一种酶活提高的NADH脱氢酶突变体SlNOX及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酶活提高的NADH脱氢酶突变体SlNOX及其应用。

背景技术

线粒体呼吸链膜蛋白复合物I（complex I），又称为NADH脱氢酶，是线粒体呼吸链电子传递系统的主要入口，在绝大多数真核生物中是一个很复杂的线粒体电子呼吸链元件，在糖酵解、糖异生、三羧酸循环以及呼吸链中发挥着不可替代的作用。其中间产物通过脱氢，使NAD

发明内容

本发明的第一个目的是提供NADH脱氢酶的突变体SlNOX

本发明的第二个目的是提供编码上述突变体SlNOX

本发明的第三个目的是提供一种含有编码突变体SlNOX

优选，所述的表达质粒是表达载体pET28a（+）。

本发明的第四个目的是提供一种含有上述重组表达质粒的宿主表达细胞。

优选，所述的宿主表达细胞是大肠杆菌。

本发明的第五个目的是突变体SlNOX

本发明的第六个目的是提供一种获得突变体SlNOX

（1）以

（2）以

（3）以所述第一PCR产物和第二PCR产物为模板，以SEQ ID NO .4~5所示序列为引物进行PCR，得到含酶切位点的突变体SlNOX

优选，所述的步骤（1）-（3）中的PCR程序为：98℃预变性3 min；98℃变性10s、60℃退火20 s、72℃延伸60 s，35个循环；72℃延伸5 min。

本发明提供了一种NADH脱氢酶的突变体SlNOX

附图说明

图1是实施例中SlNOX-His及其突变体SlNOX

图2是实施例中分光光度法测定酶活对比图（a和b表示两组酶活测定值有显著性差异，

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本发明的NADH脱氢酶的突变体SlNOX

下面详述本发明构建NADH脱氢酶的突变体SlNOX

实施例1

NADH脱氢酶的突变体SlNOX

1、样品：所选用的番茄品种是为AC（

2、

通过常规的热硼酸法对番茄果实中总RNA进行提取，将提取的总RNA按照试剂盒PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time，RR036A，TaKara）提供的方法将RNA反转录成cDNA，反应体系：X μL RNA(<500ng)、2 μL 5×Mix、Y μL RNase Free water混匀，使总体积为10 μL，然后放在37℃恒温水浴锅中水浴15 min，85℃金属浴热激5 s，4℃冷却即可。

根据番茄基因组(https://solgenomics.net/tools/blast)中

表1克隆

以番茄cDNA为模板，先分别用含酶切位点的上游引物（SEQ ID NO.4）与含突变位点的下游引物（SEQ ID NO.7）进行PCR得到产物1，然后用含突变位点的上游引物（SEQ IDNO.6）与含酶切位点的下游引物（SEQ ID NO.5）进行PCR得到产物2，然后以产物1和产物2为模板，以含酶切位点的上、下游引物进行PCR得到含酶切位点的突变体

以番茄cDNA为模板，用含酶切位点的上游引物（SEQ ID NO.4）和下游引物（（SEQID NO.5）进行PCR扩增获得

PCR条件为：98℃预变性3 min，然后进行35个循环(98℃变性10s、60℃退火20s、72℃延伸60s)，72℃延伸5 min。PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

3、SlNOX表达菌株的构建

分别将

4、SlNOX-His和SlNOX

（1）原核表达

分别将SlNOX和SlNOX

（2）蛋白纯化

先加入无菌水将菌体悬浮，4℃ 6 000g离心10 min除去培养基，然后加入适量体积的蛋白提取液（20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，pH 7.5）将菌体悬浮，根据菌液体积按1：1000加入Triton-100以提高蛋白的提取效率。充分悬浮菌体后，利用低温超高压连续流细胞破碎机将菌体破碎1 h（超声30 s，停30 s），超声期间要将盛有菌液的容器要保持充分冰浴，以免超声过程中探头发热导致蛋白活性降低。超声破碎完毕后加入终浓度为1 mM的PMSF抑制蛋白降解。4℃ 9 000g离心30 min，将上清液过膜（0.45 μm），然后将已用蛋白提取液平衡好的Ni NTASuperflow Cartridges（QIAGEN）加入到蛋白溶液中，最后加入终浓度为10 mM的咪唑，于4℃低温使蛋白与填料旋转结合2 h以上。

先将静置后的蛋白上清液流过镍柱，最后将填料也一并转移到镍柱中，当上清液全部流过镍柱后，加入40 mM咪唑（含20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，pH 7.5）洗杂蛋白，直至流下的溶液用考马斯亮蓝G250（碧云天）检测无蛋白为止。然后用250 mM咪唑（含20 mMTris-HCl，500 mM NaCl，pH 7.5）洗脱目标蛋白。由于咪唑对蛋白活性有影响，因此要及时将收集的目标蛋白液用50 mM pH7的磷酸钾缓冲液通过Sephadex G-25脱盐柱（GE）)离心（4℃，4 000 g）将蛋白中咪唑置换掉。最后将纯化后的目标蛋白保存在-80℃超低温冰箱，留取部分纯化好的蛋白与未纯化的蛋白进行跑胶检测，由此得到SlNOX-His及其突变体SlNOX

5.采用分光光度法对蛋白活性进行检测。选用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒测定SlNOX-His及其突变体SlNOX

NOX（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr

结果如图2所示，从图2可以看出突变体SlNOX

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院华南植物园

<120> 一种酶活提高的NADH脱氢酶突变体SlNOX及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 690

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 1

atggccgcta tattagctcg caagtctcta tctgctcttc gttctcgtca gcttgtttta 60

gcaggacaag catggcaagg gactaataca cctaatggaa ctctgcttgg tactcgatca 120

tttgctacca aacattcatt ttcaactgac aaagatgatg aggaaagaga gcagctagca 180

aaggagctat caaaagattg gaattcagtc tttgagcgaa gcataaatac tctctttttg 240

actgaaatgg ttcgaggtct gatgctgacg ctcaagtact tctttgaaaa gaaagtgact 300

attaactatc catttgaaaa gggtccttta agccctcgtt ttcgtggaga acatgccctt 360

cgacgttatg ccacaggaga ggaaagatgc attgcatgta aactttgtga agctatttgc 420

cctgctcaag ctatcacaat cgaggctgag gagcgagaag atggcagtcg tcgaacaact 480

aggtatgata tcgatatgac aaagtgcatc tactgtggat tctgccaaga agcctgccct 540

gttgatgcca ttgttgaggg gcccaacttt gagtttgcaa ctgaaactca tgaggaactt 600

ctttatgaca aggagaagct tcttgagaat ggagatagat gggaaactga gattgcagag 660

aatctgagat ctgaaagcct ctatcgctga 690

<210> 2

<211> 229

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 2

Met Ala Ala Ile Leu Ala Arg Lys Ser Leu Ser Ala Leu Arg Ser Arg

1 5 10 15

Gln Leu Val Leu Ala Gly Gln Ala Trp Gln Gly Thr Asn Thr Pro Asn

20 25 30

Gly Thr Leu Leu Gly Thr Arg Ser Phe Ala Thr Lys His Ser Phe Ser

35 40 45

Thr Asp Lys Asp Asp Glu Glu Arg Glu Gln Leu Ala Lys Glu Leu Ser

50 55 60

Lys Asp Trp Asn Ser Val Phe Glu Arg Ser Ile Asn Thr Leu Phe Leu

65 70 75 80

Thr Glu Met Val Arg Gly Leu Met Leu Thr Leu Lys Tyr Phe Phe Glu

85 90 95

Lys Lys Val Thr Ile Asn Tyr Pro Phe Glu Lys Gly Pro Leu Ser Pro

100 105 110

Arg Phe Arg Gly Glu His Ala Leu Arg Arg Tyr Ala Thr Gly Glu Glu

115 120 125

Arg Cys Ile Ala Cys Lys Leu Cys Glu Ala Ile Cys Pro Ala Gln Ala

130 135 140

Ile Thr Ile Glu Ala Glu Glu Arg Glu Asp Gly Ser Arg Arg Thr Thr

145 150 155 160

Arg Tyr Asp Ile Asp Met Thr Lys Cys Ile Tyr Cys Gly Phe Cys Gln

165 170 175

Glu Ala Cys Pro Val Asp Ala Ile Val Glu Gly Pro Asn Phe Glu Phe

180 185 190

Ala Thr Glu Thr His Glu Glu Leu Leu Tyr Asp Lys Glu Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Asn Gly Asp Arg Trp Glu Thr Glu Ile Ala Glu Asn Leu Arg Ser

210 215 220

Glu Ser Leu Tyr Arg

225

<210> 3

<211> 229

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 3

Met Ala Ala Ile Leu Ala Arg Lys Ser Leu Ser Ala Leu Arg Ser Arg

1 5 10 15

Gln Leu Val Leu Ala Gly Gln Ala Trp Gln Gly Thr Asn Thr Pro Asn

20 25 30

Gly Thr Leu Leu Gly Thr Arg Ser Phe Ala Thr Lys His Ser Phe Ser

35 40 45

Thr Asp Lys Asp Asp Glu Glu Arg Glu Gln Leu Ala Lys Glu Leu Ser

50 55 60

Lys Asp Trp Asn Ser Val Phe Glu Arg Ser Ile Asn Thr Leu Phe Leu

65 70 75 80

Thr Glu Met Val Arg Gly Leu Met Leu Thr Leu Lys Tyr Phe Phe Glu

85 90 95

Lys Lys Val Thr Ile Asn Tyr Pro Phe Glu Lys Gly Pro Leu Ser Pro

100 105 110

Arg Phe Arg Gly Glu His Ala Leu Arg Arg Tyr Ala Thr Gly Glu Glu

115 120 125

Arg Cys Ile Ala Cys Lys Leu Cys Glu Ala Ile Cys Pro Ala Gln Ala

130 135 140

Ile Thr Ile Glu Ala Glu Glu Arg Glu Asp Gly Ser Arg Arg Thr Thr

145 150 155 160

Ala Tyr Asp Ile Asp Met Thr Lys Cys Ile Tyr Cys Gly Phe Cys Gln

165 170 175

Glu Ala Cys Pro Val Asp Ala Ile Val Glu Gly Pro Asn Phe Glu Phe

180 185 190

Ala Thr Glu Thr His Glu Glu Leu Leu Tyr Asp Lys Glu Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Asn Gly Asp Arg Trp Glu Thr Glu Ile Ala Glu Asn Leu Arg Ser

210 215 220

Glu Ser Leu Tyr Arg

225

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgcgcggca gccatatggc cgctatatta gctcgcaagt 40

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtcatgcta gccatatgtc agcgatagag gctttcagat ctc 43

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctgaacaac tgcgtatgat atcgatatga c 31

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtcatatcga tatcatacgc agttgttcga c 31