。

(2)肝病患者的THBS2表达

F0期肝病患者THBS2表达量为1052.30±710.24pg/ml，F1期肝病患者THBS2表达量为1282.28±797.30pg/ml，F2期肝病患者THBS2表达量为1667.05±626.21pg/ml，F3期肝病患者THBS2表达量为1895.13±1320.95pg/ml，F4期肝病患者THBS2表达量为3154.83±1318.48pg/ml。随纤维化分期进展，THBS2的表达逐步增加(图3)。

(3)肝病纤维化进展中的THBS2表达

将肝病患者进行分层，将F<2称为纤维化非显著(Non-Significant fibrosis)，F≥2称为纤维化显著(Significant fibrosis)。非显著组患者THBS2表达量为1242.95±783.46pg/ml，显著组THBS2表达量为1975.98±1144.68pg/ml。两组比较后者表达显著增高(图4)。

(4)肝病纤维化进展的ROC分析

为评估血清THBS2水平在显著肝纤维化阶段的表达与预测性能，分别设定非显著组为对照，绘制血清THBS2的ROC曲线，并计算曲线下面积。AUC＝0.750，p<0.001。敏感性及特异性分别为85.11％、59.21％，Cut-off值为1117.72pg/ml(图5)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。