生物酶催化制备氨基葡萄糖的方法

技术领域

本发明涉及一种氨基葡萄糖的酶催化制备方法，具体涉及体外采用生物酶催化制备氨基葡萄糖的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

氨基葡萄糖是D-葡萄糖分子中2位羟基被氨基取代后的化合物，化学名称为2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，易溶于水及亲水性溶剂，是一种重要的功能性单糖。氨基葡萄糖几乎存在于所有有机体包括细菌、真菌、植物以及动物体中，是糖蛋白和蛋白聚糖的主要组成成分，同时也是壳聚糖和甲壳素的主要组成成分。

氨基葡萄糖及其衍生物应用十分广泛，在医药、食品、化妆品等领域均具有重要用途。在医药工业方面，氨基葡萄糖硫酸盐能通过刺激软骨蛋白聚糖的生物合成从而作为治疗抗风湿性关节炎的原料药；在食品工业方面，氨基葡萄糖具有吸收体内自由基、抗衰老、促进减肥、抑菌及调节人体内分泌等多种生理功能，被用于食品添加剂和保健食品的生产中；在化妆品工业方面，乙酰氨基葡萄糖是透明质酸的单体，是高档化妆品中不可缺少的一种物质。

目前，主要有两种生产氨基葡萄糖的方法：（1）甲壳素水解法，包括甲壳素酸水解法和甲壳素酶水解法。其中，甲壳素酸水解法是最常用的氨基葡萄糖生产方法，该方法首先用高浓度盐酸水解几丁质得到乙酰氨基葡萄糖，然后将乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基得到氨基葡萄糖。然而该生产方法易受原料供应的影响，酸处理产生的废水也会对环境造成污染，此外一些对虾蟹原料过敏的人群在食用该方法制备的氨基葡萄糖后会出现过敏反应。甲壳素酶水解法以甲壳素为原料，在甲壳素酶的作用下水解反应生成氨基葡萄糖单体，该方法虽然对环境污染较小，但同样受到原料供应、生产效率、致过敏反应等因素的限制。（2）微生物发酵法，该方法通过代谢工程手段改造获得大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等基因工程菌株，以葡萄糖、淀粉等为原料生产氨基葡萄糖。该方法虽然具不受原料来源限制、生产效率较高、环境污染较小等优点，但也存在微生物代谢途径改造难度较高、工程菌遗传稳定性难以控制、易产生代谢副产物等缺点。由此，急切需要开发低成本、低污染、高效率生产制备氨基葡萄糖的新方法。

发明内容

本发明的目的是针现现有生产制备氨基葡萄糖方法的不足，提供一种新颖的利用生物酶通过体外催化达到生产制备氨基葡萄糖的方法。该方法具有原料廉价、生产成本低、生产效率较高、环境友好、对人体安全等优点。

本发明的目的是通过如下技术方案来实现：

本发明提供了一种生物酶催化制备氨基葡萄糖的方法，该方法以D-葡萄糖为原料利用生物酶通过体外催化实现制备氨基葡萄糖，包括：采用葡萄糖异构酶（glucoseisomerase，GI）或称木糖异构酶（xylose isomerase，XI）催化，将D-葡萄糖转化为D-果糖；以及采用转氨酶（transaminase，TA）、氨基供体化合物和弱氧化剂化合物将D-果糖转化为氨基葡萄糖。

根据本发明，所述方法包括将D-葡萄糖转化为D-果糖的反应步骤，该步骤采用葡萄糖异构酶或称木糖异构酶催化，该酶能将D-葡萄糖、D-木糖、D-核糖等醛糖异构化为相应酮糖，葡萄糖异构酶或称木糖异构酶可以来源于橄榄色链霉菌（

根据本发明，所述方法包括将D-果糖转化为氨基葡萄糖的反应步骤，该步骤采用转氨酶、氨基供体化合物和弱氧化剂化合物催化，转氨酶可以来源于短小芽孢杆菌（

根据本发明，所述催化反应在无添加NAD(H)和ATP的条件下进行。

本领域技术人员可以理解，本发明的方法所包括的上述步骤可以同时进行，例如可以在一个生物反应器或反应容器中进行。

本领域技术人员可以理解，本发明的方法所包括的上述步骤也可以分步进行，例如可以在一个生物反应器或反应容器中进行或在串联布置的多个生物反应器或反应容器中进行。

根据本发明，催化反应的温度为20-70℃，优选为30-37℃。

根据本发明，催化反应的pH为4.0-9.0，优选为pH6.7-7.5。

根据本发明，上述步骤同时进行时，催化反应时间为1-48h，优选为20-24h。

根据本发明，上述步骤分步进行时，各步骤催化反应时间彼此独立进行为1-15小时，优选为6-8h。

根据本发明，反应体系中底物葡萄糖的浓度为1-200g/L，优选为8-35g/L。

根据本发明，反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为0.1-20U/mL，优选为3-8U/mL；

根据本发明，反应体系中转氨酶的浓度为0.1-20U/mL，优选为3-8U/mL。

根据本发明，反应体系中辅因子磷酸吡哆醛(PLP)的浓度为0.1-2mM，优选为0.8-1.2mM；

根据本发明，反应体系中氨基供体的浓度为0.1-3mM，优选为1.0-2.5mM；

根据本发明，反应体系中弱氧化剂的浓度为0.5-20mM，优选为8-12mM。

根据本发明，上述反应体系中还含有缓冲液。本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。反应体系中缓冲液的浓度为20～300mM，优选为80-150mM。

根据本发明，在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：

本发明是利用生物酶通过体外催化D-葡萄糖实现制备氨基葡萄糖的方法，初始原料为D-葡萄糖或D-果糖，价格便宜，所需的葡萄糖异构酶和转氨酶可通过构建大肠杆菌基因工程表达菌，然后利用发酵大量制备获得，相对易得和廉价。本发明提供的方法为“一锅法”催化，底物和酶加入后开始反应，反应结束后直接得到终产物氨基葡萄糖。与现有其他生产制备方法相比，本发明提供的氨基葡萄糖的生物酶制备方法具有原料廉价、生产成本低、环境友好、对人体安全等优点，适宜推广。

具体实施方案

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品或者可以通过已知方法制备。

本发明实施例中使用的部分材料信息如下：

pColdII质粒（Takara，Dalian，China）；

大肠杆菌克隆菌株

大肠杆菌表达菌株

实施例1，含葡萄糖异构酶基因和转氨酶基因的工程表达菌株构建

根据橄榄色链霉菌（

实施例2，葡萄糖异构酶和转氨酶的重组表达制备

1)种子培养：将斜面保存的重组菌株

2)发酵培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种到含30μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37℃下培养至OD

实施例3，利用葡萄糖异构酶和转氨酶催化制备氨基葡萄糖

取实施例2制备的来源于橄榄色链霉菌（

实施例4，利用葡萄糖异构酶和转氨酶催化制备氨基葡萄糖

取实施例2制备的来源于凝结芽孢杆菌（

实施例5，利用葡萄糖异构酶和转氨酶催化制备氨基葡萄糖

取实施例2制备的来源树枝状黄杆菌（

实施例6，利用葡萄糖异构酶和转氨酶催化制备氨基葡萄糖

取实施例2制备的来源于橄榄色链霉菌（

实施例7，氨基葡萄糖制备盐酸氨基葡萄糖：

向实施例3制得的氨基葡萄糖水溶液中，加入等摩尔或摩尔过量盐酸，进行成盐反应1小时。然后冻干或减压浓缩除水，冷却，加入沉淀剂结晶，结晶完成后，进行固液分离，固体干燥，得到盐酸氨基葡萄糖。

实施例8，氨基葡萄糖制备硫酸氨基葡萄糖:

向实施例4制得的氨基葡萄糖水溶液中，加入等摩尔或摩尔过量硫酸，进行成盐反应1小时。然后冻干或减压浓缩除水，冷却，加入沉淀剂结晶，结晶完成后，进行固液分离，固体干燥，得到硫酸氨基葡萄糖。

实施例9，氨基葡萄糖制备硫酸氨基葡萄糖氯化钾复合盐：

向实施例5制得的氨基葡萄糖水溶液中，加入等摩尔或摩尔过量硫酸，进行成盐反应1小时。反应完成后，加入等摩尔氯化钾，在35℃-45条件下，络合反应1小时。然后冻干或减压浓缩除水，冷却，加入沉淀剂结晶，结晶完成后，进行固液分离，固体干燥，得到硫酸氨基葡萄糖氯化钾复合盐。

实施例10，氨基葡萄糖制备硫酸氨基葡萄糖氯化钠复合盐:

向实施例6制得的氨基葡萄糖水溶液中，加入等摩尔或摩尔过量硫酸，进行成盐反应1小时。反应完成后，加入等摩尔氯化钠，在35℃-45条件下，络合反应1小时。然后冻干或减压浓缩除水，冷却，加入沉淀剂结晶，结晶完成后，进行固液分离，固体干燥，得到硫酸氨基葡萄糖氯化钠复合盐。

实施例11，氨基葡萄糖制备硫酸氨基葡萄糖氯化钙复合盐:

向实施例3制得的氨基葡萄糖水溶液中，加入等摩尔或摩尔过量硫酸，进行成盐反应1小时。反应完成后，加入等摩尔氯化钙，在35℃-45条件下，络合反应1小时。然后冻干或减压浓缩除水，冷却，加入沉淀剂结晶，结晶完成后，进行固液分离，固体干燥，得到硫酸氨基葡萄糖氯化钙复合盐。

实施例12，氨基葡萄糖制备磷酸氨基葡萄糖：

向实施例4制得的在氨基葡萄糖水溶液中，加入等摩尔或摩尔过量磷酸，进行成盐反应1小时。然后冻干或减压浓缩除水，冷却，加入沉淀剂结晶，结晶完成后，进行固液分离，固体干燥，得到磷酸氨基葡萄糖。

实施例13，氨基葡萄糖制备乙酰氨基葡萄糖：

向实施例5制得的氨基葡萄糖水溶液或混合溶剂中，加入适量催化剂，再等摩尔或摩尔过量乙酸酐，进行酰化反应，反应完成后。浓缩除去部分溶剂，进行结晶，结晶完成后，分离，洗涤，干燥，得到乙酰氨基葡萄糖。

实施例14，氨基葡萄糖制备乙酰氨基葡萄糖：

向实施例6制得的氨基葡萄糖水溶液或混合溶剂中，加入适量催化剂，再等摩尔或摩尔过量乙酰氯，进行酰化反应，反应4-6小时，反应完成后。浓缩除去部分溶剂，进行结晶，结晶完成后，分离，洗涤，干燥，得到乙酰氨基葡萄糖。

实施例15，一种生物酶催化制备氨基葡萄糖的方法：

先按照实施例2所述方法制得葡萄糖异构酶和转氨酶。

制备氨基葡萄糖的方法方法如下：采用来源于橄榄色链霉菌（

上述方法中：

氨基供体化合物为D-丙氨酸；所述的弱氧化剂化合物为亚磷酸盐。催化反应的温度为30℃；催化反应的pH为6.7。两个催化步骤同时进行，催化反应时间为20h；反应体系中底物葡萄糖的浓度为8g/L；反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为3U/mL；反应体系中转氨酶的浓度为3U/mL。反应体系中还含有辅因子磷酸吡哆醛，其浓度为0.8mM。氨基供体化合物的浓度为1.0mM；弱氧化剂化合物的浓度为8mM。反应体系中还含有缓冲液，缓冲液为HEPES缓冲液，其浓度为80mM。反应完成后，所得氨基葡萄糖的浓度为7.3g/L，转化率为76％。

实施例16，一种生物酶催化制备氨基葡萄糖的方法：

先按照实施例2所述方法制得葡萄糖异构酶和转氨酶。

制备氨基葡萄糖的方法方法如下：采用来源于来源于橄榄色链霉菌（

上述方法中：

氨基供体化合物为异丙胺；所述的弱氧化剂化合物为有机过氧酸。催化反应的温度为-37℃；催化反应的pH为7.5。两个催化步骤同时进行时，催化反应时间为24h；反应体系中底物葡萄糖的浓度为35g/L；反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为8U/mL；反应体系中转氨酶的浓度为8U/mL。反应体系中还含有辅因子磷酸吡哆醛，其浓度为1.2mM。氨基供体化合物的浓度为2.5mM；弱氧化剂化合物的浓度为12mM。反应体系中还含有缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，缓冲液浓度为150mM。反应完成后，所得氨基葡萄糖的浓度为7.5g/L，转化率为77％。

实施例17，一种生物酶催化制备氨基葡萄糖的方法：

先按照实施例2所述方法制得葡萄糖异构酶和转氨酶。

制备氨基葡萄糖的方法方法如下：采用来源于来源于凝结芽孢杆菌（

氨基供体化合物为叔丁胺；所述的弱氧化剂化合物为氧化铜。催化反应的温度为35℃；催化反应的pH为7.2。两个催化步骤分步进行，各步骤催化反应时间彼此独立进行为6h。反应体系中底物葡萄糖的浓度为25g/L；反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为5U/mL；反应体系中转氨酶的浓度为6U/mL。反应体系中还含有辅因子磷酸吡哆醛，其浓度为1.0mM。氨基供体化合物的浓度为1.5mM；弱氧化剂化合物的浓度为10mM。反应体系中还含有缓冲液，缓冲液为MOPS缓冲液，缓冲液浓度为120mM。反应完成后，所得氨基葡萄糖的浓度为7.8g/L，转化率为79％。

实施例14，一种生物酶催化制备氨基葡萄糖的方法：

先按照实施例2所述方法制得葡萄糖异构酶和转氨酶。

制备氨基葡萄糖的方法方法如下：采用来源于树枝状黄杆菌（

上述方法中：

氨基供体化合物为苯乙氨；所述的弱氧化剂化合物为亚磷酸盐。催化反应的温度为35℃；催化反应的pH为7.0。两个催化步骤分步进行，各步骤催化反应时间彼此独立进行为8h。反应体系中底物葡萄糖的浓度为25g/L；反应体系中葡萄糖异构酶的浓度为6U/mL；反应体系中转氨酶的浓度为5U/mL。反应体系中还含有辅因子磷酸吡哆醛，其浓度为1.2mM。氨基供体化合物的浓度为2.0mM；弱氧化剂化合物的浓度为11mM。反应体系中还含有缓冲液，缓冲液为柠檬酸盐缓冲液，缓冲液浓度为110mM。反应完成后，所得氨基葡萄糖的浓度为8.0g/L，转化率为80％。